張麗，湯亞飛，李正剛，于琳，藍國兵，佘小漫，何自福

侵染廣東省葫蘆科作物的中國南瓜曲葉病毒的分子特征

張麗，湯亞飛，李正剛，于琳，藍國兵，佘小漫，何自福

廣東省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所/廣東省植物保護新技術重點實驗室，廣州 510640

【】中國南瓜曲葉病毒（squash leaf curl China virus，SLCCNV）是危害葫蘆科作物的主要病毒之一，可侵染南瓜、葫蘆、冬瓜、黃瓜、甜瓜、哈密瓜，嚴重影響葫蘆科作物生產(chǎn)。論文旨在探究SLCCNV廣東分離物的分子特征、親緣關系及其致病性，為SLCCNV的防控提供科學依據(jù)。從廣東省湛江市雷州市和徐聞縣、惠州市博羅縣、河源市源城區(qū)以及佛山市高明區(qū)共采集53份疑似感染菜豆金色黃花葉病毒屬（）病毒的葫蘆科作物病樣，提取總DNA，利用菜豆金色黃花葉病毒屬通用引物AV494/CoPR進行PCR檢測。選取PCR檢測為陽性的樣品進行RCA擴增、酶切、克隆及測序，獲得各分離物基因組A組分（DNA-A）的全長序列；同時利用背向引物PCR擴增、克隆及測序，獲得各分離物基因組B組分（DNA-B）的全長序列。將得到的SLCCNV廣東分離物DNA-A和DNA-B全長序列在NCBI中進行BLAST分析，利用SDT1.2軟件MUSCLE alignment方法對序列相似性作進一步比較分析，應用MEGA7軟件對獲得的SLCCNV廣東分離物及已報道的SLCCNV分離物進行系統(tǒng)發(fā)育分析。采用同源重組技術，構建SLCCNV河源南瓜分離物的侵染性克隆，通過農(nóng)桿菌介導注射接種南瓜子葉，測定其致病性。PCR檢測結果表明，53份疑似病樣中有52份感染了菜豆金色黃花葉病毒屬病毒；進一步從南瓜、葫蘆、冬瓜以及白瓜4種葫蘆科作物病樣中分別克隆獲得8個SLCCNV廣東分離物基因組全序列，DNA-A組分全長大小為2 735—2 739 nt，含有6個ORF，與已報道SLCCNV相同。DNA-B組分大小為2 701—2 721 nt，含有2個ORF，分別編碼與病毒運動相關的蛋白BC1和BV1。序列相似性比較結果顯示，廣東不同分離物DNA-A組分核苷酸序列相似性在94.9%以上，與已報道的SLCCNV其他分離物的相似性在88%以上；所獲得的DNA-B組分核苷酸序列相似性在86.7%以上，與已報道的SLCCNV其他分離物的相似性在83%以上。系統(tǒng)發(fā)育分析結果顯示，8個廣東分離物與來自中國廣西、河南、海南、越南、泰國、菲律賓、印度尼西亞的分離物親緣關系近，同屬于一個分支，而與來自印度的分離物親緣關系較遠。致病性測定結果表明，接種后15 d（dpi），接種南瓜植株的新葉開始出現(xiàn)了皺縮癥狀；30 dpi，接種南瓜植株表現(xiàn)典型的曲葉病癥狀，PCR檢測均為陽性，Western blot檢測進一步驗證了上述結果。在廣東檢測到SLCCNV侵染多種葫蘆科作物，SLCCNV是引起廣東南瓜曲葉病的病原。SLCCNV廣東分離物與廣西、海南等分離物親緣關系近，同屬于一個分支，而與來自印度的分離物親緣關系較遠。

