劉晶華 ，常 巍 ，余福兵 ，盛 娟 ，馮程程 ，趙霓姍

（1）云南大學(xué)附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，云南 昆明 650021；2）昆明醫(yī)科大學(xué)統(tǒng)計(jì)教研室，云南 昆明 650500）

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是一種常見(jiàn)的致命性疾病，環(huán)境和遺傳因素均可影響其發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，根據(jù)WHO的GLOBOCAN數(shù)據(jù)庫(kù)，在全球范圍內(nèi)，CRC分別是男性和女性中最常見(jiàn)診斷的第三大和第二大癌癥，2020年新發(fā)病例190萬(wàn)，死亡病例近93.5萬(wàn)。男性的發(fā)病率和死亡率顯著高于女性[1]。

大多數(shù)CRC起源于腺瘤，腺瘤進(jìn)展為癌，大概平均需要至少10 a[2]。其預(yù)后與臨床病理學(xué)分期密切相關(guān)，早期CRC的5 a生存率高達(dá)90%，而晚期則不足10%[3]。肝臟是CRC最常見(jiàn)的轉(zhuǎn)移部位，肝轉(zhuǎn)移是CRC根治性切除后死亡的主要原因[4]。

C/EBP δ由CEBPD基因編碼，是C/EBP轉(zhuǎn)錄因子家族的成員之一，它可以通過(guò)對(duì)靶細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)，參與細(xì)胞周期調(diào)控、增殖與分化、腫瘤的發(fā)生與凋亡等重要生命活動(dòng)[5]。有文獻(xiàn)報(bào)道其在缺氧環(huán)境下能顯著提高HIF-1α的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖和腫瘤血管新生，從而促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展和肝轉(zhuǎn)移[6]。而E3泛素連接酶Siah2在低氧條件下，可通過(guò)Siah2/PHD/ HIF-1α信號(hào)通路使HIF-1α蛋白聚集來(lái)調(diào)控下游基因的表達(dá)[7]。C/EBPδ與Siah2在結(jié)直腸癌中的關(guān)系及相關(guān)機(jī)制尚不明確，筆者對(duì)此進(jìn)行研究，現(xiàn)總結(jié)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取云南大學(xué)附屬醫(yī)院普通外科2017年至2018年接受結(jié)直腸癌根治術(shù)的40例患者，其中12例同時(shí)伴有肝轉(zhuǎn)移，男19例，女21例，年齡42～83歲，平均（65±13）歲。留取患者癌組織、對(duì)應(yīng)的癌旁組織（踞腫瘤灶邊緣 ＜ 2 cm）以及正常腸組織（踞腫瘤灶邊緣 ＞ 5 cm），用于免疫組織化學(xué)以及免疫共沉淀檢測(cè)。所有病例均由兩名病理醫(yī)師根據(jù)美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)（AJCC）/國(guó)際抗癌聯(lián)盟（UICC）結(jié)直腸癌TNM分期系統(tǒng)（第七版，2010年）[8]，確定腫瘤的組織類型以及臨床病例分期，其中Ⅰ期6例，Ⅱ期22例，Ⅳ期12例。納入標(biāo)準(zhǔn)：所有患者均經(jīng)電子結(jié)腸鏡+病理檢查確診；均表現(xiàn)出結(jié)腸癌的臨床特征；所有患者術(shù)前均未接受過(guò)放療、化療、生物治療等其他治療；既往無(wú)認(rèn)知功能障礙；無(wú)精神類疾病。排除標(biāo)準(zhǔn)：伴有其它部位的重大疾病；伴有嚴(yán)重的肝腎功能損傷患者；病理學(xué)資料或基礎(chǔ)資料缺失；研究中自動(dòng)退出者。存在本研究經(jīng)過(guò)云南大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，并經(jīng)得患者及其家屬的知情同意。

