金建祥，王波定，陳茂送，王洪財，馬磊，馮寬

腦膠質瘤是常見的原發(fā)性腦腫瘤，臨床預后差[1]。雖外科手術、放射療法和化學療法的治療取得了進展，但是惡性神經(jīng)膠質瘤的預后仍然非常差。盡管WHO 分類可以作為預測患者臨床結局的標準，但最近的研究表明，僅憑該標準可能不足以估計患者的預后。因此確定新的潛在生物標志物，以進行早期診斷、預后預測以及新的治療靶標至關重要。PLOD3 已被提議作為人類H460 細胞放射抗性的生物標志物[2]；哺乳動物大腫瘤抑制激酶1（LATS1）低表達可導致星形細胞瘤、乳腺癌、結腸直腸癌發(fā)生[3]，可能是人類癌癥類型中重要的腫瘤抑制因子。目前關于PLOD3 與LATS1 在人腦膠質瘤中的表達的研究報道較少，因此本研究擬探討PLOD3 與LATS1 在人腦膠質瘤中的表達水平及與臨床病理特征、預后的相關性，為腦膠質瘤的診斷治療提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集寧波市醫(yī)療中心李惠利醫(yī)院2015 年1 月至2016 年3 月行手術治療的星形細胞神經(jīng)膠質瘤94例為病例組。納入標準：（1）符合《中國膠質瘤規(guī)范化治療現(xiàn)狀》[4]；（2）術后經(jīng)病理學證實；（3）患者或家屬均已提供書面知情同意書。排除標準：（1）合并其他部位腫瘤；（2）臨床及隨訪資料不完整。另收集除惡性腫瘤以外的其他原因（如腦外傷、需要進行減壓治療的嚴重的顱腦損傷）49 例的腦組織標本為對照組。病例組男58 例，女36 例；年齡42 ～69 歲，平均（59.3±8.5）歲；卡諾夫斯基性能評分（KPS）≤70 分25 例，＞70 分69 例；WHO 等級Ⅰ級12 例，Ⅱ級46 例，Ⅲ級28 例，Ⅳ級8 例。對照組男31 例，女18例；年齡40 ～68 歲，平均（59.4±8.0）歲；KPS評分≤70 分14 例，＞70 分35 例。本研究獲本院倫理委員會批準，所有相關患者或家屬均已提供書面知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化及判定標準 將標本固定在Bouin溶液（美國Sigma-Aldrich，批號：WS-52636.3）中1 h，用磷酸鹽緩沖液沖洗，后用70%、80%、95%和100%的乙醇梯度脫水，包埋切成片。將切片在檸檬酸抗原回收溶液中在濕度箱（中國河南遠通化工有限公司）中處理60 min。加入小鼠抗PLOD3、LATS1 多克隆抗體（1∶1 000、1∶2 000，美國Santa Cruz Biotechnology，目 錄 號 sc-17320、69653），并在4℃下孵育過夜。使用抗生物素蛋白-生物素-過氧化物酶技術，并以3，3’-二氨基聯(lián)苯胺（丹麥Dako Denmark，批號：SW-56963）作為發(fā)色劑，蘇木精復染。使用Eclipse 80i 顯微鏡（日本Nikon Corporation；放大倍數(shù)，×400）在3 個隨機選擇的高倍視野中，通過計數(shù)除PLOD3、LATS1 陽性染色的細胞核之外的所有細胞核，確定 PLOD3、LATS1 陽性細胞的比例。0 ～10%、10%～30%、30%～70%和＞70%的PLOD3、LATS1 陽性細胞得分分別為－、1+、2+和3+。（－）表示PLOD3、LATS1 陰性表達，得分1+、2+和3+表示陽性表達。

1.2.2 隨訪 病例組術后每3 個月通過電話訪問和問卷調查信更新隨訪信息，從最初的手術日期到死亡計算總生存時間。

1.3 統(tǒng)計方法 采用SPSS 23.0 統(tǒng)計軟件進行分析，計數(shù)資料比較采用2檢驗或Fisher 精確檢驗比較，使用Kaplan-Meier 生存曲線和Cox 回歸模型進行生存分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組PLOD3、LATS1 蛋白表達比較 病例組PLOD3 蛋白表達陽性率高于對照組，LATS1 蛋白表達陽性率低于對照組（均P ＜0.05），見表1。

