陳陽，任思思，范妤，郭東艷，李京濤，史曉燕，段麗芳

1 陜西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，陜西咸陽 712046；2 陜西省中藥基礎(chǔ)與新藥研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；3 陜西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝病科

肝纖維化是各種肝病必經(jīng)的病理過程，病毒性肝炎、酗酒、代謝性疾病、自身免疫性疾病和膽汁淤積性肝病等引起的肝臟持續(xù)性損害都可誘發(fā)肝纖維化的發(fā)生發(fā)展。有研究顯示，肝纖維化是誘發(fā)肝硬化甚至肝細(xì)胞癌的主要原因，約90% 的肝細(xì)胞癌是在肝纖維化或肝硬化的基礎(chǔ)上發(fā)展而來。近年來有報(bào)道認(rèn)為，逆轉(zhuǎn)肝纖維化有助于防止病情向肝硬化、肝癌惡化，而轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最有效的促纖維化細(xì)胞因子，且被認(rèn)為是肝、肺和腎臟纖維化反應(yīng)的主要中介因子，因此調(diào)控TGF-β1 的表達(dá)對(duì)肝纖維化的發(fā)生發(fā)展具有重要意義?，F(xiàn)就TGF-β1 在肝纖維化發(fā)生發(fā)展中機(jī)制的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 TGF-β1概述

TGF-β 家族由TGF-βs、活化素、抑制素、骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）等33個(gè)成員組成。其中TGF-βs 主要分為TGF-β1、TGF-β2 和TGF-β3 三種類型。這三種類型在細(xì)胞內(nèi)均合成為含潛伏期相關(guān)肽和成熟結(jié)構(gòu)域的前體前肽，合成的前體前肽不僅被分泌到細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）中，而且被儲(chǔ)存在一個(gè)無需新合成且能快速可用的TGF-β 池中［1］。當(dāng)機(jī)體受到相關(guān)作用時(shí)，前體前肽形式的TGF-β被切割，通過與靶細(xì)胞表面的特異性激酶受體結(jié)合形成信號(hào)激活其TGF-β的生物活性［2］。其中，TGF-βs中的TGF-β1具有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、傷口愈合等分子功能，并在肝纖維化發(fā)生發(fā)展的過程中發(fā)揮重要作用。

2 TGF-β1 通過參與ECM 的生成和降解促進(jìn)肝纖維化發(fā)生發(fā)展

ECM 主要來源于骨髓源性纖維細(xì)胞、門脈成纖維細(xì)胞、激活的肝星狀細(xì)胞（HSCs）、發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的肝細(xì)胞和發(fā)生EMT 的膽管細(xì)胞。正常肝臟中的ECM 處于生成和降解的平衡狀態(tài)。當(dāng)發(fā)生慢性肝損傷時(shí)，肝臟發(fā)生過度愈合使ECM 沉積過多而導(dǎo)致纖維瘢痕增生最終發(fā)生肝纖維化。通常，ECM 在肝體積中占比約10%，其主要組成成分有包埋其他基質(zhì)成分的糖胺多糖、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白聚糖，增加ECM 強(qiáng)度和韌性的膠原和彈性蛋白，使細(xì)胞與基質(zhì)結(jié)合的纖維連接蛋白、纖粘蛋白等［3］。研究顯示，在調(diào)節(jié)ECM 組成方面，TGF-β1 可通過上調(diào)纖維連接蛋白、膠原蛋白、整合素和基底膜蛋白（如層黏連蛋白、Ⅳ型膠原蛋白和巢蛋白）的表達(dá)使ECM 增多；在調(diào)節(jié)ECM 功能方面，TGF-β1 可在促進(jìn)傷口愈合反應(yīng)中誘導(dǎo)ECM 中含量較少的肌腱蛋白表達(dá)，該蛋白在正常肝組織中幾乎不表達(dá)，但在纖維化肝組織內(nèi)可促進(jìn)細(xì)胞的遷移和增殖［4］。