中國南瓜曲葉病毒；廣東?。环肿犹卣?；侵染性克??；致病性

0 引言

【研究意義】中國南瓜曲葉病毒（squash leaf curl China virus，SLCCNV）屬于雙生病毒科（）菜豆金色黃花葉病毒屬（）[1]，由煙粉虱（）以持久性方式進行傳播，不能通過機械摩擦和種子帶毒傳播[2-3]。中國南瓜曲葉病毒主要侵染南瓜、葫蘆、冬瓜、甜瓜等葫蘆科（Cucurbitaceae）作物，引起植株長勢弱、葉片卷曲、皺縮等癥狀，嚴重影響果實的商品價值和產(chǎn)量[1,4-5]，已成為危害葫蘆科作物的重要病毒之一[2-3]。葫蘆科作物在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占有重要的地位，廣東省常年種植有南瓜、冬瓜、黃瓜、節(jié)瓜等多種葫蘆科蔬菜作物，田間病毒病和煙粉虱發(fā)生非常普遍。煙粉虱傳病毒病也成為影響廣東葫蘆科蔬菜產(chǎn)業(yè)發(fā)展的一個制約因子。因此，對危害廣東省葫蘆科作物的SLCCNV的分子特征和致病性開展研究，可為該病毒病的防控提供科學依據(jù)。【前人研究進展】SLCCNV是一種單鏈環(huán)狀DNA病毒，基因組含DNA-A和DNA-B兩個組分，屬于雙組分病毒，基因組大小為2.5—2.8 kb。DNA-A編碼6個ORF，其中病毒鏈上包含2個ORF，分別為（編碼外殼蛋白）和（編碼與病毒移動相關蛋白），互補鏈上包含4—5個ORF，分別為（編碼復制相關蛋白）、（編碼轉錄激活蛋白）、（編碼復制增強蛋白）、（編碼復制或轉錄調(diào)控因子）[6]。DNA-B編碼2個ORF，其中病毒鏈上的編碼核穿梭蛋白，互補鏈上的編碼運動蛋白[7-8]。DNA-A和DNA-B在序列、位置和結構上存在保守的基因間隔區(qū)（intergenic region，IR），也稱為共同區(qū)（common region，CR）。該區(qū)域含有雙生病毒復制起始相關的“TAATATT/AC”9堿基保守序列。SLCCNV最先發(fā)現(xiàn)于20世紀90年代廣西南寧田間表現(xiàn)曲葉癥狀的南瓜病樣中，根據(jù)其外殼蛋白（coat protein，CP）基因序列比較分析鑒定為一個雙生病毒新種[1]。隨后，在越南[9]、印度[10-12]、菲律賓[13]、泰國[14]、巴基斯坦[15]、東帝汶[16]等多國的南瓜上也相繼發(fā)現(xiàn)了SLCCNV；而在我國，目前已在廣西、河南、云南、海南等多省報道有該病毒病的發(fā)生[1,17-22]。已報道的SLCCNV可侵染的自然寄主有南瓜[1]、葫蘆[23-24]、冬瓜[25]、黃瓜[26]、甜瓜[17]、哈密瓜[21]多種葫蘆科作物?！颈狙芯壳腥朦c】2018—2020年，筆者系統(tǒng)調(diào)查了廣東省葫蘆科作物病毒病發(fā)生情況，發(fā)現(xiàn)南瓜、冬瓜、葫蘆以及白瓜等作物的病毒病及煙粉虱發(fā)生均十分普遍，其中有一些植株表現(xiàn)葉片卷曲。利用菜豆金色黃花葉病毒屬病毒（begomoviruses）的簡并引物AV494/CoPR[27-28]進行PCR檢測，證實這些表現(xiàn)葉片卷曲癥狀的病樣中存在begomoviruses。目前文獻中尚未見對危害廣東葫蘆科作物的SLCCNV及其致病性的相關報道?！緮M解決的關鍵問題】研究危害廣東葫蘆科作物的煙粉虱傳雙生病毒種類及其分子特征，明確其致病性，為該病毒病的防控提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

試驗于2018年7月至2021年1月在廣東省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所完成。

1.1 樣品來源

2018—2020年，從廣東省湛江市雷州市、湛江市徐聞縣、惠州市博羅縣、河源市源城區(qū)以及佛山市高明區(qū)葫蘆科蔬菜種植區(qū)隨機采集疑似病樣53份，其中南瓜31份、葫蘆10份、冬瓜7份、白瓜5份，采集的植物樣品帶回實驗室置于-80℃冰箱保存。

1.2 樣品總DNA提取

取植株病葉組織100 mg，利用北京全式金生物技術有限公司的植物DNA提取試劑盒（Easypure Plant Genomic DNA Kit）抽提其總DNA，具體操作按試劑盒說明書進行。DNA沉淀溶解于50 μL TE（10 mmol·L-1Tris-HCl，1 mmol·L-1EDTA，pH 8.0）溶液中。