1.2 主要試劑

人結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞購(gòu)于上海中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，MEM培養(yǎng)基（Gibco，美國(guó)），胰蛋白酶（碧云天，中國(guó)），DMSO（Amresco，美國(guó)），PBS（北京中杉），免疫組織化學(xué)S-P檢測(cè)試劑盒（PIERCE，美國(guó)）、ECL增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒（PIERCE，美國(guó)），兔抗人C/EBPδ抗體（rockland-inc，美國(guó)），兔抗人Siah2抗體（abcam，美國(guó)），HRP標(biāo)記山羊抗兔抗體（abcam，美國(guó)）。

1.3 方法

1.3.1 人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞Caco-2培養(yǎng)將Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)于含20%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素雙抗的MEM培養(yǎng)基中，2 d換液1次，待細(xì)胞80% 融合度按1∶3傳代比例進(jìn)行，于37 ℃，5%CO2及飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.2 C/EBPδ過(guò)表達(dá)及干擾慢病毒載體構(gòu)建利用全基因合成方法得到C/EBPδ的ORF序列，構(gòu)建其基因表達(dá)質(zhì)粒載體。將構(gòu)建好的慢病毒過(guò)表達(dá)及干擾質(zhì)粒載體進(jìn)行超純?nèi)?nèi)毒素抽提，然后同慢病毒包裝載體共同轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，收集上清，純化濃縮后即為pLVX-C/EBPδ-IRESZsGreen1、pLVX-CEBPδ-RNAi慢病毒。

1.3.3 C/EBPδ過(guò)表達(dá)和干擾慢病毒感染Caco-2細(xì)胞收集Caco-2細(xì)胞，將細(xì)胞密度調(diào)至1×105/mL，每孔200 μl細(xì)胞懸液，將4 ℃保存的病毒離心20 s，慢病毒使用量=MOI×細(xì)胞數(shù)目/慢病毒滴度，將病毒液加入細(xì)胞中，加入5 μg/mL的Polybrene助轉(zhuǎn)染試劑，充分混勻后將24孔板放在37 ℃度培養(yǎng)箱中孵育，24 h后更換為新鮮培養(yǎng)基，48 h后，在熒光顯微鏡下觀察，計(jì)算慢病毒感染目的細(xì)胞的效率，余樣本留作后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.4 CCK8檢測(cè)C/EBPδ過(guò)表達(dá)和干擾對(duì)細(xì)胞增殖的影響取以上分組進(jìn)行慢病毒感染后的細(xì)胞，將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×105/mL，于96孔板上接種，每孔100 μL，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，移入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（37 ℃，5% CO2），繼續(xù)培養(yǎng)72 h，每孔加入10 μL的CCK8試劑，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h，在酶標(biāo)儀上450 nm處讀取吸光度值，并繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.3.5 流式檢測(cè)C/EBPδ過(guò)表達(dá)和干擾對(duì)細(xì)胞凋亡的影響收集細(xì)胞培養(yǎng)基的上清和沉淀，2 000 r/min離心5 min，PBS洗滌細(xì)胞3次，2 000 r/min離心5 min，收集3～5×105個(gè)細(xì)胞；在50 μL的Binding Buffer中加入5 μL 7-AAD染液，充分混勻；收集細(xì)胞后加入上述7-AAD染液；室溫下避光反應(yīng)5～15 min；反應(yīng)完成后再加入450 μL 的Binding Buffer混勻；再加入1 μL AnnexinV-PE充分混勻；室溫下避光反應(yīng)5～15 min；1 h內(nèi)，進(jìn)行流式細(xì)胞儀觀察和檢測(cè)。

1.3.6 流式檢測(cè)C/EBPδ過(guò)表達(dá)和干擾對(duì)細(xì)胞周期的影響參考上述步驟，在每管細(xì)胞樣品中加入0.5 mL碘化丙啶染色液，緩慢、充分重懸細(xì)胞沉淀，37 ℃條件下避光溫浴30 min，隨后4 ℃避光保存。染色完成后24 h內(nèi)完成流式檢測(cè)。

