嚴(yán)勇亮，時曉磊，張金波，耿洪偉，肖菁，路子峰，倪中福，叢花

春小麥籽粒主要品質(zhì)性狀的全基因組關(guān)聯(lián)分析

嚴(yán)勇亮1,2，時曉磊2，張金波2，耿洪偉3，肖菁2，路子峰2，倪中福1，叢花2

1中國農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，北京 100193；2新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)作物品種資源研究所，烏魯木齊 830091；3新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實驗室，烏魯木齊 830052

【】挖掘小麥籽粒品質(zhì)性狀顯著相關(guān)的SNP位點(diǎn)及候選基因，并揭示其遺傳機(jī)理，為相關(guān)基因克隆和分子標(biāo)記輔助選擇提供理論依據(jù)。通過檢測298份國內(nèi)外春小麥品種（系）5個環(huán)境下蛋白質(zhì)含量、濕面筋含量、沉降值、淀粉含量、籽粒硬度、出粉率和容重等7個籽粒品質(zhì)性狀的表型，并結(jié)合小麥55K SNP芯片，采用Q+K關(guān)聯(lián)混合模型進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析（genome-wide association study，GWAS）。外引品種（系）、地方品種（系）和育成品種（系）的7個品質(zhì)性狀在不同環(huán)境下的變異系數(shù)分別為1.3%—13.4%、1.1%—18.6%和1.0%—13.9%。其中，外引品種（系）的蛋白質(zhì)含量、濕面筋含量和沉降值的變異系數(shù)均為最高；新疆自育品種的淀粉含量、籽粒硬度和出粉率的變異系數(shù)最大，而新疆地方品種的蛋白質(zhì)含量、濕面筋含量、沉降值、淀粉含量、籽粒硬度和出粉率6個品質(zhì)性狀的變異系數(shù)均介于外引品種（系）和新疆自育品種（系）之間。群體結(jié)構(gòu)分析表明，298份小麥品種（系）可分為3個亞群。其中，亞群1包含128份（43.0%）試驗材料，主要是來自新疆的地方品種（系）；亞群2包含24份（8.1%）試驗材料，主要包括外引品種（系）和新疆地方品種；亞群3包含146份（48.9%）試驗材料，主要是外引品種（系）。連鎖不平衡分析表明A、B和D基因組及全基因組的LD衰減距離分別為10、10、6和8 Mb，依據(jù)全基因組的LD衰減距離，將在物理圖譜上前后8 Mb區(qū)間內(nèi)的位點(diǎn)認(rèn)定為一個候選位點(diǎn)。通過GWAS共檢測到85個與7個小麥籽粒品質(zhì)性狀顯著關(guān)聯(lián)的穩(wěn)定位點(diǎn)（＜0.001）貢獻(xiàn)率為3.7%—10.9%。在1B、1D、2D、3A、3D、4A、4B、5A、6A、6D、7A和7D染色體上均檢測到穩(wěn)定且同時與多個性狀關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)。其中，7A染色體上的AX-109452823—AX-110545157同時與蛋白質(zhì)含量、淀粉含量、濕面筋含量、沉降值、出粉率和籽粒硬度相關(guān)，且同時在4個環(huán)境中均被檢測到。對穩(wěn)定的位點(diǎn)進(jìn)行候選基因發(fā)掘，篩選到10個可能與小麥籽粒品質(zhì)相關(guān)的候選基因。其中（陽離子氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白）、（色氨酸脫羧酶）、和（木葡聚糖內(nèi)轉(zhuǎn)葡糖基酶/水解酶）對調(diào)控小麥籽粒氨基酸含量有重要作用。檢測到85個穩(wěn)定的且與小麥籽粒品質(zhì)性狀關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)，并篩選出10個與小麥籽粒品質(zhì)性狀相關(guān)的候選基因。

