劉小姣 歐陽(yáng)范馨 肖 慧 張 熙 陳姿霖 羅玉清 郭 娟 熊 武

(湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院麻醉手術(shù)科，湖南 長(zhǎng)沙 410007)

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一種具有自我復(fù)制和多向分化潛能的成體干細(xì)胞，在體內(nèi)或體外特定的誘導(dǎo)條件下能分化成脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等多種細(xì)胞，其來(lái)源廣泛，可在外周血、臍血、骨髓、軟骨、脂肪、神經(jīng)、內(nèi)皮等組織中提取得到，因其具有多向分化潛能、造血支持、促進(jìn)干細(xì)胞植入、免疫調(diào)控等特點(diǎn)而日益受到人們的關(guān)注[1]。隨著對(duì)MSCs的深入研究，發(fā)現(xiàn)MSCs能分泌白細(xì)胞介素6(IL-6)、生長(zhǎng)因子、巨核細(xì)胞集落刺激因子等細(xì)胞因子，其中干細(xì)胞因子(SCF)又稱肥大細(xì)胞生長(zhǎng)因子，是一種能與干細(xì)胞因子受體(C-Kit)結(jié)合的造血細(xì)胞因子，對(duì)諸多細(xì)胞的分化和增殖起著重要的調(diào)節(jié)作用[2-3]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，高糖等微環(huán)境能抑制MSCs的增殖、遷移等生物學(xué)功能[4]。人參皂苷(GS)是一種主要存在于人參屬藥材中的固醇類化合物，研究發(fā)現(xiàn)GS能誘導(dǎo)骨髓MSCs活性，增加糖尿病皮膚潰瘍大鼠血清生長(zhǎng)因子的含量，以加速創(chuàng)面愈合[5]。GS-Rg1是GS中主要活性成分之一，現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)其具有抗疲勞、保護(hù)心肌細(xì)胞、促進(jìn)血管再生等作用，在神經(jīng)退行性疾病、血管保護(hù)方面具有廣闊的應(yīng)用前景[6]。而臨床上關(guān)于GS-Rg1能否修復(fù)損傷MSCs的生物學(xué)功能及促進(jìn)SCF分泌，目前尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。本研究通過(guò)高糖誘導(dǎo)建立MSCs損傷模型，觀察GS-Rg1對(duì)MSCs損傷模型的生物學(xué)功能及分泌SCF功能影響，探討GS-Rg1恢復(fù)損傷MSCs的作用機(jī)制，為人參屬藥材的臨床應(yīng)用提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 主要藥品與試劑 細(xì)胞培養(yǎng)瓶、Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、碘化丙啶染色液(美國(guó)BD公司)；青鏈霉素混合液(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)；DMEM/F12培養(yǎng)基(美國(guó)Hyclone公司)；淋巴細(xì)胞分離液、油紅O染液(美國(guó)Sigma公司)；胰酶、胎牛血清(美國(guó)GIBCO公司)；磷酸鹽緩沖液(PBS)(美國(guó)Hyclone公司)；成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基、成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基、成軟骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基、茜素紅染液(美國(guó)Cyagen公司)；阿利新藍(lán)染液(上海邁基生物技術(shù)有限公司)；細(xì)胞增殖及毒性檢測(cè)試劑盒(CCK-8)(碧云天生物技術(shù)研究所)；SCF酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)試劑盒(上海江萊生物科技有限公司)。

1.2 主要儀器 二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱(日本SANYO公司)；倒置生物顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司)；臺(tái)式低速離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)；振蕩器(上海滬西分析儀器廠有限公司)；立式壓力鍋(上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司)；電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海圣欣科學(xué)儀器有限公司)；熱電MK3酶標(biāo)儀、細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)；流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 MSCs分離與鑒定選用 用人臍血MSCs(hUCBMSCs)進(jìn)行試驗(yàn)。無(wú)菌條件下取健康胎盤中的臍帶血10 mL(標(biāo)本采集獲得產(chǎn)婦和家屬知情同意)，加入肝素(20 U/mL)抗凝，室溫靜置30～60 min，采用密度梯度離心法分離出單個(gè)核細(xì)胞，移入含5%胎牛血清、1%青鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)7 d。細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)90%融合時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)，每隔2 d換液1次。取第3代生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞于顯微鏡(×200)下觀察細(xì)胞形態(tài)，取第4代生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞分別進(jìn)行成骨、成軟骨、成脂誘導(dǎo)分化鑒定：細(xì)胞經(jīng)成骨誘導(dǎo)分化后茜素紅染液染色呈紅色結(jié)節(jié)沉積，經(jīng)成軟骨誘導(dǎo)分化后阿利新藍(lán)染液染色呈藍(lán)色，經(jīng)成脂誘導(dǎo)分化后油紅O染液染色呈紅色。取第4代hUCBMSCs用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.3.2 高糖誘導(dǎo)建立損傷hUCBMSCs模型 取鑒定成功的hUCBMSCs，在含30 mmol/L葡萄糖的DMEM/F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)120 h，建立高糖誘導(dǎo)損傷hUCBMSCs模型。同時(shí)另取hUCBMSCs在含5.5 mmol/L葡萄糖的DMEM/F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)120 h為正常組。