1.3.7 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)C/EBPδ過(guò)表達(dá)和干擾對(duì)細(xì)胞增殖的影響取正常及慢病毒感染后的細(xì)胞懸液做梯度倍數(shù)稀釋，每組細(xì)胞每皿分別接種200個(gè)細(xì)胞于含預(yù)溫培養(yǎng)皿中（10 mL，37 ℃），搖動(dòng)使其分散均勻。于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2周。當(dāng)出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的細(xì)胞克隆時(shí)，則停止培養(yǎng)。棄上清，PBS浸洗2次。使用結(jié)晶紫染色20 min，流動(dòng)水漂洗，充分干燥，肉眼及低倍鏡下計(jì)數(shù)大于10個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)。

1.3.8 免疫組織化學(xué)對(duì)切片進(jìn)行雙盲評(píng)價(jià)，高倍視野（×400）下選擇陽(yáng)性信號(hào)最強(qiáng)區(qū)域計(jì)數(shù)的150個(gè)腫瘤細(xì)胞中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，按C/EBPδ和Siah2表達(dá)百分率分為以下四個(gè)等級(jí)：＜ 1%為0分，1%～50%為1分，51%～75%為2分，＞ 75%為3分。根據(jù)染色強(qiáng)度分為三個(gè)等級(jí)：淺黃色計(jì)為1分，棕黃色計(jì)為2分，黃褐色計(jì)為3分。以陽(yáng)性細(xì)胞率和染色強(qiáng)度的分值乘積作為每一例的積分，積分 ＜ 4者判定為陰性，積分≥4為陽(yáng)性。

1.3.9 免疫共沉淀用含有蛋白酶抑制劑和RNA酶抑制劑的裂解液充分裂解細(xì)胞，12 000 r/min轉(zhuǎn)速離心15 min，取上清并加入相應(yīng)的抗體（兔抗人C/EBPδ抗體、兔抗人Siah2抗體）及瓊脂糖珠，在4 ℃條件下緩慢搖動(dòng)4～5 h。用預(yù)冷的RIPA緩沖液洗3次，沉淀產(chǎn)物在SDS上樣緩沖液中100 ℃煮沸10 min，進(jìn)行免疫印跡并分析。

1.3.10 Western blot檢測(cè)取結(jié)直腸癌組織裂解液上清，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)印，5%正常小牛血清封閉，抗C/EBPδ（1∶500）、內(nèi)參一抗的稀釋終濃度為1∶1 000，溫育2 h，用TBST洗3次，每次5 min，用封閉液將二抗稀釋成一定的濃度（1∶1 000），然后溫育2 h。ECL曝光、拍照及計(jì)算機(jī)圖像分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，對(duì)C/EBPδ和Siah2在CRC組織中的表達(dá)及C/EBPδ在CRC中的表達(dá)與臨床病例特征的關(guān)系進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 C/EBPδ和Siah2在CRC組織中的表達(dá)

免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，在40例結(jié)直腸癌組織中，C/EBPδ呈包膜及胞質(zhì)表達(dá)陽(yáng)性（圖1），陽(yáng)性表達(dá)率在正常結(jié)直腸組織、癌旁組織以及癌組織分別為5%（2/40）、42.5%（17/40）和82.5%（33/40）；Siah2呈胞核表達(dá)陽(yáng)性，陽(yáng)性表達(dá)率分別為2.5%（1/40）、25%（10/40）和75%（30/40）（圖2）。C/EBPδ和Siah2在癌旁組織及癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）；從正常組織到癌旁組織再到腸癌組織中，C/EBPδ和Siah2的陽(yáng)性率逐漸升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜ 0.05），見(jiàn)表1。

表1 C/EBPδ與Siah2在不同組織中陽(yáng)性率比較n（%）Tab.1 Comparison of positive rates of C/EBPδ and Siah2 in different tissues n（%）

圖1 免疫組化檢測(cè)CRC癌組織、對(duì)應(yīng)癌旁組織和正常腸組織中C/EBPδ的表達(dá)（×400）Fig.1 Immunohistochemical detection of C/EBPδ expression in CRC cancer tissues，corresponding adjacent tissues and normal intestinal tissues