1.3 PCR檢測

利用菜豆金色黃花葉病毒屬病毒基因部分序列的通用簡并引物AV494：GCCYATRTAYAGRAAGC CMAG/CoPR：GANGSATGHTRCADGCCATATA[27-28]，對53份疑似病樣進行PCR檢測。反應體系：待測病樣總DNA 1 μL（約20 ng），滅菌水9.5 μL，PCR Mixer 12.5 μL（TaKaRa公司），10 μmol·L-1上、下游引物各1 μL，總體積25 μL。反應程序：94℃ 4 min；94℃ 45 s；52℃ 45 s；72℃ 45 s，35個循環(huán)；72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。

1.4 全基因組序列的擴增

1.4.1 DNA-A組分全長序列擴增及克隆 挑取PCR檢測為陽性的病樣總DNA為模板，利用TempliPhiTMRCA Kit（GE Healthcare）進行滾環(huán)擴增（rolling circle amplification，RCA）獲得病毒的基因全長[29]。具體操作步驟：1 μL總DNA樣品（約20 ng）加入5 μL樣品緩沖液（sample buffer），混勻，95℃變性3 min；立即置冰上冷卻；隨后加入5 μL反應緩沖液（reaction buffer）和0.2 μL DNA聚合酶，在30℃反應18—20 h；最后在65℃下加熱10 min以終止反應，RCA產(chǎn)物保存于-20℃?zhèn)溆谩CA擴增產(chǎn)物分別用HⅠ、RⅠ、dⅢ、Ⅰ限制性內(nèi)切酶（Thermo公司）進行酶切。酶切反應體系：RCA產(chǎn)物2 μL、內(nèi)切酶1 μL、10×內(nèi)切酶緩沖buffer 1 μL，總酶切反應體系10 μL。在37℃條件下酶切1 h，之后電泳分析。若酶切出2.7—3.0 kb或1.5 kb左右的條帶，應用瓊脂糖凝膠回收試劑盒（Thermo公司）回收RCA酶切產(chǎn)物，純化后連接到相應酶切處理的pGEM-3Z/5Z載體上，并轉化大腸桿菌菌株Trans-T1，每個平板隨機挑取3個陽性克隆送上海生工生物股份有限公司測序。

1.4.2 DNA-B組分全長序列擴增及克隆 根據(jù)已報道SLCCNV的DNA-B組分序列（GenBank登錄號：KC171649），設計一對背向引物F1/R1，用于擴增DNA-B組分全長，引物序列為F1：CAATGTAGCGTT TACATTTGATTTC/R1：AATAAAGGCGTGTGATAA ATTTATTG，反應體系：待測病樣總DNA 1 μL（約20 ng），滅菌水9.5 μL，PCR Mixer 12.5 μL（TaKaRa公司），10 μmol·L-1上、下游引物各1 μL，總體積25 μL。反應程序：94℃ 5 min；94℃ 1 min；50℃ 1 min；72℃ 3 min，35個循環(huán)；72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。應用瓊脂糖凝膠回收試劑盒（Thermo公司）回收目的大小片段，連接至pMD19-T載體，并轉化大腸桿菌菌株Trans-T1，每個平板隨機挑取3個陽性克隆送上海生工生物股份有限公司測序。

1.5 序列分析

利用DNAStar軟件（DNASTAR Inc，Madison，USA）對測序的基因序列進行拼接，獲得病毒各分離物基因組兩個組分的全長序列，進一步將所獲病毒基因組全長序列在NCBI（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov）中進行BLASTn比對，使用ORF finder進行ORF預測。利用SDT1.2的MUSCLE alignment對序列相似性作進一步詳細分析[30]，使用MEGA7的鄰接法（neighbor joining，NJ）[31]構建系統(tǒng)進化樹，Bootstrapping值為1 000。

1.6 SLCCNV侵染性克隆構建

1.6.1 DNA-A侵染性克隆的構建 以采自河源市源城區(qū)的南瓜樣品HYNG-01為毒源，構建該病毒分離物的侵染性克隆。設計引物分別擴增兩個1.0倍的DNA-A，擴增引物分別為SLA1-F：ATATCGAATTCC TGCAGCCC/SLA1-R：GAAGAAGAAGAACATCAGGCGTAGACGAATTG；SLA2-F：GCCTGATGTTCTTCTTCTTCTTCTGTGGTTGC/ SLA2-R：CTAGAACTAGTGGATCC CCC（下劃線為同源重組序列）。序列經(jīng)測序驗證無誤后，將所獲得的兩個1.0倍的DNA-A通過同源重組技術連接到pGreenⅡ0229載體上，進一步對所得重組質(zhì)粒進行酶切和PCR鑒定，最終獲得DNA-A組分的侵染性克隆pGreenⅡ0229- 2.0A。