小麥；籽粒品質(zhì)性狀；全基因組關(guān)聯(lián)分析；SNP；候選基因

0 引言

【研究意義】小麥?zhǔn)侨蚍N植面積最廣、總產(chǎn)量和營養(yǎng)價值最高、加工食品種類最多的糧食作物[1-4]。隨著中國經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人們生活水平的不斷提高，消費(fèi)者對面制品、保健食品和營養(yǎng)食品的需求不斷增加，并且對小麥相關(guān)產(chǎn)品的品質(zhì)要求也越來越高。在供給側(cè)改革需求和產(chǎn)業(yè)內(nèi)循環(huán)的新時代要求下，在加工品質(zhì)研究的基礎(chǔ)上，營養(yǎng)和健康品質(zhì)已成為小麥品質(zhì)改良的重要方向和重要育種目標(biāo)[5]。蛋白質(zhì)含量、濕面筋含量、淀粉含量和沉降值等都是重要的小麥品質(zhì)性狀。其中，蛋白質(zhì)含量和濕面筋含量是小麥品質(zhì)分級的重要指標(biāo)；淀粉含量對面粉品質(zhì)和加工品質(zhì)具有重要意義[6-8]，研究此類性狀關(guān)鍵基因的挖掘及遺傳機(jī)理對于提高小麥品質(zhì)的遺傳改良具有重要的意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】小麥籽粒品質(zhì)性狀是由多基因控制的復(fù)雜的數(shù)量性狀，關(guān)二旗等[9]通過研究小麥籽粒品質(zhì)與基因型及環(huán)境條件的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)小麥籽粒品質(zhì)主要受基因型控制，但也受環(huán)境條件的影響。在環(huán)境因素中，氣溫和降水量的變化對小麥籽粒品質(zhì)影響尤為明顯。信志紅等[10]研究了小麥籽粒品質(zhì)性狀對氣象因子的響應(yīng)，結(jié)果表明，小麥籽粒品質(zhì)主要受基因型控制，其中，淀粉含量和蛋白質(zhì)含量受環(huán)境影響最小。全基因組關(guān)聯(lián)分析（genome-wide association study，GWAS）和數(shù)量性狀位點(diǎn)（quantitative trait locus，QTL）定位技術(shù)的不斷發(fā)展為小麥籽粒品質(zhì)性狀的分子檢測和相關(guān)數(shù)量性狀的研究提供了有力支撐[6, 11]。較QTL定位來說，用于GWAS的群體構(gòu)建耗時短，群體遺傳背景較為豐富，更容易發(fā)現(xiàn)重要的數(shù)量性狀基因位點(diǎn)，挖掘出更多的功能基因，在小麥數(shù)量性狀研究方面的應(yīng)用越來越廣泛[12]。Li等[13]、ECHEVENY-SOLARTE等[14]、吳云鵬等[15]、郭利建等[6]、黃夢豪等[16]利用RIL群體結(jié)合SSR標(biāo)記、DArT標(biāo)記、SNP芯片等，在1A、1B、1D、2A、2B、2D、3A、3B、3D、4B、5A、5B、6A、6B、7B和7D染色體上共定位到31個與小麥籽粒蛋白質(zhì)含量相關(guān)的QTL，表型貢獻(xiàn)率為0.7%—16.9%。Li等[13]、郭利建等[6]、黃夢豪等[16]利用RIL群體分別結(jié)合SSR標(biāo)記、SNP芯片等，在1A、1B、1D、2A、4A和6B染色體上共定位到20個與濕面筋含量相關(guān)的QTL，表型貢獻(xiàn)率為0.6%—13.0%。ECHEVENY-SOLARTE等[14]以RIL群體結(jié)合包含939個DArT標(biāo)記的圖譜，在1A、1B、2B、3D、4A和6A染色體上共定位到6個與小麥籽粒出粉率相關(guān)的QTL，表型貢獻(xiàn)率為4.9%—19.0%。吳云鵬等[15]、郭利建等[6]、黃夢豪等[16]利用RIL群體結(jié)合SSR標(biāo)記、SNP芯片等，在1B、1D、2A、3A、3B、5A和7D染色體上共定位到11個與小麥籽粒沉降值相關(guān)的QTL，表型貢獻(xiàn)率為2.7%—20.2%。郭利建等[6]、黃夢豪等[16]利用RIL群體結(jié)合SSR標(biāo)記、SNP芯片等，在1A、2A、2D、4B、5A和6A染色體上共定位到10個與小麥籽粒淀粉含量相關(guān)的QTL，表型貢獻(xiàn)率為2.9%—11.2%。【本研究切入點(diǎn)】SNP標(biāo)記具有分布廣、數(shù)量多、定位精度高等特點(diǎn)，是目前最具潛力的分子標(biāo)記[17]。應(yīng)用GWAS挖掘新疆春小麥品質(zhì)性狀相關(guān)基因的研究仍鮮見報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究以298份春小麥品種（系）構(gòu)成的自然群體為材料，利用小麥55K SNP基因芯片分型數(shù)據(jù)結(jié)合蛋白質(zhì)含量、濕面筋含量、沉降值、淀粉含量、籽粒硬度，出粉率和容重7個小麥品質(zhì)相關(guān)性狀表型鑒定結(jié)果，進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，發(fā)掘小麥品質(zhì)相關(guān)性狀的遺傳位點(diǎn)，篩選相關(guān)候選基因，為相關(guān)基因克隆和分子標(biāo)記輔助選擇提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與表型鑒定

以298份春小麥品種（系）為材料，其中包含國外引進(jìn)品種（系）110份、新疆地方種141份、新疆育成種47份，該批材料由國家作物種質(zhì)資源庫——新疆分庫提供。該群體一定程度上反映了不同時期適合新疆地區(qū)種植的小麥種質(zhì)的特性。2018—2020年連續(xù)3個年度將參試材料種植于新疆烏魯木齊市新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院安寧渠基地，分別簡稱為E1、E2和E4；2019—2020年連續(xù)2個年度將參試材料種植于新疆喀什市新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院澤普小麥育種家基地，分別簡稱為E3和E5。采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計，每份材料種植3行，行長2 m，行距20 cm，3次重復(fù)，人工播種。在試驗田四周設(shè)置保護(hù)行。試驗田土壤肥力、灌溉等田間管理基本一致，播種前施基肥25 kg磷酸二銨和5 kg尿素，拔節(jié)期和抽穗期均使用滴灌追肥尿素10 kg和磷酸一銨5 kg。由于地方品種白粉病等發(fā)病率較高，在抽穗期人工噴施己唑醇進(jìn)行防治，噴施2次，間隔10 d。抽穗期小麥植株會出現(xiàn)輕微倒伏現(xiàn)象，使用竹竿進(jìn)行支撐固定以防止出現(xiàn)大面積倒伏。

