萬菁，陳紅，奚經(jīng)巧，郭躍麗

原發(fā)性腎病綜合征（PNS）是一種腎小球基底膜通透性增高的慢性腎病，其在兒童和成人中都很常見[1]。PNS 的病因尚未被完全闡明。腎活檢是判斷病理類型和預后的“金標準”，但它是一種有創(chuàng)操作，具有潛在風險。目前，尚缺乏理想的生物標志物用于PNS的診斷、激素治療效果和預后預測[2]。miRNA 作為疾病的新分子標志物得到廣泛關注，但其在PNS的應用研究仍處于起步階段[3]。本研究擬探索血清miR-30a-5p表達與PNS患者臨床特征、激素治療效果的相關性，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019 年2―11 月于浙江中醫(yī)藥大學附屬溫州中醫(yī)院腎臟病科就診的160 例特發(fā)性PNS 患者作為試驗組。采用1︰1 匹配法另選同期來本院體檢的健康者160 例作為對照組。本研究的實施已獲得本院倫理委員會的批準。

1.2 納入與排除標準 納入標準：（1）符合PNS的診斷標準[4]；（2）年齡18～65歲；（3）血清肌酐（Scr）＜176.8 mmol/L。排除標準：（1）繼發(fā)性和遺傳性腎??；（2）合并嚴重的心、腦、肝等疾?。唬?）妊娠期、吸吮期婦女；（4）有精神異常，不配合治療。

1.3 治療方法 PNS 患者都接受激素治療和輔助治療（包括環(huán)磷酰胺、環(huán)孢素或霉酚酸酯）。患者均予足量潑尼松（按照體質(zhì)量劑量，1.0mg·kg－1·d－1）治療，連續(xù)口服8 周，部分患者可根據(jù)病理類型延長至12 周。按照療效分為激素抵抗腎病綜合征（SRNS）組（治療至少12周后蛋白尿仍＞3.5 g/d或尿蛋白較基礎值下降＜50%，血漿白蛋白＜30 g/L）和非SRNS 組[包括完全緩解（尿蛋白＜0.2g/d，血漿白蛋白＞35g/L）和部分緩解（尿蛋白0.2 ～2.0g/d 或尿蛋白0.2 ～3.5 g/d 尿蛋白較基礎值下降＞50%）]。

1.4 觀察指標 比較兩組性別，年齡，吸煙、飲酒情況，體質(zhì)量指數(shù)（BMI），糖尿病史，空腹血糖，血脂，Scr，肝腎功能，血尿素氮（BUN），24 h尿蛋白定量，血清和尿液miR-30a-5p 表達水平等。

1.4.1 實驗室測量 采集受試者清晨空腹肘部靜脈血3 ml，采用氣相色譜-丙基乙二胺薄層色譜定Scr，溴甲酚綠法測定血清白蛋白、肝腎功能、血脂，采用全自動生化分析儀（型號：7600，采用日立公司）檢測尿蛋白和24 h 蛋白排泄水平。1.4.2 血清miR-30a-5p 表達水平

1.4.2.1 血清RNA 提取 常溫下解凍樣本，取血清樣本100 l 按Trizol 試劑（美國Invitmgen）和miRNeasy mini kit（美國QIAGEN 公司）說明書提取總RNA。外光分光光度計（NanoDrop 2000）鑒定血漿總RNA 濃度和純度，變性凝膠電泳法檢測RNA 完整性，放入－80℃低溫冰箱留存待用。

1.4.2.2 miR-30a-5p 檢測 使用 mi-ScriptⅡ反轉(zhuǎn)錄試劑盒將1 g RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用miScript SYBR Green PCR 試劑盒，以U6 為RNA 內(nèi)參，采用qPCR 檢測血清miR-30a-5p 表達水平，反應條件參照試劑盒說明書設置。m iR-3 0 a-5 p：5’-G A A G G U C AGCUCCUACAAAUGU-3’，72 bp；U6：5’-ACGCAAATTCGTGAAGCGTT-3’，94 bp。miR-30a-5p 相對表達水平采用2－△△Ct法計算，實驗重復3 次。

1.5 隨訪 所有患者均隨訪1 年，每月隨訪1 次。收集PNS 患者的臨床信息，包括治療狀態(tài)、臨床癥狀、并發(fā)癥、BMI、血壓、肝腎功能、血脂、血尿、24 h尿蛋白定量及miR-30a-5p 表達。