1.6.2 DNA-B侵染性克隆的構建 以采自河源市源城區(qū)的南瓜樣品HYNG-01為毒源，設計引物分別擴增兩個1.0倍的DNA-B，擴增引物分別為SLB1-F：ATATCGAATTCCTGCAGCCC/SLB1-R：GCAGACCATACAAAAA CCTCAGCGGATTAGATG；SLB2-F：GAGGTTTTTG TATGGTCTGCTGGTGACAGAAACC/SLB2-R：CTAGAACTAGTGGATCCCCC（下劃線為同源重組序列）。序列經(jīng)測序驗證無誤后，將所獲的兩個1.0倍的DNA-B通過同源重組技術連接到pGreenⅡ0229載體上，對得到的質(zhì)粒進行酶切和PCR鑒定，最終獲得DNA-B組分的侵染性克隆pGreenⅡ0229-2.0B。

1.7 侵染性克隆的接種

將質(zhì)粒pGreenⅡ0229-2.0A和pGreenⅡ0229-2.0B（約0.5 μg）分別轉入100 μL GV3101（含pSoup）農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞（上海唯地生物技術有限公司），28℃培養(yǎng)48 h，對單菌落進行PCR驗證。分別將含有pGreenⅡ0229-2.0A和pGreenⅡ0229-2.0B質(zhì)粒的農(nóng)桿菌單菌落接種于5 mL LB液體培養(yǎng)基中（100 μg·mL-1卡那霉素、25 μg·mL-1利福平），28℃條件下，220 r/min培養(yǎng)過夜，4 000 r/min離心10 min，棄上清，收集沉淀，用農(nóng)桿菌懸浮緩沖液（10 mmol·L-1MES，10 mmol·L-1MgCl2，150 μmol·L-1AS）重懸，將菌液OD600值調(diào)至約1.0。在室溫靜置3 h后對南瓜（品種：蜜本3號）進行注射接種。

1.8 Western blot檢測

取50 mg發(fā)病及健康對照的南瓜植株樣品于2 mL離心管中，經(jīng)液氮速凍及組織研磨機研磨，加入300 μL蛋白上樣緩沖液，充分振蕩混勻。沸水浴10 min，立即置于冰上2 min，12 000 r/min離心10 min，取20 μL上清進行Western blot檢測。Western blot一抗選用與SLCCNV CP氨基酸序列相似性為61.1%的廣東番茄曲葉病毒（tomato leaf curl Guangdong virus，ToLCGuV）CP多克隆抗體，兔二抗購自Sigma Aldrich。

2 結果

2.1 樣品采集及檢測

2018—2020年，對廣東省葫蘆科作物病毒病進行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)部分田間的南瓜、葫蘆、冬瓜、白瓜4種葫蘆科作物葉片表現(xiàn)為葉片皺縮、卷曲等癥狀（圖1），疑似感染了菜豆金色黃花葉病毒屬病毒，分別隨機采集疑似病樣53份（表1）。利用begomoviruses特異簡并引物AV494/CoPR[27-28]進行PCR檢測，52份病樣總DNA中能擴增出大小為570 bp的特異目的片段，對照中未擴增出片段（圖2）。表明除了1份冬瓜病樣外，其他52份病樣中存在菜豆金色黃花葉病毒屬病毒（表1）。

A：葫蘆Cucurbits；B：白瓜White melon；C：冬瓜Wax gourd；D：南瓜 Pumpkin

M：DL 2000 DNA Marker (TaKaRa)；1—15：發(fā)病植株Diseased plants；CK：健康對照樣品Control sample