圖2 免疫組化檢測(cè)CRC癌組織、對(duì)應(yīng)癌旁組織和正常腸組織中Siah2的表達(dá)（×400）Fig.2 Immunohistochemical detection of Siah2 expression in CRC cancer tissues，corresponding adjacent tissues and normal intestinal tissues

2.2 C/EBPδ在CRC中的表達(dá)與臨床病例特征的關(guān)系

C/EBPδ蛋白的表達(dá)與年齡、性別、癌胚抗原（CEA）、腫塊大小均無(wú)相關(guān)性（P＞ 0.05），與TNM分期和伴肝轉(zhuǎn)移有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＜ 0.05），見(jiàn)表2。

表2 C/EBPδ在CRC患者癌組織中的表達(dá)與臨床病例特征的關(guān)系Tab.2 The relationship between the expression of C/EBPδ in CRC and the characteristics of clinical cases

2.3 C/EBPδ與Siah2在CRC患者癌組織中表達(dá)的相關(guān)性

從免疫共沉淀結(jié)果可見(jiàn)，input檢測(cè)人結(jié)腸癌細(xì)胞Caco-2 中C/EBPδ和 Siah2均有表達(dá)；IP檢測(cè)顯示C/EBPδ下拉成功，但C/EBPδ與 Siah2相互作用不明顯，見(jiàn)圖3。

圖3 免疫共沉淀檢測(cè)C/EBPδ與Siah2在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)及相互作用Fig.3 Co-immunoprecipitation to detect the expression and interaction of C/EBPδ and Siah2 in colorectal cancer

2.4 C/EBPδ過(guò)表達(dá)和干擾對(duì)細(xì)胞增殖的影響

Cell Counting Kit結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，過(guò)表達(dá)空載轉(zhuǎn)染組、干擾空載轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖無(wú)明顯變化；與過(guò)表達(dá)空載轉(zhuǎn)染組比較，C/EBP δ過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖能力增加；與干擾空載轉(zhuǎn)染組比較，C/EBPδ干擾轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖能力降低（表3）。

表3 CCK8檢測(cè)C/EBPδ過(guò)表達(dá)和干擾對(duì)細(xì)胞增殖的影響Tab.3 CCK8 detects the effect of C/EBPδ overexpression and interference on cell proliferation

2.5 C/EBPδ過(guò)表達(dá)和干擾對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，與干擾空載轉(zhuǎn)染組比較，C/EBPδ干擾轉(zhuǎn)染組S期細(xì)胞比例降低；與過(guò)表達(dá)空載轉(zhuǎn)染組比較，C/EBPδ過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)染組S期細(xì)胞比例增加（圖4）。

圖4 流式檢測(cè)C/EBPδ過(guò)表達(dá)和干擾對(duì)細(xì)胞凋亡的影響Fig.4 Flow cytometric detection of the effect of C/EBPδ overexpression and interference on cell apoptosis

2.6 C/EBPδ過(guò)表達(dá)和干擾對(duì)細(xì)胞增殖的影響

平板克隆實(shí)驗(yàn)顯示與干擾空載轉(zhuǎn)染組比較，C/EBPδ干擾轉(zhuǎn)染組細(xì)胞克隆形成能力降低；與過(guò)表達(dá)空載轉(zhuǎn)染組比較，C/EBPδ過(guò)表達(dá)染組細(xì)胞克隆形成能力增加（圖5）。

圖5 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察C/EBPδ過(guò)表達(dá)和干擾對(duì)細(xì)胞增殖的影響Fig.5 Plate clone formation experiment to observe the effect of C/EBPδ overexpression and interference on cell proliferation