為保證測量數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，將小麥材料收獲脫粒后，在適宜的環(huán)境保存2個月，采用瑞典波通儀器公司生產(chǎn)的DA-7250近紅外分析儀對蛋白質(zhì)含量、濕面筋含量、沉降值、淀粉含量、籽粒硬度，出粉率和容重7個品質(zhì)相關(guān)性狀進(jìn)行測定，3次重復(fù)，取平均值；5個環(huán)境下各重復(fù)試驗每份材料各品質(zhì)性狀結(jié)果取平均值。

1.2 表型數(shù)據(jù)的統(tǒng)計與分析

采用Excel 2016、SPSS 21.0軟件對蛋白質(zhì)含量、濕面筋含量、沉降值、淀粉含量、籽粒硬度，出粉率和容重7個品質(zhì)相關(guān)性狀進(jìn)行統(tǒng)計分析，并計算各性狀的平均值、標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)。采用SAS軟件進(jìn)行描述性統(tǒng)計分析和方差分析[18]。廣義遺傳力用公式2=σg2/(σg2+σge2+σ?2/n)計算，其中，σg2為遺傳方差，σge2為基因型與環(huán)境互作方差，σ?2為環(huán)境方差，n為環(huán)境數(shù)。

1.3 DNA提取及SNP分型

小麥生長至三葉期時取10株幼苗，將葉片混合后利用改良的CTAB法提取DNA[19]。用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢驗DNA質(zhì)量和濃度。利用小麥基因組55K SNP芯片對供試材料進(jìn)行基因分型。小麥55K SNP芯片分型分析及樣品質(zhì)檢工作由中玉金標(biāo)記（北京）生物技術(shù)股份有限公司完成，共檢測到覆蓋小麥全基因組的53 063個SNP標(biāo)記。采用Tassel 5.0軟件對標(biāo)記信息去冗余，剔除最小等位基因頻率（minor allele frequency，MAF）小于5%和缺失率（missing rate）大于25%的SNP，最終得到23 632個多態(tài)性高、穩(wěn)定性好的優(yōu)質(zhì)SNP標(biāo)記用于后續(xù)關(guān)聯(lián)分析。

1.4 群體結(jié)構(gòu)分析

應(yīng)用Power Maker軟件計算多態(tài)性信息量（polymorphic information content，，=1-Σ2，2表示第個位點(diǎn)的第個等位變異出現(xiàn)的頻率）[20]。從篩選過的標(biāo)記中，選取2 000個最小等位基因頻率大于10%且在染色體上均勻分布的SNP標(biāo)記，利用Structure 2.3.4軟件進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)分析。參數(shù)設(shè)置：Length of Burn-Period=10 000，MCMC Reps after Burn- in=100 000，選擇Admixture Ancestry模型和Dependent Allele Frequencies模式，令K=2—12，每個K值重復(fù)運(yùn)行5次。將不同K值下重復(fù)運(yùn)行5次的結(jié)果上傳至Structure Harvester（http://taylor0.biology.ucla.edu/ struct_harvest/）[21]，使用Tassel 5.0軟件繪制群體結(jié)構(gòu)分析圖。

1.5 連鎖不平衡分析

以位點(diǎn)間的相關(guān)系數(shù)平方（2）作為衡量多態(tài)性位點(diǎn)兩兩之間的連鎖不平衡（linkage disequilibrium，LD）參數(shù)。采用TASSEL5.0軟件計算2，以第95百分位的2值作為閾值估測LD衰減距離。全基因組關(guān)聯(lián)分析中，超過LD衰減距離的2個位點(diǎn)則認(rèn)為是2個不同的位點(diǎn)，在LD衰減距離內(nèi)的位點(diǎn)均視為同一位點(diǎn)。

1.6 全基因組關(guān)聯(lián)分析與候選基因篩選

使用TASSEL5.0軟件中的Q+K混合線性模型對298份試驗材料在5個不同環(huán)境下的8個籽粒品質(zhì)性狀的表型值進(jìn)行性狀與標(biāo)記之間的GWAS，以=1.0×10-3為閾值，判定SNP標(biāo)記與目標(biāo)性狀關(guān)聯(lián)的顯著性[22]，以LD衰減距離為依據(jù)將獲得的SNP轉(zhuǎn)化為與目標(biāo)性狀顯著關(guān)聯(lián)的遺傳位點(diǎn)，將在2個及2個以上的環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的位點(diǎn)視為穩(wěn)定的位點(diǎn)。

將多個環(huán)境中穩(wěn)定出現(xiàn)的SNP標(biāo)記的延伸序列在小麥TGACv1.0數(shù)據(jù)庫（http://plants.ensembl.org/ hmmer/index.html）和NCBI網(wǎng)站（https://www.ncbi.nlm. nih.gov/）進(jìn)行Blast比對，對候選位點(diǎn)進(jìn)行功能注釋[23]。