表1 采集樣品及檢出率

2.2 病毒分離物基因組的克隆與序列分析

2.2.1 病毒基因組結構 對于每一采樣地的每種葫蘆科作物病樣，各挑選一個PCR檢測為陽性的樣品總DNA進行RCA和酶切，利用HⅠ酶切均可以切出一條2.7 kb的條帶，經(jīng)克隆和序列測定，共獲得8個廣東分離物的基因組全長（表2），這8個廣東分離物均含有DNA-A和DNA-B兩個組分。進一步分析發(fā)現(xiàn)，8個分離物基因組結構特征基本一致，都為閉合環(huán)狀結構，且均有一個共同區(qū)（CR），該CR區(qū)含有9堿基保守序列TAATATT/AC[32]。DNA-A組分編碼6個ORF，其中，病毒鏈編碼2個蛋白，編碼外殼蛋白，編碼與移動相關蛋白；互補鏈編碼4個蛋白，編碼復制相關蛋白，編碼轉錄激活蛋白，編碼復制增強蛋白，編碼復制或轉錄調(diào)控因子。DNA-B組分編碼2個ORF，和，編碼與病毒運動相關的蛋白。8個分離物DNA-A和DNA-B組分ORF區(qū)域見表3。

2.2.2 病毒序列相似性分析 序列比對發(fā)現(xiàn)（圖3），8個廣東分離物DNA-A組分之間的序列相似性在94.9%以上。其中，佛山南瓜分離物FSNG和佛山白瓜分離物FSBG的相似性最高，為99.9%，河源南瓜分離物HYNG和湛江徐聞南瓜分離物XWNG的相似性僅次于前者，為99.5%，湛江雷州南瓜分離物LZNG和惠州葫蘆分離物HZHL的相似性為99.4%，惠州南瓜分離物HZNG和惠州冬瓜分離物HZDG的相似性為99.3%。BLAST檢索結果表明，8個廣東分離物的DNA-A與已登錄GenBank的SLCCNV各個分離物DNA-A相似性均大于88%；進一步分析發(fā)現(xiàn)，8個廣東分離物與來自我國不同地區(qū)的10個SLCCNV分離物以及泰國、越南、馬來西亞、菲律賓、印度尼西亞的16個SLCCNV分離物相似性均在92%以上，其中與來自我國不同地區(qū)的分離物相似性最高，在95%以上；而與來自印度的9個分離物的相似性較低，均在92%以下（圖3）。

表2 廣東分離物序列全長和GenBank登錄號

圖3 SLCCNV 8個廣東分離物與其他35個分離物DNA-A序列相似性

8個SLCCNV 廣東分離物DNA-B組分的序列相似性均在86.7%以上，除雷州南瓜分離物LZNG外，其余7個分離物之間的相似性都在94.7%以上?；葜荻戏蛛x物HZDG與惠州葫蘆分離物HZHL相似性最高，為99.8%；佛山南瓜和白瓜分離物FSNG、FSBG與徐聞南瓜分離物XWNG，雷州南瓜分離物LZNG，惠州南瓜、葫蘆和冬瓜分離物HZNG、HZHL、HZDG的相似性都在95%以下；雷州南瓜分離物LZNG與佛山白瓜分離物FSBG的相似性為87.6%。BLAST檢索結果表明，8個廣東分離物的DNA-B與已登錄GenBank的SLCCNV的各個分離物DNA-B相似性均大于83%，其中與來自我國不同地區(qū)的7個分離物的相似性為87%—98%，與泰國、越南、菲律賓、印度尼西亞等7個SLCCNV分離物相似性為83%—92%，而與來自印度的8個分離物和巴基斯坦的2個分離物相似性均在86%以下，分離物LZNG與印度J1分離物（登錄號：MN594505）的相似性最低，僅83.1%（圖4）。

2.2.3 病毒親緣關系分析 為了分析8個廣東分離物DNA-A與SLCCNV其他35個分離物的親緣關系，以泰國番茄黃化曲葉病毒（tomato yellow leaf curl Thailand virus）DNA-A組分（登錄號：MN495605）為外組，利用MEGA7軟件以鄰接法構建了系統(tǒng)進化樹。結果顯示（圖5），8個廣東分離物與來自中國不同地區(qū)、越南、泰國、柬埔寨等23個SLCCNV分離物聚類在一個分支，親緣關系較近；進一步與印度尼西亞、菲律賓和馬來西亞3個SLCCNV分離物形成一個大的分支；而來自印度的9個SLCCNV分離物聚類在另一個分支，8個廣東分離物與其親緣關系較遠。

圖4 SLCCNV 8個廣東分離物與其他24個分離物的DNA-B序列相似性

表3 8個廣東分離物ORF位點

Pu：南瓜Pumpkin；Wx：冬瓜Wax gourd；Mu：甜瓜Muskmelon；Cu：葫蘆Cucurbits；Ch：佛手瓜chayote；Ja：茉莉Jasmine；Ss：西葫蘆Summer squash；Wm：白瓜white melon