1.3.3 GS-Rg1最佳濃度確定 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的高糖誘導(dǎo)損傷hUCBMSCs接種到96孔板上，每孔加入約1×104個(gè)細(xì)胞，在96孔板中配制100 μL的細(xì)胞懸液，再分別按0、5、10、20、40、80 mg/L的濃度予GS-Rg1進(jìn)行干預(yù)，每組設(shè)定3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)48 h后加入CCK-8溶液，按照CCK-8試劑盒說(shuō)明書操作，測(cè)定hUCBMSCs在酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)處的光密度(OD)值，篩選出GS-Rg1促高糖誘導(dǎo)損傷hUCBMSCs細(xì)胞增殖的最佳濃度。

1.3.4 實(shí)驗(yàn)分組 將高糖誘導(dǎo)損傷hUCBMSCs隨機(jī)分成試驗(yàn)組和對(duì)照組，試驗(yàn)組用最佳濃度的GS-Rg1處理，正常組和對(duì)照組用等容積PBS處理。

1.4 觀察指標(biāo)及方法

1.4.1 增殖能力 觀察GS-Rg1對(duì)高糖誘導(dǎo)損傷hUCBMSCs增殖能力的影響。將3組hUCBMSCs接種到96孔板，每孔加入約1×105個(gè)細(xì)胞，配制成100 μL的細(xì)胞懸液，在37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，每組取8個(gè)樣品，3個(gè)復(fù)孔，試驗(yàn)組加GS-Rg1至最佳濃度，對(duì)照組及正常組加入等容積PBS，48 h后向每孔中加入10 μL CCK-8溶液并孵育4 h，按照CCK-8試劑盒說(shuō)明書，用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm波長(zhǎng)處的OD值評(píng)價(jià)hUCBMSCs的增殖能力。

1.4.2 黏附能力 觀察GS-Rg1對(duì)高糖誘導(dǎo)損傷hUCBMSCs黏附能力的影響。將3組hUCBMSCs接種到24孔板，每孔加入約1×105個(gè)細(xì)胞，配制成500 μL細(xì)胞懸液，每組取8個(gè)樣品，3個(gè)復(fù)孔，在37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，試驗(yàn)組加GS-Rg1至最佳濃度，對(duì)照組及正常組加入等容積PBS，48 h后將3組的hUCBMSCs接種在大鼠纖維連接蛋白培養(yǎng)板中，于37 ℃下培養(yǎng)30 min，再在顯微鏡(×200)下觀察并計(jì)數(shù)貼壁細(xì)胞數(shù)目。

1.4.3 遷移能力 觀察GS-Rg1對(duì)高糖誘導(dǎo)損傷hUCBMSCs遷移能力的影響。試驗(yàn)前進(jìn)行器械滅菌，用Marker筆在6孔板背后每隔1 cm劃一道橫線，橫穿過(guò)孔，每孔至少穿過(guò)5條線。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的hUCBMSCs，每孔中加入約5×105個(gè)細(xì)胞，置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜，然后用無(wú)菌的200 μL槍頭在培養(yǎng)孔底部中央劃一道痕跡，用PBS沖洗3次去除劃下的細(xì)胞。每組取8個(gè)樣品，3個(gè)復(fù)孔，試驗(yàn)組加GS-Rg1至最佳濃度，對(duì)照組、正常組加入等容積PBS，培養(yǎng)24 h，在顯微鏡(×200)下分別觀察測(cè)量0、24 h時(shí)劃痕創(chuàng)面愈合情況，細(xì)胞遷移能力用遷移寬度表示。