2 結(jié)果

2.1 小麥籽粒品質(zhì)性狀表型數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析

通過分析298份供試材料在5個不同環(huán)境下的7個小麥籽粒品質(zhì)性狀的表型，發(fā)現(xiàn)國外引進(jìn)品種（系）、新疆地方品種（系）和新疆育成品種（系）的品質(zhì)性狀有一定的差異（表1），3種類型小麥在5個環(huán)境下的變異系數(shù)分別為1.3%—13.4%、1.1%—18.6%和1.0%—13.9%。其中，容重的變異幅度最??；沉降值的變異幅度最大。不同環(huán)境中，國外引進(jìn)品種（系）的蛋白質(zhì)含量、濕面筋含量和沉降值平均值最高，分別為17.9%、40.4%和41.0%；新疆育成品種（系）的淀粉含量、籽粒硬度和出粉率最高，分別為67.4%、63.2%和71.3%；新疆地方品種（系）的上述6個品質(zhì)性狀在5個環(huán)境下均介于國外引進(jìn)品種（系）和新疆育成品種（系）之間；容重在各環(huán)境中的表現(xiàn)不具有一致性，這個性狀可能受環(huán)境的影響較大。供試材料7個品質(zhì)性狀的基因型×年份、環(huán)境×年份和基因型×環(huán)境×年份互作效應(yīng)間差異均達(dá)極顯著水平（表2），說明基因型×年份、環(huán)境×年份和基因型×環(huán)境×年份對于小麥品質(zhì)性狀均有極顯著影響。所測品質(zhì)性狀的遺傳力為0.61—0.95，其中，容重的遺傳力最小；籽粒硬度的遺傳力最大，說明籽容重受環(huán)境因素的影響較大。供試材料7個品質(zhì)性狀5個環(huán)境下的相關(guān)性分析顯示（電子附表1），容重在5個環(huán)境兩兩之間相關(guān)系數(shù)平均值較小，分別為0.48；蛋白質(zhì)含量、濕面筋含量、沉降值、淀粉含量、籽粒硬度和出粉率5個環(huán)境兩兩之間相關(guān)系數(shù)平均值為0.64—0.81，且各性狀5個環(huán)境兩兩之間相關(guān)系數(shù)平均值與遺傳力呈正相關(guān)。

2.2 SNP多態(tài)性及分布

從小麥55K SNP芯片中篩選出具有多態(tài)性的SNP標(biāo)記23 632個，分布在A、B和D基因組染色體上的SNP位點(diǎn)數(shù)目分別為11 559（48.9%）、10 366（43.9%）和1 707（7.2%）個，可以看出，B基因組的多態(tài)性最高；D基因組的多態(tài)性明顯低于A和B 2個基因組的（電子附表2）。在小麥21條染色體中，2A染色體上的標(biāo)記數(shù)目最多（2 033個），4D染色體上的標(biāo)記數(shù)目最少（117個）。3個染色體組的表現(xiàn)為B（0.3119）＞A（0.3036）＞D（0.2319）。全基因組的變異范圍在0.0068—0.3750，平均值為0.3108。其中2A染色體的最大（0.3423），4D染色體的最?。?.2204）。說明選用的標(biāo)記在各染色體組上分布較均勻，且標(biāo)記的等位變異間具有高度的多態(tài)性。

2.3 群體結(jié)構(gòu)分析和連鎖不平衡分析

利用Structure2.3.4軟件對群體遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，對每個可能的K值模擬運(yùn)算，用K值與ΔK值做圖（圖1-A），在K=3處ΔK值最大，曲線變化程度最大。由圖1-B可以看出，供試材料被分為3個亞群，其中亞群1包含128（43.0%）份，主要來自新疆的地方品種（系）；亞群2包含24（8.1%）份，主要包括外引品種（系）和新疆地方種（系）；亞群3包含146（48.9%）份，主要是外引品種（系），還包括新疆育成品種（系）。因此將K=3時生成的Q矩陣，用于性狀與標(biāo)記的關(guān)聯(lián)分析。

考慮連鎖群（linkage group）間連鎖不平衡背景的影響，對連鎖群間的2值進(jìn)行平方根轉(zhuǎn)換，以大于此分布95%的參數(shù)值為閾值，用來截取同一連鎖群內(nèi)LD 的衰減距離[24]，經(jīng)計算得到A、B和D基因組及全基因組的LD衰減距離分別為10、10、6和8 Mb，依據(jù)全基因組的LD衰減距離，將在物理圖譜上前后8 Mb區(qū)間內(nèi)的位點(diǎn)認(rèn)定為一個候選位點(diǎn)（圖2）。

表1 春小麥品質(zhì)性狀表型變異

續(xù)表1 Continued table 1

PRC：蛋白質(zhì)含量；WGC：濕面筋含量；SV：沉降值；STC：淀粉含量；GH：籽粒硬度；FY：出粉率；TW：容重；SD：標(biāo)準(zhǔn)差；CV：變異系數(shù)；E1：2018年澤普環(huán)境點(diǎn)；E2：2019年安寧渠環(huán)境點(diǎn)；E3：2019年澤普環(huán)境點(diǎn)；E4：2020年安寧渠環(huán)境點(diǎn)；E5：2020年澤普環(huán)境點(diǎn)。下同