SLCCNV DNA-B組分親緣關系分析顯示，8個廣東分離物DNA-B與來自我國不同地區(qū)及越南和泰國等11個SLCCNV分離物親緣關系較近，聚類在一個分支；進一步與印度8個分離物和巴基斯坦2個分離物形成一個大的分支；而2個菲律賓分離物和1個印度尼西亞分離物與上述分離物的親緣關系均較遠（圖6）。

Pu：南瓜Pumpkin；Wx：冬瓜Wax gourd；Mu：甜瓜Muskmelon；Cu：葫蘆Cucurbits；Ja：茉莉Jasmine；Ss：西葫蘆Summer squash；Wm：白瓜white melon；Bg：苦瓜Bitter gourd；Ts：筍瓜True squash

2.3 HYNG-01分離物的致病性測定

將構建的SLCCNV分離物HYNG-01的侵染性克隆按照pGreenⅡ0229-2.0A+pGreenⅡ0229-2.0B（1﹕1）處理注射接種南瓜子葉。結果顯示，15 dpi時，接種的9株南瓜中有3株上部葉片出現(xiàn)了明顯的皺縮、卷曲癥狀；30 dpi時，癥狀更加明顯（圖7-A）。利用檢測DNA-A的引物AV494/CoPR和DNA-B的引物F1/R1對接種植株進行PCR檢測，結果顯示，兩對引物均能從顯癥植株總DNA擴增出預期大小的特異片段，而健康對照植株未擴增出任何條帶（圖7-B）；進一步Western blot結果顯示，顯癥植株中可以檢測到CP條帶，而健康對照植株中沒有檢測到條帶（圖7-C）。這些結果說明，顯癥植株中確實存在SLCCNV。

A：HYNG接種南瓜上的癥狀及健康對照植株 Symptoms of pumpkin infected by isolate HYNG and healthy plant。Mock：未接種對照植株 Control plant without inoculation。右圖為白色方框放大圖 The right figure is magnification of the white frame。B：接種植株PCR檢測結果 PCR detection of inoculated plants。C：Western blot檢測結果Result of western blot detection。Mock：未接種對照植株 Control plant without inoculation。M：Protein marker

3 討論

本文應用RCA擴增及基因克隆方法，從采集于廣東多地葫蘆科作物感染煙粉虱傳雙生病毒的病樣中克隆獲得8個雙生病毒分離物基因組全序列，該基因組為雙組分，其中DNA-A組分序列間相似性在94.9%以上，DNA-B組分序列間相似性86.7%—99.8%，而8個廣東分離物的DNA-A組分與已報道的SLCCNV各分離物序列相似性均在88%以上。根據(jù)國際雙生病毒科分類方案[33]，從廣東葫蘆科作物分離獲得的8個病毒分離物均屬于SLCCNV。

SLCCNV為雙生病毒科菜豆金色黃花葉病毒屬成員。該屬病毒是雙生病毒科中種類最多、分布最廣、危害最重的一個屬，主要通過煙粉虱傳播，廣泛分布于熱帶和亞熱帶地區(qū)，嚴重威脅番茄、辣椒、木薯、南瓜、甘薯、番木瓜等多種重要經(jīng)濟作物的生產(chǎn)安全。早在1994年，洪益國等[1]在廣西南寧市南瓜表現(xiàn)曲葉病植株上檢測到煙粉虱傳雙生病毒，并鑒定出該病毒為SLCCNV，是雙生病毒科一個新種。隨著煙粉虱在我國大范圍的發(fā)生和擴散，也導致SLCCNV在我國廣西、河南、海南等地葫蘆科作物上流行，并造成較大經(jīng)濟損失。本文對危害廣東省葫蘆科作物的煙粉虱傳雙生病毒進行分子鑒定，明確該病毒是SLCCNV，并證明了該病毒是引起廣東南瓜曲葉病的病原，這是首次在廣東發(fā)現(xiàn)SLCCNV。

關于危害廣東葫蘆科作物的SLCCNV來源，目前GenBank上的SLCCNV基因組全序列有24個，系統(tǒng)進化分析結果顯示，來自中國、越南、泰國、菲律賓、印度尼西亞的分離物聚類在一個分支，組成東亞-東南亞組；而來自印度分離物聚類在另一個分支，組成南亞組。進一步分析發(fā)現(xiàn)，來自廣東HYNG、HZNG、HZDG、FSNG、FSBG、XWNG這6個分離物與河南、海南、越南、泰國等地的SLCCNV分離物親緣關系較近，而分離物LZNG、HZHL與廣西分離物親緣關系較近。由此推測，侵染廣東葫蘆科作物的SLCCNV可能有兩個來源，一是海南或越南、泰國，二是廣西；傳入途徑主要是通過調(diào)運葫蘆科作物種苗及其攜帶的煙粉虱帶毒傳入。