1.4.4 抗凋亡能力 觀察GS-Rg1對(duì)高糖誘導(dǎo)損傷hUCBMSCs抗凋亡能力的影響。3組各取100 mL的hUCBMSCs細(xì)胞懸液(1×106個(gè)細(xì)胞/mL)置于流式試管中，每組取8個(gè)樣品，試驗(yàn)組加GS-Rg1至最佳濃度，對(duì)照組及正常組加入等容積的PBS，再添加Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)溶液，搖勻后在室溫下孵育15 min，再加入5 μL的碘化丙啶染色，用流式細(xì)胞儀和FlowJo流式數(shù)據(jù)分析軟件對(duì)3組細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行檢測(cè)分析，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.4.5 分泌SCF功能 觀察GS-Rg1對(duì)高糖誘導(dǎo)損傷hUCBMSCs分泌SCF功能的影響。將3組hUCBMSCs接種到96孔板，每孔加入1×105個(gè)細(xì)胞，制成100 μL細(xì)胞懸液，每組取8個(gè)樣品，3個(gè)復(fù)孔，試驗(yàn)組加GS-Rg1至最佳濃度，對(duì)照組及正常組加入等容積PBS，在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，取3組細(xì)胞上清液，依據(jù)SCF ELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明，使用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)處OD值，并計(jì)算SCF含量。

2 結(jié)果

2.1 hUCBMSCs的培養(yǎng)情況 顯微鏡下觀察第3代hUCBMSCs培養(yǎng)細(xì)胞可見，細(xì)胞呈平行或漩渦狀排列，生長(zhǎng)迅速，細(xì)胞形態(tài)呈纖維狀或長(zhǎng)梭形。見圖1。

圖1 第3代hUCBMSCs的形態(tài)學(xué)觀察(×200)

2.2 hUCBMSCs的誘導(dǎo)分化 鑒定成骨誘導(dǎo)分化：茜素紅染色顯示細(xì)胞為紅色，呈扁平多邊形、結(jié)節(jié)樣聚集生長(zhǎng)。鑒定成軟骨誘導(dǎo)分化：阿利新藍(lán)染色顯示細(xì)胞為藍(lán)色，細(xì)胞突起變短，長(zhǎng)梭狀細(xì)胞減少，多呈多角形或類圓形。鑒定成脂誘導(dǎo)分化：油紅O染色可見胞內(nèi)充滿圓形脂滴，染色為紅色。見圖2。

成骨誘導(dǎo)分化(茜素紅染色) 成軟骨誘導(dǎo)分化(阿利新藍(lán)染色) 成脂誘導(dǎo)分化(油紅O染色)

2.3 GS-Rg1促高糖誘導(dǎo)損傷hUCBMSCs增殖的最佳濃度測(cè)定 隨著對(duì)GS-Rg1濃度的增加，高糖誘導(dǎo)損傷hUCBMSCs細(xì)胞增殖的OD值逐漸升高，當(dāng)GS-Rg1濃度為40 mg/L時(shí)，OD值達(dá)到最高，即細(xì)胞活力最高，細(xì)胞增殖能力最強(qiáng)，因此后續(xù)試驗(yàn)均選用了40 mg/LGS-Rg1作為最佳濃度。見圖3。

圖3 GS-Rg1促高糖誘導(dǎo)損傷hUCBMSCs增殖的最佳濃度測(cè)定

2.4 GS-Rg1對(duì)高糖誘導(dǎo)損傷hUCBMSCs生物學(xué)特性及分泌SCF功能的影響 與正常組比較，對(duì)照組細(xì)胞的增殖OD值、黏附數(shù)、遷移寬度及SCF含量均明顯下降，細(xì)胞凋亡率明顯升高，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對(duì)照組比較，試驗(yàn)組細(xì)胞增殖OD值、黏附數(shù)、遷移寬度及SCF含量明顯增加，細(xì)胞凋亡率明顯下降，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖4。

注：A.增殖能力比較，B.黏附能力比較，C.遷移能力比較，D.抗凋亡能力比較，E.SCF含量比較；對(duì)照組與正常組比較，*P<0.05；試驗(yàn)組與對(duì)照組比較，△P<0.05