3 討論

C/EBPs是耐熱轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子中的一種，其生物作用多種多樣，既參與正常的生理代謝過(guò)程，又與多種疾病（尤其是炎癥和腫瘤）的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)，其對(duì)轉(zhuǎn)錄的調(diào)控為雙向性。C/EBPs的這種功能多樣性是與其結(jié)構(gòu)的特征性相聯(lián)系的，它們屬于bZIP蛋白家族，可以和含bZIP結(jié)構(gòu)的應(yīng)答元件蛋白（如Fos、Jun和cAMP）結(jié)合形成同源或異源二聚體來(lái)影響細(xì)胞的變化[9]，從而極大的增加了其靶基因的多樣性。有學(xué)者研究證實(shí)：C/EBPδ缺失小鼠表現(xiàn)出更高ERBB2-Neu誘導(dǎo)的乳腺癌發(fā)生率，但肺轉(zhuǎn)移卻減少[10]，從而得出C/EBPδ做為腫瘤抑制因子和促癌轉(zhuǎn)移因子的結(jié)論。然而，筆者在前期體外實(shí)驗(yàn)卻發(fā)現(xiàn)C/EBPδ在大腸癌細(xì)胞中呈過(guò)表達(dá)，從而推測(cè)其與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展呈正相關(guān)。

本研究中，C/EBPδ蛋白質(zhì)在結(jié)直腸癌患者癌組織中的表達(dá)水平高于癌旁組織，提示C/EBPδ的高表達(dá)可能與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系。C/EBPδ蛋白質(zhì)高表達(dá)與結(jié)直腸癌的TNM分期和肝轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，與年齡、性別、病理分型、分化程度無(wú)關(guān)。為進(jìn)一步明確C/EBPδ在結(jié)直腸癌中的功能，本研究構(gòu)建了C/EBPδ過(guò)表達(dá)和干擾的結(jié)直腸癌細(xì)胞系，通過(guò)CCK8實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞儀檢測(cè)以及平板克隆形成實(shí)驗(yàn)證實(shí)，高水平的C/EBPδ加快結(jié)直癌細(xì)胞生長(zhǎng)、提高其增殖能力、促進(jìn)癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。為了深入探索C/EBPδ促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制，本研究同時(shí)用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)了結(jié)直腸癌組織中Siah2的表達(dá)，結(jié)果表明癌組織中Siah2蛋白含量較癌旁正常組織也有增加，提示二者之間存在某種聯(lián)系。C/EBPδ長(zhǎng)期以極低量存在于各種細(xì)胞中，可被許多刺激誘導(dǎo)而進(jìn)一步增多，例如炎性細(xì)胞因子[11]。惡性腫瘤常伴隨著大量的炎性因子[12]，因此結(jié)直腸癌組織中檢測(cè)出高表達(dá)的C/EBPδ。缺氧是促進(jìn)腫瘤發(fā)生的另一個(gè)重要原因，其反應(yīng)由缺氧誘導(dǎo)因子（HIF）所控制[13]，C/EBPδ在缺氧環(huán)境下可以促進(jìn)Siah2磷酸化，HIF-1α泛素依賴蛋白酶體降解通路受阻，HIF-1α得以穩(wěn)定聚集，轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi)與β亞基形成HIF-1，并與下游基因上的HRE序列結(jié)合，從而啟動(dòng)效應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄[14]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是HIF-1α最重要的靶基因之一，它可以促進(jìn)腫瘤血管再生，從而影響腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移[15]。其次，Siah2還可能通過(guò)Siah2/PHD/HIF-1α通路來(lái)調(diào)控HIF-1α的作用。常氧情況下，脯氨酰羥化酶（PHD）可以將HIF-1α降解，破壞其穩(wěn)定性[16-17]。在惡性腫瘤的缺氧環(huán)境下，Siah2的表達(dá)和活性增加，其通過(guò)泛素化降解途徑促進(jìn)PHD的降解，導(dǎo)致HIF-1α穩(wěn)定性增加并且表達(dá)量增加。

本研究闡明了C/EBPδ與結(jié)直腸癌患者不良預(yù)后的關(guān)系，初步揭示了C/EBPδ在促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制，對(duì)尋找新的結(jié)直腸癌生物標(biāo)志物和基因靶點(diǎn)、開(kāi)發(fā)潛在的治療策略、實(shí)現(xiàn)個(gè)體化治療具有重要意義。