3 TGF-β1 通過參與多種細(xì)胞間的相互作用促進(jìn)肝纖維化發(fā)生發(fā)展

3.1 肝內(nèi)多種細(xì)胞分泌產(chǎn)生TGF-β1 研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1在肝臟的生理和病理過程中均發(fā)揮作用，它參與了肝臟損傷、炎癥、肝纖維化、肝硬化及肝癌進(jìn)展的全過程。在肝臟中，肝細(xì)胞、HSCs、肌成纖維細(xì)胞、枯否細(xì)胞、肝竇內(nèi)皮細(xì)胞和血小板等均可分泌TGF-β1［5-6］。分泌的TGF-β1 儲(chǔ)存在TGF-β 池中，當(dāng)肝臟受到損傷時(shí)，TGF-β 池前體前肽形式的TGF-β1被激活并促進(jìn)肝纖維化的產(chǎn)生。由于肝細(xì)胞是肝臟內(nèi)數(shù)量最多的實(shí)質(zhì)細(xì)胞，當(dāng)肝臟遭受持續(xù)性慢性損傷時(shí)，在肝纖維化初期，TGF-β1 主要來源于受損的肝細(xì)胞；在肝纖維化進(jìn)展期，TGF-β1 主要來源于HSCs，其次是枯否細(xì)胞；在肝纖維化階段后期或肝硬化期，TGF-β1主要來源于缺氧肝細(xì)胞［7-8］。

3.2 TGF-β1通過肝內(nèi)多種細(xì)胞間的相互作用促進(jìn)肝纖維化 在肝纖維化初期的發(fā)展中，TGF-β1和其他生長因子如表皮細(xì)胞生長因子首先將肝竇腔中的HSCs 擴(kuò)散開來，TGF-β1 刺激HSCs 進(jìn)一步遷移到ECM 累積的肝損傷區(qū)域，使肝纖維化進(jìn)程持續(xù)［4，8］。在肝纖維化初期到發(fā)生發(fā)展階段，由損傷的肝細(xì)胞分泌的TGF-β1 可激活HSCs 并促進(jìn)HSCs 向肌成纖維細(xì)胞方向轉(zhuǎn)化［8］，由肝血竇內(nèi)皮細(xì)胞、激活的血小板分泌的TGF-β1 可促進(jìn)HSCs 活化、增殖并合成分泌膠原［9］。研究發(fā)現(xiàn)，活化的HSCs 能夠分泌大量的ECM、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑（TIMPs）、血小板衍生因子（PDGF）等，共同參與促進(jìn)ECM 的生成和降解失衡，同時(shí)HSCs 還可分泌TGF-β1 以自分泌形式作用于HSCs、以旁分泌形式作用于其他細(xì)胞受體如肝細(xì)胞，進(jìn)一步增強(qiáng)HSCs的增殖、遷移和轉(zhuǎn)化能力，促進(jìn)肝纖維化的發(fā)生發(fā)展［5，9-10］。此外，活化狀態(tài)下的TGF-β1也能促進(jìn)肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞發(fā)生EMT，促進(jìn)其向肌成纖維細(xì)胞方向轉(zhuǎn)化而導(dǎo)致ECM 過度累積［10］。在肝纖維化發(fā)展過程中，枯否細(xì)胞在肝血竇腔變?yōu)橛巫叩木奘杉?xì)胞，與血液中單核分化而來的巨噬細(xì)胞一起共同在纖維化進(jìn)展中發(fā)揮雙邊作用。這兩種來源的巨噬細(xì)胞一方面通過分泌促纖維化炎性因子如TGF-β1、IL-1β、腫瘤壞死因子-α 提高活化的HSCs 的存活率，通過分泌CC 趨化因子-2（CCL2）和CCL7 促進(jìn)HSCs 的遷移加重肝纖維化［11］；一方面通過釋放各種MMPs 分子，降解膠原抑制肝纖維化［7］，考慮雙邊作用可能與巨噬細(xì)胞的M1/M2 分型相關(guān)。整體具體作用機(jī)制見圖1。

圖1 肝內(nèi)的TGF-β1與多種細(xì)胞相互作用促進(jìn)肝纖維化的過程

4 TGF-β1通過活化HSCs促進(jìn)肝纖維化

活化的HSCs 和肌成纖維細(xì)胞是生成ECM 最主要的細(xì)胞。在非酒精性脂肪肝（NAFLD）、肝毒素或膽道損傷導(dǎo)致的肝纖維化中，高達(dá)85%～95%的肝肌成纖維細(xì)胞是通過HSCs 活化形成的，這表明HSCs 活化是肝纖維化的核心事件。其中TGF-β1是促進(jìn)HSCs激活和增殖的最主要物質(zhì)，它主要通過觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)的Smad 信號(hào)通路和non-Smad 信號(hào)通路刺激HSCs活化。