3 討論

MSCs是一種具有多向分化潛能的成體干細(xì)胞，廣泛分布于人體骨髓、牙髓、脂肪、臍帶、胎盤等組織中[7-8]。大量的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證明,MSCs在不同的微環(huán)境下可向不同的譜系分化,可分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、肝細(xì)胞、肌肉、肌腱、韌帶等多種細(xì)胞或組織，近年來(lái)還發(fā)現(xiàn)MSCs具有分泌功能，可以在某些特定條件下分泌黏附分子、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子受體及整合素家族成員等[9-10]。hUCBMSCs是存在于新生兒臍帶組織中的一種多功能干細(xì)胞，具有免疫調(diào)節(jié)、促進(jìn)造血、修復(fù)損傷與病變組織器官等功能，能分泌多種細(xì)胞因子，如SCF、表皮生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子等，在組織工程、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、肝臟疾病、心血管系統(tǒng)疾病、免疫系統(tǒng)疾病、視網(wǎng)膜疾病、糖尿病、腫瘤疾病等方面具有廣泛應(yīng)用前景[11-14]。SCF是C-Kit原癌基因編碼受體的配體蛋白，可參與機(jī)體發(fā)育中多種細(xì)胞生長(zhǎng)的調(diào)控，是一種多功能細(xì)胞生長(zhǎng)因子，在細(xì)胞增殖、分化、遷移過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，其主要作用于早期造血細(xì)胞，同時(shí)可加速M(fèi)SCs的增殖[15]。研究發(fā)現(xiàn)，在損傷心肌中存在SCF等一系列信號(hào)分子，這些信號(hào)分子對(duì)MSCs的增殖、遷移、聚集等能力有促進(jìn)作用[16]。

隨著對(duì)MSCs的深入研究，發(fā)現(xiàn)高糖、缺氧等微環(huán)境可以對(duì)MSCs造成損傷，尤其是高糖微環(huán)境對(duì)MSCs的損傷最大，將直接導(dǎo)致MSCs的各項(xiàng)功能受損。楊明璨等[17]研究表明，高糖能抑制MSCs的增殖能力，導(dǎo)致糖尿病潰瘍愈合受阻。劉長(zhǎng)營(yíng)等[18]研究亦發(fā)現(xiàn)，2型糖尿病患者骨髓MSCs的增殖能力減弱，凋亡率升高,細(xì)胞遷移能力減弱。這也與本實(shí)驗(yàn)對(duì)照組表現(xiàn)一致，可見高糖會(huì)直接導(dǎo)致MSCs生物學(xué)特性受損，細(xì)胞凋亡顯著增加。研究發(fā)現(xiàn)，MSCs活性的維持與SCF密切相關(guān)，高糖誘導(dǎo)損傷MSCs時(shí)其分泌功能也會(huì)明顯受損，導(dǎo)致SCF分泌降低，進(jìn)而影響MSCs的分化功能[19]。如何修復(fù)MSCs的生物學(xué)功能，減少凋亡，促進(jìn)分泌SCF，是臨床研究的熱點(diǎn)。

GS是人參屬藥材中的主要活性成分，具有提高人體免疫力、促進(jìn)物質(zhì)代謝、抗腫瘤、抗疲勞、抗衰老等作用，有研究證實(shí)GS還能促進(jìn)骨髓MSCs分泌SCF[20]。GS有多種單體成分，GS-Rg1是其主要活性成分之一，研究發(fā)現(xiàn)GS-Rg1具有保護(hù)心肌細(xì)胞、促進(jìn)血管再生等作用[6]。已有研究證實(shí)，GS-Rg1對(duì)hUCBMSCs的增殖能力有明顯的促進(jìn)作用，GS-Rg1可通過(guò)激活鈣敏感受體(CaSR)或其他信號(hào)通路途徑調(diào)節(jié)下游細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)和p38的活性，從而參與hUCBMSCs的生物學(xué)功能調(diào)節(jié)，影響hUCBMSCs的生物學(xué)特性[21]。然而，GS-Rg1對(duì)hUCBMSCs損傷的修復(fù)作用尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，GS-Rg1能增強(qiáng)高糖誘導(dǎo)損傷hUCBMSCs的細(xì)胞活性，促進(jìn)hUCBMSCs體外增殖，且不同濃度梯度的GS-Rg1對(duì)hUCBMSCs均有一定作用，其中以40 mg/L為最佳濃度。以最佳濃度進(jìn)一步干預(yù)顯示，GS-Rg1能顯著提高高糖誘導(dǎo)損傷hUCBMSCs的增殖、黏附、遷移的生物學(xué)特性，降低細(xì)胞凋亡率，同時(shí)促進(jìn)SCF分泌，這也與種宗雷等[22]的研究結(jié)果一致。

綜上所述，GS-Rg1對(duì)高糖誘導(dǎo)損傷hUCBMSCs的生物學(xué)特性具有保護(hù)作用，能夠明顯促進(jìn)hUCBMSCs增殖，提高黏附和遷移能力，減少細(xì)胞凋亡，并能促進(jìn)SCF分泌，修復(fù)其生物學(xué)功能，然而其具體的作用機(jī)制有待將來(lái)進(jìn)一步深入研究。