PRC: Protein content; WGC: Wet gluten content; SV: Sedimentation value; STC: Starch content; GH: Grain hardness; FY: Flour yield; TW: Test weight; SD: Standard deviation; CV: Variable coefficient; E1: 2018 Zepu environmental point; E2: 2019 Anningqu environmental point; E3: 2019 Zepu environmental point; E4: 2020 Anningqu environmental point; E5: 2020 Zepu environmental point. The same as below

***：在＜0.001水平差異顯著 ***: Significant at＜0.001

A：群體的?k值；B：群體結(jié)構(gòu)示意圖 A: Estimation of ?k value in population; B: Group structure diagram

2.4 全基因組關(guān)聯(lián)分析

對298份供試材料在5個環(huán)境下的籽粒品質(zhì)性狀表型結(jié)合55K基因芯片分型的23 632個SNP標(biāo)記進(jìn)行GWAS，并采用MLM（mixed linear model，MLM）Q+K關(guān)聯(lián)混合模型，共有85個位點(diǎn)同時在2個及2個以上環(huán)境中檢測到，分布在除4D和6B染色體外的19條染色體上，是比較穩(wěn)定的位點(diǎn)（表3）。在1B、1D、2D、3A、3D、4A、4B、5A、6A、6D、7A和7D染色體上檢測到穩(wěn)定的、且同時與多個性狀關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)（表4）。其中，7A染色體上的8.91—16.64 Mb和26.47—32.70 Mb區(qū)段、7D染色體上的534.44—540.87 Mb和566.20—566.20 Mb區(qū)段檢測到的穩(wěn)定且同時與多個性狀關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)可作為后續(xù)研究的重點(diǎn)。

圖2 連鎖不平衡衰減圖

表3 春小麥品質(zhì)性狀顯著關(guān)聯(lián)的穩(wěn)定的位點(diǎn)信息

續(xù)表3 Continued table 3

位于1B染色體445.67 Mb檢測到與沉降值相關(guān)的位點(diǎn)；3A染色體510.31—510.60 Mb與蛋白質(zhì)含量相關(guān)的位點(diǎn)；6A染色體5.51—12.28 Mb同時與出粉率、淀粉含量和籽粒硬度相關(guān)的位點(diǎn)；6A染色體12.28—17.54 Mb同時與淀粉含量和蛋白質(zhì)含量相關(guān)的位點(diǎn)；6A染色體17.54—25.80 Mb同時與出粉率和濕面筋含量相關(guān)的位點(diǎn)；7A染色體26.47—32.70 Mb同時與沉降值、淀粉含量、蛋白質(zhì)含量和濕面筋含量相關(guān)的位點(diǎn)；以上6個位點(diǎn)可能為新的位點(diǎn)（表4）。

表4 同時與多個品質(zhì)性狀顯著關(guān)聯(lián)的穩(wěn)定位點(diǎn)信息

加粗的位點(diǎn)為發(fā)現(xiàn)的疑似新的位點(diǎn) The thickened loci is a suspected new loci

2.5 候選基因篩選

將與小麥籽粒品質(zhì)性狀顯著關(guān)聯(lián)的穩(wěn)定位點(diǎn)SNP標(biāo)記序列在普通小麥中國春基因組數(shù)據(jù)庫搜索，獲取基因序列，在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLASTx[25]，共得到10個與小麥籽粒品質(zhì)性狀相關(guān)的基因（表5）。其中，編碼陽離子氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（cationic amino acid transporter，putative）；編碼F-box家族蛋白（F-box family protein）；編碼色氨酸脫羧酶（tryptophan decarboxylase）；編碼富含亮氨酸的重復(fù)受體樣蛋白激酶家族蛋白（leucine-rich repeat receptor-like protein kinase family protein）；編碼組蛋白H2B（Histone H2B）；編碼鋅指狀蛋白（zinc finger protein-like）；編碼含螺旋結(jié)構(gòu)域的蛋白（coiled- coil domain-containing protein)；和編碼木葡聚糖內(nèi)轉(zhuǎn)葡糖基酶/水解酶（xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase）；對應(yīng)結(jié)構(gòu)為ATP依賴性Clp蛋白酶ATP結(jié)合亞基（ATP-dependent Clp protease ATP-binding subunit）。