農(nóng)桿菌介導的侵染性克隆接種技術是研究雙生病毒致病性的有效手段，被研究者普遍采用。本研究利用同源重組技術成功構建了SLCCNV廣東河源南瓜分離物的侵染性克隆，通過農(nóng)桿菌介導的侵染性克隆注射接種蜜本3號南瓜子葉，明確了SLCCNV廣東河源南瓜分離物DNA-A和DNA-B組分共同侵染南瓜時可以引起與田間癥狀相同的南瓜曲葉病，從而證實了廣東南瓜曲葉病是由雙組分病毒SLCCNV侵染所引起的病害。除南瓜病樣外，本研究也從冬瓜、葫蘆、白瓜3種葫蘆科作物中檢測出SLCCNV，SLCCNV對冬瓜、葫蘆、白瓜以及其他葫蘆科作物的致病性如何，還有待進一步試驗驗證。

SLCCNV首次發(fā)現(xiàn)于中國廣西，除我國海南、云南、河南外，在越南、印度、菲律賓、泰國、巴基斯坦、印度尼西亞等多國多地也已發(fā)生，報道的自然寄主有南瓜、葫蘆、冬瓜、黃瓜、甜瓜、哈密瓜等多種葫蘆科作物。2020年，趙麗玲等[22]在云南的非葫蘆科作物水茄上檢測到該病毒。本研究也首次在白瓜上檢測到SLCCNV?？梢姡琒LCCNV地理分布和寄主范圍正在不斷擴大，危害越來越重。SLCCNV主要靠煙粉虱帶毒近距離傳播和帶毒種苗調(diào)運進行遠距離傳播，對未發(fā)生區(qū)域應加強檢疫，確保種植無毒種苗，從源頭控制該病毒的危害；同時，生產(chǎn)上盡可能選擇抗病品種，控制田間煙粉虱的發(fā)生，以有效地控制該病毒的發(fā)生與流行。

廣東種植有南瓜、冬瓜、節(jié)瓜、黃瓜、絲瓜、葫蘆等多種葫蘆科作物，病毒病是制約葫蘆科作物正常生產(chǎn)的重要因子之一，本實驗室對其相關病原病毒開展了研究，李正剛等[34]明確了侵染廣東連州葫蘆的黃瓜綠斑駁花葉病毒（cucumber green mottle mosaic virus，CGMMV）的分子特征以及其致病性；LI等[35]利用小RNA深度測序技術鑒定出侵染廣東葫蘆科作物的有來源10個不同屬的17種病毒，其中來自雙生病毒科菜豆金色黃花葉病毒屬的病毒僅有SLCCNV一種。本文采用RCA擴增及基因克隆方法，從廣東葫蘆科病樣中僅鑒定出SLCCNV，這一結果與LI等[35]的研究結果一致。雖然目前危害廣東葫蘆科作物的菜豆金色黃花葉病毒屬病毒僅有SLCCNV，但廣東地區(qū)存在其他多種菜豆金色黃花葉病毒屬病毒，加上煙粉虱發(fā)生極為普遍，也容易導致其他病毒種類危害葫蘆科作物。因此，極有必要后續(xù)繼續(xù)對危害廣東省葫蘆科作物的菜豆金色黃花葉病毒屬病毒種類進行監(jiān)測，及時了解病毒種類動態(tài)變化。

4 結論

中國南瓜曲葉病毒（SLCCNV）侵染廣東南瓜、葫蘆、冬瓜、白瓜等葫蘆科作物，是廣東南瓜曲葉病的病原，危害廣東葫蘆科作物的SLCCNV可能來自廣西、海南等地，也可能來自與廣東農(nóng)產(chǎn)品貿(mào)易頻繁的越南、泰國等國家。

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Molecular Characteristic of Squash leaf curl China virus (SLCCNV) Infecting Cucurbitaceae Crops in Guangdong province