4.1 TGF-β1 通過TGF-β1/Smad 信號(hào)通路作用于HSCs 當(dāng)TGF-β1 刺 激HSCs 啟 動(dòng)Smad 信號(hào) 通路時(shí)，TGF-β1 首先與細(xì)胞膜上的TGF-βⅡ型受體結(jié)合，接著招募TGF-βⅠ型受體形成TGF-β-TGF-βⅡ型受體-TGF-βⅠ型受體復(fù)合物。隨后復(fù)合物上的TGF-βⅠ型受體發(fā)生構(gòu)象調(diào)節(jié)進(jìn)而活化Smad2、Smad3 蛋白并使二者特異性結(jié)合，結(jié)合后的Smad2/Smad3 蛋白復(fù)合物被磷酸化，并與Smad4 蛋白形成雜配合物被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核結(jié)合DNA，進(jìn)而調(diào)節(jié)多個(gè)轉(zhuǎn)錄靶基因如α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）和結(jié)締組織生長因子（CTGF）促進(jìn)HSCs 活化增殖［10］。此外，TGF-β1 通過激活Smad7 抑制TGF-βⅠ型受體和Smad2/3 的表達(dá)進(jìn)而阻礙TGF- β 信號(hào)的過度激活［12］。目前也有大量研究者基于TGF-β1/Smad 信號(hào)通路進(jìn)一步深入探究改善肝纖維化的方法。

4.1.1 TGF-β家族蛋白與Smad信號(hào)通路的作用 研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1 可激活R-Smad 蛋白中的Smad2 和Smad3蛋白表達(dá)，TGF- β家族中的BMP7可激活R-Smad 蛋白中的Smad1、Smad5 和Smad8 蛋白。BMP 和TGF-β1 在信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的配體結(jié)構(gòu)和受體結(jié)合方式相似，隨后都與Smad4蛋白形成復(fù)合物，這表明BMP 不僅可能通過與TGF-β 動(dòng)態(tài)競爭參與肝臟發(fā)育，還可能參與肝臟纖維的形成［12-13］。在肝纖維化過程中，BMP-7蛋白先升高后降低，這一變化趨勢與TGF-β1 呈時(shí)間和劑量依賴性的持續(xù)增加相關(guān)，而外源性BMP-7 可通過上調(diào)p-Smad1/5/8 和下調(diào)p-Smad3 及p38 的表達(dá)抑制HSCs 的活化、遷移和增殖，進(jìn)一步發(fā)揮抗纖維化作用［14］。BMP-2 蛋白能顯著抑制TGF-β1及其同源的Ⅰ型、Ⅱ型受體肽表達(dá)和HSCs 中的Smad3 磷酸化水平［15］。LEFTY2 作為TGF-β家族蛋白在人肝纖維化組織和四氯化碳誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠模型中明顯降低，而在TGF-β1處理的HSCs 中，LEFTY2 的表達(dá)也降低。研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)的LEFTY2 能通過調(diào)節(jié)TGF-β1/Smad3 信號(hào)通路抑制HSCs的增殖和活化進(jìn)而減輕肝纖維化［16］。

4.1.2 miRNA 與Smad 信號(hào)通路的作用 研究發(fā)現(xiàn)，miR-21 可通過抑制Smad7 的表達(dá)促進(jìn)TGF-β1/Smad 信號(hào)通路，過表達(dá)的miR-21 明顯促進(jìn)了HSCs 增殖，減少了HSCs 凋亡，并增加了膠原表達(dá)［17］。在TGF-β1 刺激的HSCs 中存在miR-122，用miR-122 處理可顯著降低Smad4 的表達(dá)，從而抑制HSCs 的EMT 過程以抑制HSCs 轉(zhuǎn)變?yōu)榧〕衫w維細(xì)胞［18］。而Smad4 是miR-34a-5p 的直接靶標(biāo)，研究發(fā)現(xiàn)miR-34a-5p 在人肝硬化和小鼠肝纖維化中減少，當(dāng)抑制miR-34a-5p 表達(dá)時(shí)，HSCs 的TGF-β1/Smad3信號(hào)通路作用減弱［19］。TGF-β1 可誘導(dǎo)miR-181a 表達(dá)，誘導(dǎo)的miR-181a 至少部分通過抑制肝再生因子而誘導(dǎo)肝纖維化，肝再生因子可通過降低TGF-βⅡ型受體的表達(dá)進(jìn)而抑制TGF-β1 的作用［20］。當(dāng)TGF-β1刺激HSCs 時(shí)，Twist1 表達(dá)增加，隨后Twist1 被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核與miR-199a-3p 基因的E-box 元件結(jié)合，觸發(fā)miR-199a 表達(dá)。miR-199a-3p 通過抑制CAV2 蛋白，最終抑制CAV2 介導(dǎo)的TGF-βⅠ型受體降解從而激活TGF-β1信號(hào)通路［21］。