表5 穩(wěn)定位點(diǎn)篩選獲得候選基因信息

3 討論

3.1 春小麥籽粒品質(zhì)性狀表型變異

小麥?zhǔn)侨蛑饕Z食作物之一。自20世紀(jì)80年代以來，小麥品質(zhì)遺傳改良一直是育種家比較關(guān)注的領(lǐng)域[6]。本研究以298份春小麥為材料，通過近紅外谷物分析儀測定5個環(huán)境下小麥籽粒品質(zhì)性狀。結(jié)果顯示，不同環(huán)境下國外引進(jìn)品種（系）的蛋白質(zhì)含量、濕面筋含量和沉降值均最高；新疆育成品種（系）的淀粉含量、籽粒硬度和出粉率最高，這可能是由于新疆地區(qū)對于小麥品質(zhì)的關(guān)注較晚一些，之前新疆小麥育種家在小麥品種選育時關(guān)注小麥的產(chǎn)量、出粉率等比較直觀的性狀，而忽略了肉眼不可見的品質(zhì)性狀。近些年，小麥品質(zhì)逐漸成為新疆小麥育種的主要目標(biāo)之一。本研究和張金波等[26]研究均表明，近十幾年來，育種家以新疆地方種和國外引進(jìn)品種（系）為親本選育了一批適合在新疆種植的品質(zhì)較優(yōu)的春小麥品種，這些品種的蛋白質(zhì)含量和濕面筋含量較之前主要種植的地方品種都有顯著提高，這也說明了小麥育種家不再單一注重小麥的產(chǎn)量和出粉率，也逐漸關(guān)注小麥品質(zhì)遺傳改良的結(jié)果。本研究與金欣欣等[27]研究均表明，小麥籽粒品質(zhì)性狀主要由遺傳因素控制，因此，可以通過挖掘與小麥品質(zhì)性狀相關(guān)的遺傳位點(diǎn)和候選基因?qū)Υ盒←溸M(jìn)行遺傳改良，為優(yōu)質(zhì)小麥新品種選育提供參考。

3.2 小麥品質(zhì)的生態(tài)適應(yīng)性

本研究表明，7個小麥籽粒品質(zhì)性狀的基因型×年份、環(huán)境×年份和基因型×環(huán)境×年份互作效應(yīng)間差異均達(dá)極顯著水平（表2），說明基因型×年份、環(huán)境×年份和基因型×環(huán)境×年份對于小麥品質(zhì)性狀均有極顯著影響，基因型和環(huán)境是決定小麥品質(zhì)性狀的重要因素；但是，7個品質(zhì)性狀在5個環(huán)境的相關(guān)性分析顯示，容重在5個環(huán)境兩兩之間相關(guān)系數(shù)平均值較?。?.48），同時其遺傳力也相對較?。?.82）；蛋白質(zhì)含量、濕面筋含量、沉降值、淀粉含量、籽粒硬度和出粉率在5個環(huán)境兩兩之間相關(guān)系數(shù)平均值為0.64—0.81，遺傳力為0.89—0.95；且遺傳力大的性狀其5個環(huán)境兩兩之間相關(guān)系數(shù)平均值也較大，說明基因型是決定小麥品質(zhì)性狀的主要因素，這與燕麗等[3]的研究結(jié)果一致。與北疆地區(qū)種植的（E1、E2和E4）小麥品質(zhì)性狀相比，南疆地區(qū)種植的小麥籽粒蛋白質(zhì)含量和濕面筋含量較高；而沉降值、淀粉含量、籽粒硬度、出粉率和容重相對較低，這是由于不同的品質(zhì)性狀對環(huán)境變化的響應(yīng)有所差異所導(dǎo)致的。光照和溫濕度對面筋含量和蛋白質(zhì)含量影響顯著，這與張影全等[28]的研究結(jié)果一致。信志紅等[10]和吳新元等[29]的研究也表明，光照和溫度與小麥籽粒蛋白質(zhì)含量呈正相關(guān)。同一生育期南疆地區(qū)的日照和溫度均高于北疆地區(qū)，這可能是導(dǎo)致南疆地區(qū)小麥籽粒蛋白質(zhì)含量和濕面筋含量較高的主要原因?？梢酝ㄟ^挖掘調(diào)控小麥品質(zhì)的遺傳位點(diǎn)和功能基因，選育出適宜南、北疆地區(qū)種植的春小麥品種，擴(kuò)大優(yōu)質(zhì)小麥的種植面積，以期解決現(xiàn)階段人們高質(zhì)量的飲食需求。

3.3 春小麥品質(zhì)性狀全基因組關(guān)聯(lián)分析

全基因組關(guān)聯(lián)分析在小麥遺傳改良方面的應(yīng)用越來越廣泛[8]。Li等[13]在1B、1D、6B和7D染色體上檢測到與濕面筋含量相關(guān)的位點(diǎn)，與本研究檢測到的位點(diǎn)一致。本研究在7D染色體上的540.87 Mb處還檢測到與濕面筋含量顯著關(guān)聯(lián)的環(huán)境穩(wěn)定位點(diǎn)。黃夢豪等[16]、楊林等[30]也在7D染色體上檢測到與小麥品質(zhì)性狀相關(guān)的位點(diǎn)，進(jìn)一步驗證了7D染色體對于調(diào)控小麥品質(zhì)性狀的重要作用。本研究與吳云鵬等[15]均在3A和3B染色體上檢測到與蛋白質(zhì)含量相關(guān)的位點(diǎn)，在1B、1D和3B染色體上檢測到與沉降值相關(guān)的位點(diǎn)，表明這些染色體上可能存在調(diào)控小麥籽粒蛋白質(zhì)含量和沉降值的基因。本研究和Lou等[31]在2B染色體上18.94—24.13 Mb這一區(qū)段內(nèi)同時檢測到與小麥籽粒品質(zhì)性狀相關(guān)的位點(diǎn)，說明2B染色體的這一區(qū)段在調(diào)控小麥籽粒品質(zhì)性狀方面起重要作用，可以作為下一步研究的重點(diǎn)。本研究與楊林等[30]、沈瑋囡等[32]均在1B和3B染色體上檢測到與小麥籽粒品質(zhì)性狀相關(guān)的位點(diǎn)。本研究結(jié)合前人的研究結(jié)果篩選出多個與小麥籽粒品質(zhì)性狀相關(guān)的相同位點(diǎn)和重要染色體區(qū)段，這些位點(diǎn)具有深入研究的價值。