表1 兩組PLOD3、LATS1 蛋白表達陽性率比較 例（%）

2.2 PLOD3、LATS1蛋白表達與腦膠質瘤臨床病理特征的關系 PLOD3、LATS1 蛋白表達與腫瘤最大徑、TNM分期、浸潤深度、病理級別、淋巴結轉移及復發(fā)相關，且腫瘤最大徑≥5 cm、TNM分期越高、浸潤深度越深、病理級別越高、淋巴結轉移及復發(fā)患者PLOD3 陽性表達率越高，LATS1 蛋白陽性表達率越低（2≥9.548，均P ＜0.05），見表2。

表2 PLOD3L、LATS1 蛋白表達與腦膠質瘤臨床病理特征的關系 例（%）

2.3 腦膠質瘤患者預后情況 94 例自出院后至隨訪結束存活4 ～72 個月，5年生存率為27.6%（26/94）。PLOD3 陽性和陰性患者5 年總生存率分別為2.94%（2/68）和92.39%（24/26），而LATS1 陽性和陰性患者5 年總生存率分別為55.56%（20/36）和10.34%（6/58）。PLOD3、LATS1 陽性和陰性患者5 年總生存率差異均有統(tǒng)計學意義（2=75.075、22.691，均P ＜0.05）。

2.4 影響腦膠質瘤患者預后單因素分析 腫瘤最大徑≥5 cm、TNM 分期Ⅲ～Ⅳ、浸潤深度浸潤≥6 cm、有淋巴血管浸潤、病理級別高、有復發(fā)、PLOD3 陽性及LATS1 陰性患者5 年生存率均顯著降低（均P ＜0.05），見表3。

表3 影響腦膠質瘤患者預后單因素分析 例（%）

2.5 腦膠質瘤患者預后影響因素多因素Cox 回歸分析 Cox 回歸分析顯示，TNM 分期Ⅲ～Ⅳ期、病理級別高、PLOD3 表達陽性、LATS1 表達陰性是腦膠質瘤患者預后獨立危險因素（均P ＜0.05），見表4。

表4 腦膠質瘤患者預后影響因素多因素Cox 回歸分析

3 討論

PLOD是細胞內(nèi)膜結合同型二聚體蛋白的一個家族，其中PLOD3 具有膠原半乳糖基轉移酶和葡糖基轉移酶的活性[5]。已經(jīng)在肝癌、乳腺癌和子宮內(nèi)膜間質肉瘤等人類癌癥中發(fā)現(xiàn)PLOD3 表達升高[6]。本研究發(fā)現(xiàn)PLOD3 在神經(jīng)膠質瘤組織中過表達，且腫瘤最大徑≥5 cm、TNM 分期越高、浸潤深度越深、病理級別越高、淋巴結轉移及復發(fā)患者PLOD3陽性表達率越高。因此，PLOD3 過表達可能會導致神經(jīng)膠質瘤生長，增強局部細胞侵襲和轉移，并調節(jié)細胞分化。同時，本文針對患者預后進行分析，結果顯示PLOD3 表達陽性是腦膠質瘤患者預后獨立危險因素（P ＜0.05），這說明PLOD3 過度表達是神經(jīng)膠質瘤患者的預后不良因素。

LATS1可能在早期有絲分裂中與細胞周期蛋白依賴性激酶1 形成復合物，從而降低H1 組蛋白激酶活性，具有細胞周期抑制劑作用。敲除LATS1 可抑制小鼠肉瘤、卵巢腫瘤進展，這表明LATS1可能起抑癌作用[7]。臨床研究表明LATS1在45%的宮頸癌組織標本中表達下調，LATS1 下調與晚期宮頸癌TNM 分期和腫瘤狀態(tài)呈正相關，表明LATS1 喪失與宮頸癌的進展有關[8]。本研究中，LATS1在神經(jīng)膠質瘤組織中表達降低，且PLOD3陽性表達與腫瘤最大徑、TNM分期、浸潤深度、病理級別、淋巴結轉移及復發(fā)呈負相關，提示LATS1 是神經(jīng)膠質瘤的抑癌基因。在宮頸癌中，促進LATS1表達可調節(jié)細胞活力、增殖、遷移、集落形成，細胞周期分布和腫瘤生長[9]。本研究結果顯示LATS1 陰性患者5 年生存率均顯著縮短，LATS1 表達陰性是影響腦膠質瘤患者預后的獨立危險因素，這與上述討論一致，再次說明LATS1 低表達是膠質瘤患者的預后不良因素。

綜上所述，人腦膠質瘤中PLOD3 表達升高，LATS1 表達降低；PLOD3、LATS1表達與腦膠質瘤患者臨床病理特征相關；PLOD3 高表達、LATS1 低表達是神經(jīng)膠質瘤患者的預后不良因素。