4.1.3 細(xì)胞因子與Smad信號(hào)通路的作用 研究發(fā)現(xiàn)，IL-26 可通過抑制caspase3 蛋白和Bax 蛋白的表達(dá)抑制HSCs 凋亡，并通過上調(diào)HSCs 中TGF-β1 和Smad2 的蛋白表達(dá)促進(jìn)HSCs 的增殖和活化［22］。在高分期的肝纖維化中，CXC 趨化因子-6（CXCL-6）表達(dá)升高，CXCL-6 可促進(jìn)枯否細(xì)胞釋放TGF-β1，釋放的TGF-β1 通過SMAD2/BRD4/C?MYC/EZH2 信號(hào)通路激活HSCs 而促進(jìn)肝纖維化發(fā)展［23］。肝細(xì)胞核因子4α（HNF4α）是核激素受體家族的重要轉(zhuǎn)錄因子，是正常肝結(jié)構(gòu)、肝細(xì)胞形態(tài)和功能分化以及肝上皮生成所必需的。在N-二甲基亞硝胺和膽管結(jié)扎造成的肝纖維化中，HNF4α 表達(dá)下降，在分化的HSCs中注射HNF4α可上調(diào)Smad7表達(dá)，而Smad7可抑制Smad2磷酸化從而調(diào)控EMT過程［24］。

4.1.4 其他與Smad 信號(hào)通路的作用 研究表明，組氨酸激酶NME1 和NME2 可通過組氨酸磷酸化介導(dǎo)參與TGF-β1誘導(dǎo)的HSCs活化和四氯化碳誘導(dǎo)的肝纖維化。沉默NME1 或NME2 不僅通過誘導(dǎo)1-磷酸組氨酸和3-磷酸組氨酸表達(dá)而減少組氨酸磷酸化，還通過抑制TGF-β1 誘導(dǎo)的Smad2和Smad3 磷酸化這兩條途徑抑制HSCs 激活［25］。大麻素受體1 在HSCs 中發(fā)揮促纖維化作用，當(dāng)用siRNA 沉默大麻素受體1表達(dá)時(shí)，TGF-β1被抑制，TGF-βⅡ型受體誘導(dǎo)的Smad 信號(hào)傳導(dǎo)也被阻斷［26］。AGAP2 是一個(gè)多任務(wù)的GTP 酶活化蛋白，表現(xiàn)GTP 酶活性，參與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞存活、遷移和受體轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)信號(hào)通路的過程。越來越多的證據(jù)表明，激活Ras 蛋白是TGF-β1非典型細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的途徑，這種Ras 家族的小GTP 酶（包括Rab、Ran 和Rho）都是調(diào)控TGF-β1 信號(hào)通路的關(guān)鍵組成成分，其作用分別為TGF-β1受體的內(nèi)吞作用、Smad的轉(zhuǎn)運(yùn)和與肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的交叉作用。此外，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)AGAP2 通過參與TGF-βⅡ型受體循環(huán)回收到細(xì)胞膜的過程參與TGF-β1 的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，最終促進(jìn)肝纖維化的發(fā)生發(fā)展［4］。

4.2 TGF-β1 通過TGF-β1/non-Smad 信號(hào)通路作用于HSCs 在non-Smad 信號(hào)通路中，TGF-βⅠ型受體和TGF-βⅡ型受體形成復(fù)合物后，TGF-βⅠ型受體可直接作用或磷酸化激活下游的一系列信號(hào)通路，如PI3K/Akt、ERK、p38 MAPK、JNK 和NF-κB 等信號(hào)通路，其中部分對(duì)Snail1 和Slug 有正向調(diào)節(jié)作用，最終導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生EMT 促進(jìn)肝纖維化發(fā)生發(fā)展。文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)，Akt 能與未磷酸化的Smad3 作用抑制TGF-βⅠ型受體誘導(dǎo)的Smad3 的激活和核定位，ERK 可直接磷酸化Smad2 和Smad3 以調(diào)節(jié)其活性，提示non-Smad 信號(hào)通路與Smad 信號(hào)通路之間可能存在相互作用［10］。