Lou等[31]在3A染色體上的484.64 Mb處檢測到與蛋白質(zhì)含量相關(guān)的穩(wěn)定位點(diǎn)。本研究在3A染色體的510.31—510.60 Mb區(qū)段檢測到與蛋白質(zhì)含量相關(guān)的穩(wěn)定位點(diǎn)。這兩個位點(diǎn)在染色體上的距離為25.67—25.96 Mb，可以確定不是同一位點(diǎn)，本研究發(fā)現(xiàn)的這一位點(diǎn)可能是新的控制小麥籽粒品質(zhì)性狀的遺傳位點(diǎn)。本研究在3B染色體上的547.59 Mb處檢測到的位點(diǎn)與Lou等[31]在3B染色體554.03 Mb處檢測到的位點(diǎn)在染色體上的距離為6.44 Mb，根據(jù)全基因組LD衰減距離（8 Mb）可以確定這兩個位點(diǎn)為同一位點(diǎn)；但位于1B染色體上的445.67 Mb區(qū)段與沉降值相關(guān)的位點(diǎn)與Lou等[31]在1B染色體上的471.52 Mb處檢測到的位點(diǎn)在染色體上的距離為25.85 Mb，也可以確定不是同一位點(diǎn)，同樣也未見相關(guān)報道，可能是新的位點(diǎn)。本研究與郭利建等[6]、楊林等[30]在5A和6A染色體上檢測到的與蛋白質(zhì)含量、濕面筋含量等相關(guān)的位點(diǎn)。其中本研究在6A染色體上的3.80—25.80 Mb區(qū)間內(nèi)發(fā)現(xiàn)多個穩(wěn)定的位點(diǎn)，且未見有關(guān)于這一區(qū)段內(nèi)控制品質(zhì)性狀位點(diǎn)報道。Lou等[31]在7A染色體的6.85 Mb處檢測到與淀粉含量相關(guān)的位點(diǎn)與本研究在7A染色體上的8.91—12.44 Mb處檢測到的與出粉率和籽粒硬度相關(guān)的位點(diǎn)在染色體上的距離為2.06—5.59 Mb，根據(jù)全基因組LD衰減距離（8 Mb）可以確定這兩個位點(diǎn)為同一位點(diǎn)。本研究在7A染色體上的26.47—32.70 Mb區(qū)段檢測到的與沉降值、淀粉含量、蛋白質(zhì)含量和濕面筋含量相關(guān)的位點(diǎn)未見報道，這一位點(diǎn)可能是新的控制小麥品質(zhì)性狀的遺傳位點(diǎn)。

3.4 候選基因預(yù)測

將全基因組關(guān)聯(lián)分析檢測到的與小麥籽粒品質(zhì)性狀顯著關(guān)聯(lián)、且穩(wěn)定的位點(diǎn)及重要區(qū)段進(jìn)行候選基因篩選，在7A染色體上的484.39—489.95 Mb區(qū)段和7D染色體上的534.44—540.87 Mb區(qū)段處篩選出與籽粒硬度相關(guān)的候選基因和與蛋白質(zhì)含量相關(guān)的候選基因編碼木葡聚糖內(nèi)轉(zhuǎn)葡糖基酶/水解酶（xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase，XTH）。前人研究表明，XTH基因在植株體內(nèi)表現(xiàn)出非常復(fù)雜的功能[33]。它參與了種子萌發(fā)[34]、根系建成[35]、花形成開放以及果實發(fā)育成熟[36]等重要生物學(xué)過程。關(guān)于XTH基因在小麥籽粒品質(zhì)方面的作用還需進(jìn)一步研究。本研究還篩選出編碼F-box家族蛋白（）、富含亮氨酸的重復(fù)受體樣蛋白激酶家族蛋白（）、鋅指狀蛋白（）等結(jié)構(gòu)的候選基因，這些基因在調(diào)控小麥抗逆性方面有重要作用[37-39]。關(guān)于這些基因在品質(zhì)方面的作用，還需要進(jìn)一步研究。小麥中含有多種人體必需氨基酸，同時，小麥籽粒中賴氨酸等氨基酸的含量對小麥的營養(yǎng)品質(zhì)有重要作用[40]，本研究在4A染色體上的594.90—598.79 Mb區(qū)段篩選到編碼陽離子氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（）的候選基因；在7A染色體上的26.47—32.70 Mb區(qū)段內(nèi)篩選到編碼色氨酸脫羧酶（）的候選基因；在6A染色體上的5.51—12.28 Mb區(qū)段內(nèi)篩選到編碼富含亮氨酸的重復(fù)受體樣蛋白激酶家族蛋白（）的候選基因；這些候選基因可能與小麥籽粒中氨基酸含量有關(guān)，需要進(jìn)一步對其進(jìn)行深入研究，為小麥品質(zhì)改良和新品種選育奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