ZHANG Li, TANG YaFei, LI ZhengGang, YU lin, LAN GuoBing, SHE XiaoMan, HE ZiFu

Plant Protection Research Institute, Guangdong Academy of Agricultural Sciences/Guangdong Provincial Key Laboratory of High Technology for Plant Protection, Guangzhou 510640

【】Squash leaf curl China virus (SLCCNV) is one of the main viruses infecting Cucurbitaceae crops, which can infect pumpkin, cucurbits, wax gourd, cucumber, muskmelon and honeydew melon, andseverely affect Cucurbitaceaecrop production. The objective of this study is to investigate the molecular characteristics,genetic relationship and pathogenicity of SLCCNV Guangdong isolates, and to provide a theoretical basis for the prevention and control of SLCCNV.【】Fifty-three suspected samples infected bywere collected from Leizhou City and Xuwen county of Zhanjiang City, Boluo County of Huizhou city, Yuancheng district of Heyuan City and Gaoming district of Foshan city, Guangdong province.Total DNA was extracted from all suspected samples, respectively, and used as template for PCR amplification with degenerate begomovirus primers AV494/CoPR. The full-length DNA-A sequence of each isolate was obtained by RCA amplification, gene cloning and sequencing from positive samples by PCR detection. The full-length DNA-B sequence of each isolate was obtained by PCR amplification using designed abutting primers. All full-length sequences of SLCCNV obtained from Guangdong Province were analyzed with BLAST in NCBI. The similarity was compared using Muscle alignment of SDT1.2 software. Phylogenetic analysis between SLCCNV Guangdong isolates and the other SLCCNV isolates was performed using MEGA7. Infectious clone of SLCCNV isolate HYNG was constructed using homologous recombination technology. The infectious clone was inoculated to the cotyledon of pumpkin plants by agro-inoculation.【】The PCR detection result showed that 52 out of 53 suspected samples were infected by. The full-length sequences of eight isolates of SLCCNV from Guangdong province were obtained from pumpkin, cucurbits, wax gourd and white melon, respectively. The full DNA-A sequences of eight isolates ranged from 2 735 to 2 739 nt in size, contained six ORFs, which were identical to the reported SLCCNV. The full DNA-B sequences of eight Guangdong isolates of SLCCNV ranged from 2 701 to 2 721 nt in size, contained two ORFs, encoding proteins associated with viral movement BC1 and BV1,respectively. The similarity analysis of the full sequence showed that the DNA-A of eight isolates from Guangdong shared ＞94.9% nt identities with each other, and shared ＞88% nt identities with other isolates of SLCCNV in GenBank database, and the DNA-B of eight isolates from Guangdong shared ＞86.7% nt identities with each other, and shared ＞83% nt identities with isolates of SLCCNV in GenBank database. Phylogenetic analysis indicated that the eight Guangdong isolates clustered with SLCCNV isolates from Guangxi, Henan, Hainan of China, Vietnam, Thailand, Philippines, Indonesia to form one branch, and the isolates from India clustered to form the other branch. Pathogenicity results showed that the new leaves of pumpkin inoculated with infectious clones of SLCCNV displayed crimple symptoms at 15 days post-inoculation (dpi), and more severe symptoms at 30 dpi. SLCCNV could be detected by PCR from the symptomatic plants, western blot detection further verified the above results.【】SLCCNV was detected infecting Cucurbitaceae crops in Guangdong province. The SLCCNV is the pathogen causing pumpkin curl leaf disease in Guangdong province. The SLCCNV isolates from Guangdong are closely related to isolates from Guangxi, Hainan etc., belonging to the same branch, while it is more distantly related to isolates from India.

squash leaf curl China virus (SLCCNV); Guangdong province; molecular characteristic; infectious clone; pathogenicity

10.3864/j.issn.0578-1752.2021.19.006

2021-03-01；

2021-04-15

國家自然科學基金（32072392）、廣東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系創(chuàng)新團隊（2020KJ110，2020KJ134）、廣州市科技計劃（201904010173）、科技創(chuàng)新戰(zhàn)略專項資金（高水平農(nóng)科院建設）（R2019PY-JX005）

張麗，E-mail：1587650114@qq.com。湯亞飛，E-mail：yf.tang1314@163.com。張麗和湯亞飛為同等貢獻作者。通信作者何自福，Tel：020-87597476；E-mail：hezf@gdppri.com。通信作者佘小漫，Tel：020-87597476；E-mail：lizer126@126.com

（責任編輯 岳梅）