1.6 統(tǒng)計方法 采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料以均數(shù)±標準差表示，采用 檢驗；計數(shù)資料比較采用2檢驗；危險因素分析采用多因素Logistic回歸分析；受試者工作特征（ROC）曲線分析miR-30a-5p 的診斷價值。P ＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組基線資料比較 兩組性別比、年齡、飲酒例數(shù)、糖尿病史、空腹血糖及高密度脂蛋白（HDL）等指標差異均無統(tǒng)計學意義（均P ＞0.05）。病例組吸煙例數(shù)、BMI、總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白（LDL）、-2MG、BUN 及Scr 均高于對照組（均P ＜0.05）。病例組血清miR-30a-5p 的表達水平高于對照組（P ＜0.05），兩組尿液中miR-30a-5p 的表達水平差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05），但由于miR-30a-5p在血清中的的差異更顯著，故僅選取血清miR-30a-5p 的表達水平作為隨訪研究指標。見表1。

表1 兩組基線資料比較

2.2 PNS 多因素回歸分析 BMI、TC、LDL、-2MG、miR-30a-5p 是PNS 的獨立危險因素（均P ＜0.05），見表2。

表2 PNS 的多因素Logistic 回歸分析

2.3 miR-30a-5p 對PNS 的診斷價值ROC曲線下面積為0.822，診斷特異性和敏感性分別為84.7%和89.6%，見圖1。

圖1 miR-30a-5p PNS 的ROC 曲線分析

2.4 PNS 患者血清miR-30a-5p 表達與激素治療效果的關系

2.4.1 激素治療敏感性與血清miR-30a-5p 表達水平的關系 治療前，激素耐藥組血清 miR-30a-5p 表達水平（9.165±0.876，n=55）高于激素敏感組（7.864±0.699，n=105），差異有統(tǒng)計學意義（t=10.229，P ＜0.05）；治療后，兩組miR-30a-5p 表達水平均有不同程度的下調(diào)（t耐藥組=21.298，t敏感組=14.250，均P ＜0.05），其中激素敏感組患者miR-30a-5p的表達水平（6.022±0.656）低于激素耐藥組（7.745±0.711），差異有統(tǒng)計學意義（t=15.328，P ＜0.05）。

2.4.2 影響PNS 預后的多因素分析TC、LDL、-2MG 和miR-30a-5p 是影響激素治療PNS 臨床療效的危險因素（均P ＜0.05），見表3。

表3 激素治療PNS 預后影響因素的多因素Logistic 回歸分析

3 討論

PNS 的診斷與預后預測相關的生物標志物研究是今年的研究熱點之一[5]。探尋可靠、穩(wěn)定和準確的方法來早期診斷本疾病，以便盡早采取正確的治療方法對疾病預后具有重要的臨床意義。已有越來越多的學者關注miRNA在腎病綜合征中的作用[6]。

miR-30a-5p是定位于人類6 號染色體的q13 位置，來源于部分內(nèi)含子的轉(zhuǎn)錄單元，其在多種疾病中產(chǎn)生作用。miR-30a-5p 能夠調(diào)節(jié)LIM-類同源盒因子Xlim1/Lhx1 并限制其活性，而Xlim1/Lhx1 是腎臟發(fā)育的一個重要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)者[7]。這提示miR-30a-5p 對足細胞乃至腎小球濾過功能至關重要。miR-30a-5p是小兒NS潛在的分子診斷指標，將血清或尿液miR-30a-5p與現(xiàn)有的生化指標聯(lián)合檢測，將有可能提高臨床對NS的診斷效能。但miR-30a-5p 在PNS 中具體的臨床價值未被闡明。

本研究顯示，PNS 患者血清中miR-30a-5p 的表達水平上調(diào)，與腎功能損傷和血脂指標有關。ROC 曲線分析發(fā)現(xiàn)，miR-30a-5p對腎病綜合征具有較強的診斷能力。筆者對患者進行為期1 年的跟蹤隨便和檢測，發(fā)現(xiàn)miR-30a-5p與PNS的激素治療預后密切相關，且其對PNS預后判定價值較高。這提示miR-30a-5p 為PNS 潛在的新分子標志物。

血清學標本易于收集且是生理狀態(tài)的良好信息記錄體。本研究發(fā)現(xiàn)血清中miR-30a-5p 的表達水平與PNS 的激素治療預后密切相關，且對PNS 診斷價值和預后判定價值較高。這提示miR-30a-5p 可作為PNS 診斷與預后預測的新生物標志物[8]。

本研究納入樣本量有限，且隨訪時間為1 年，樣本量及隨訪時間仍需增加。此外，本研究對激素治療的效果進行了跟蹤，沒有研究其他治療方法對PNS 的影響，也沒有涉及miR-30a-5 在PNS 中的作用機制。因此，需要進一步研究證實。