通過對298份春小麥品種（系）3年5點(diǎn)的7個籽粒品質(zhì)性狀結(jié)合55K SNP基因芯片進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)85個穩(wěn)定的顯著關(guān)聯(lián)位點(diǎn)，包括18個與多個性狀關(guān)聯(lián)的多效性位點(diǎn)；在1B（445.67 Mb）、3A（510.31—510.60 Mb）、6A（5.51—12.28 Mb、12.28—17.54 Mb和17.54—25.80 Mb）和7A（26.47—32.70 Mb）染色體上的位點(diǎn)可能是新的品質(zhì)性狀位點(diǎn)。

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Genome-Wide Association Study of Grain Quality Related Characteristics of Spring Wheat

YAN YongLiang1,2, SHI XiaoLei2, ZHANG JinBo2, GENG HongWei3, XIAO Jing2, LU ZiFeng2, NI ZhongFu1, CONG Hua2

1College of Agronomy and Biotechnology, China Agricultural University, Beijing 100193;2Institute of Crop Germplasm Resources, Xinjiang Academy of Agricultural Sciences, Urumqi 830091;3College of Agriculture, Xinjiang Agricultural University/Key Laboratory of Agricultural Biological Technology, Urumqi 830052

【】Identify SNPs and candidate genes that are significantly related to wheat grain quality traits, and reveal their genetic mechanism. 【】In this study, 298 introduced varieties (lines), Xinjiang landrace (lines) and Xinjiang bred varieties (lines) were used for an association population. Seven grain quality traits, including protein content (PRC), wet gluten content (WGC), sedimentation value (SV), starch content (STC), grain hardness (GH), flour yield (FY) and test weight (TW), were measured under five environments. Based on phenotypes of seven quality traits and genotypes of 55K SNP markers in this population, the Q+K association mixed model was used for genome-wide association analysis to obtain significantly associated SNP loci.【】The coefficients of variation of the seven grain quality traits of introduced varieties (lines), landraces and bred varieties (lines) under different environments were 1.3%-13.4%, 1.1%-18.6% and 1.0%-13.9%, respectively. Among them, the protein content, wet gluten content and sedimentation value of introduced varieties (lines) have the highest coefficient of variation (CV); Xinjiang bred varieties (lines) have the largest CV of starch content, grain hardness and flour yield. Whereas, for other six grain quality traits, including protein content, wet gluten content, sedimentation value, starch content, grain hardness, and the coefficients of variation of Xinjiang landraces are all between those of the introduced varieties (lines) and Xinjiang bred varieties (lines). Population structure analysis showed that 298 wheat varieties (lines) can be divided into 3 subgroups. Subgroup 1 contains 128 (43.0%) the materials mainly from landrace (lines); Subgroup 2 has 24 (8.1%) materials, mainly including introduced varieties (lines) and landraces; Subgroup 3 contains 146 (48.9%) materials, mainly introduced varieties (lines). The linkage disequilibrium analysis showed that the LD attenuation distances of the A, B and D genomes and the whole genome respectively were 10, 10, 6 and 8 Mb, according to the LD attenuation distance of the whole genome, the loci in the 8 Mb interval after the physical map were identified as a candidate loci. A total of 85 loci were simultaneously detected in two or more environments, that were significantly associated with 7 wheat grain quality traits detected by GWAS, with a contribution rate of 3.7%-10.9%. Stable SNPs associated with multiple traits were detected on chromosomes 1B, 1D, 2D, 3A, 3D, 4A, 4B, 5A, 6A, 6D, 7A and 7D. Among them, AX-109452823-AX-110545157 on chromosome 7A is related to protein content, starch content, wet gluten content, sedimentation value, flour yield and grain hardness, and was detected across four environments. Candidate genes at stable loci associated with multiple traits were searched, and 10 candidate genes that might be related to wheat grain quality were screened. Among them,(cationic amino acid transporter),(tryptophan decarboxylase),,(xyloglucan endoglucosylase/hydrolase) play important roles in regulating the amino acid content in wheat grains.【】The 85 loci were simultaneously detected in two or more environments, and 10 candidate genes related to wheat grain quality traits were predicted.

wheat; quality traits; genome-wide association analysis; SNP; candidate genes

10.3864/j.issn.0578-1752.2021.19.001

2021-02-01；

2021-03-17

國家自然科學(xué)基金（31660389，U1403185）、烏魯木齊市科學(xué)技術(shù)計劃（Z161210002）

嚴(yán)勇亮，E-mail：yanliang198279@163.com。通信作者叢花，E-mail：huacong0924@126.com

（責(zé)任編輯 李莉）