在研究TGF-β1 調(diào)節(jié)HSCs 中的non-Smad 信號(hào)通路機(jī)制時(shí)發(fā)現(xiàn)，miR-21 還可通過抑制SPRY2 激活ERK信號(hào)通路［18］。 miR-155 可同時(shí)分別與TCF4 mRNA 和AGTR1 mRNA 的3′-UTR 相互作用，其中TCF4是EMT的重要調(diào)節(jié)劑，AGTR1是ERK1通路的重要調(diào)節(jié)劑。miR-155 在肝硬化患者、二甲基亞硝胺致大鼠肝纖維化和TGF-β1 激活的HSCs 中降低，增加miR-155 表達(dá)可通過該靶基因的作用磷酸化ERK1 抑制HSCs 的EMT，同時(shí)miR-155 可抑制細(xì)胞凋亡［27］。在HSCs 活化過程中，IL-22 可通過激活p38/MAPK通路激活TGF-β信號(hào)通路［28］。

4.3 TGF-β1 通過介質(zhì)作用于HSCs 組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶EZH2 在TGF-β1 處理的HSCs 中上調(diào)，EZH2的過表達(dá)可促進(jìn)ECM 產(chǎn)生，當(dāng)抑制EZH2 時(shí)，TGF-β誘導(dǎo)的HSCs激活也被抑制［29］。TGF-β1不僅能夠通過依賴AGAP2 的方式增加PDGF 表達(dá)而誘導(dǎo)HSCs增殖，也可以通過AGAP2 的結(jié)合伙伴FAK 在誘導(dǎo)HSCs 遷移中發(fā)揮作用［4］。CTHRC1 是一種來源于HSCs 的分泌蛋白，在纖維化肝組織中顯著上調(diào)。CTHRC1 通過激活TGF-β1 信號(hào)，促進(jìn)HSCs 從靜止?fàn)顟B(tài)向激活狀態(tài)轉(zhuǎn)化，增強(qiáng)HSCs 的遷移或收縮能力。同時(shí)，CTHRC1 選擇性激活非經(jīng)典的Wnt 信號(hào)，促進(jìn)HSCs的收縮和遷移，但不激活HSCs［30］。

4.4 TGF-β1 通過其他細(xì)胞作用于HSCs IL-17A可通過招募促炎單核細(xì)胞增加TGF-β的表達(dá)并增強(qiáng)HSCs中的TGF-β反應(yīng)［28］。DNA去甲基化酶TET3在應(yīng)激的肝細(xì)胞和HSCs 中增加，TET3 可通過甲基化上調(diào)TGF-β1 信號(hào)通路中的TGF-β1 表達(dá)，而TGF-β1又可刺激TET3的表達(dá)，形成TET3 與TGF-β1 在HSCs 和肝細(xì)胞中的正反饋回路，最終促進(jìn)HSCs 激活和ECM 產(chǎn)生而促進(jìn)肝纖維化發(fā)生發(fā)展［31］。研究發(fā)現(xiàn)，自然殺傷細(xì)胞能通過誘導(dǎo)HSCs凋亡緩解肝纖維化，HSCs 分泌的TGF-β1 可誘導(dǎo)自然殺傷細(xì)胞凋亡，因此TGF-β1能夠阻止自然殺傷細(xì)胞清除活化的HSCs［32］。

5 總結(jié)與展望

眾所周知，TGF-β1是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最有效的促纖維化細(xì)胞因子，肝纖維化也與TGF-β1 關(guān)系密切?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠模型和外周血單個(gè)核細(xì)胞中，TGF-β1 可通過上調(diào)Notch 信號(hào)通路抑制肝纖維化逆轉(zhuǎn)的機(jī)制促進(jìn)肝纖維化的發(fā)生發(fā)展［33］。綜上所述，TGF-β1促進(jìn)肝纖維化發(fā)生發(fā)展的作用機(jī)制復(fù)雜，大量研究學(xué)者仍在不斷探索中，但通過抑制TGF-β1 及其相關(guān)的通路蛋白等方式抑制肝纖維化的發(fā)生發(fā)展是關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。探索TGF-β1 如何促進(jìn)肝纖維化有助于豐富改善肝纖維化的方式，最終以期找到更好的治療肝纖維化的方法應(yīng)用于臨床。