付超然，李亞子，吳涵，趙丹?，郭巍,2?，郭曉昌

1河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，河北保定 071001；2中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，北京 100081

0 引言

【研究意義】甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）屬鱗翅目（Lepidoptera）夜蛾科（Noctuidae），是一種世界性分布的多食性重要農(nóng)業(yè)害蟲，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中通常采用化學(xué)防治，以及以蘇云金桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）為代表的生物制劑等進(jìn)行防治[1]。近年來利用免疫系統(tǒng)對(duì)昆蟲進(jìn)行生物防治的概念逐漸被提出，因此研究甜菜夜蛾的腸道免疫系統(tǒng)對(duì)其進(jìn)行生物防控具有重要意義。Duox-ROS系統(tǒng)是昆蟲調(diào)節(jié)腸道微生物動(dòng)態(tài)平衡的重要免疫機(jī)制，然而，甜菜夜蛾雙重氧化酶（SeDuox）的生物學(xué)功能及其對(duì)病原微生物的免疫響應(yīng)尚不清楚。以甜菜夜蛾為研究對(duì)象，研究SeDuox在宿主腸道免疫調(diào)控中的作用，以及Bt對(duì)昆蟲免疫基因的影響，可為甜菜夜蛾的綜合防控提供新的思路和作用靶標(biāo)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】昆蟲是世界上種類最豐富、數(shù)量龐大且分布廣泛的動(dòng)物[2]，在生命過程接觸到很多病原體，主要通過昆蟲攝食進(jìn)入體內(nèi)，昆蟲通常依靠先天性免疫系統(tǒng)或腸道免疫系統(tǒng)抵御病原微生物的入侵[3-5]，腸道是昆蟲機(jī)體免疫反應(yīng)的第一場(chǎng)所[6]。同時(shí)，昆蟲腸道上棲息著大量有利于宿主生長(zhǎng)發(fā)育繁殖等功能的腸道共生微生物[7-8]。昆蟲具有獨(dú)特的腸道免疫防御系統(tǒng)，防御腸道病原微生物的同時(shí)又能維持腸道共生菌動(dòng)態(tài)平衡，主要包括物理屏障、Imd信號(hào)通路產(chǎn)生的抗菌肽AMP以及Duox介導(dǎo)的活性氧（ROS）系統(tǒng)[9-10]。其中，Duox介導(dǎo)產(chǎn)生的ROS具有殺菌活性，是昆蟲腸道上皮細(xì)胞中重要的殺滅病原微生物的效應(yīng)分子[11-13]。Duox作為煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶家族成員之一，其功能比較保守[14]。Duox屬于跨膜蛋白，通常包括鐵還原酶結(jié)構(gòu)域（Ferric）、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸結(jié)構(gòu)域（NAD）、N-端鈣離子結(jié)合域（EFH）、黃素腺嘌呤二核苷酸結(jié)構(gòu)域（FAD）和過氧化物酶結(jié)構(gòu)域[15]。目前，在果蠅、岡比亞按蚊（Anopheles gambiae）等昆蟲中證明Duox-ROS系統(tǒng)在維持腸道微生物穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。HA等研究發(fā)現(xiàn)雙重氧化酶敲除型Duox-KD果蠅，在腸道感染條件下不能誘導(dǎo)產(chǎn)生ROS，病原微生物不能被有效清除，說明在果蠅腸道上皮細(xì)胞中殺滅病原微生物的效應(yīng)分子 ROS是由Duox介導(dǎo)產(chǎn)生的，從而維持果蠅腸道微生物動(dòng)態(tài)平衡[12-13]。當(dāng)橘小實(shí)蠅（Bactrocera dorsalis）取食病原菌和腸道共生菌后，導(dǎo)致 BdDuox表達(dá)量和 ROS水平顯著上調(diào)，利用RNAi沉默BdDuox表達(dá)，致使腸道細(xì)菌群落穩(wěn)態(tài)紊亂，表明BdDuox在橘小實(shí)蠅腸道免疫調(diào)控中發(fā)揮了重要作用[16]。家蠶（Bombyx mori）感染家蠶微孢子蟲后能夠誘導(dǎo)基因持續(xù)上調(diào)表達(dá)，同時(shí)細(xì)胞內(nèi)ROS含量增加，說明BmDuox可能參與宿主腸上皮對(duì)家蠶微孢子蟲的免疫反應(yīng)[17]。WEI等研究發(fā)現(xiàn)，球孢白僵菌（Beauveria bassiana）通過體壁侵染斯氏按蚊（Anopheles stephens）后，腸道細(xì)菌數(shù)量顯著增多，造成蚊蟲腸道菌群失衡，并顯著抑制中腸Duox和抗菌肽相關(guān)基因的表達(dá)[18]。最新研究發(fā)現(xiàn)，Bt可以激活小菜蛾（Plutella xylostella）Toll、IMD、JNK 等多條免疫信號(hào)通路[19]。細(xì)菌分泌的尿嘧啶可以激活 Duox介導(dǎo)產(chǎn)生 ROS，然而與宿主長(zhǎng)期協(xié)同進(jìn)化的腸道共生菌喪失分泌尿嘧啶的能力，只有外來病原微生物才可以分泌尿嘧啶，宿主可能是通過此方式將腸道共生菌和病原菌區(qū)分開來，以此維持其腸道微生物群落穩(wěn)態(tài)平衡[20]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】雙重氧化酶（Duox）在一些昆蟲腸道免疫中發(fā)揮重要作用，但其在甜菜夜蛾腸道免疫調(diào)控中的作用機(jī)理，以及Bt與腸道免疫基因的相互作用關(guān)系尚未明確?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以甜菜夜蛾為研究對(duì)象，通過基因克隆獲得SeDuox全長(zhǎng)基因并進(jìn)行序列分析，利用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR（RT-qPCR）方法進(jìn)行SeDuox時(shí)空表達(dá)分析。RNAi技術(shù)沉默 SeDuox，研究 SeDuox生物學(xué)功能及其對(duì)腸道菌群的調(diào)控作用，并分析Bt GS36對(duì)SeDuox及抗菌肽相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控，以期明確SeDuox在宿主腸道免疫調(diào)控中的作用，為甜菜夜蛾綠色防控提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2018年11月至2020年11月在河北農(nóng)業(yè)大學(xué)昆蟲分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室完成。

1.1 材料

供試甜菜夜蛾為河北農(nóng)業(yè)大學(xué)害蟲生物防治實(shí)驗(yàn)室人工飼養(yǎng)。飼養(yǎng)條件：溫度（26±1）℃，培養(yǎng)箱內(nèi)的培養(yǎng)相對(duì)濕度保持在（65±15）%，光周期為14L﹕10D。

Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)于TransGen公司；大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)于TaKaRa公司；大腸桿菌DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)于Invitrogen公司；Bt GS36由本實(shí)驗(yàn)室保存。pEASY-Blunt克隆載體購(gòu)于 TransGen公司；pFastBacTMHTA購(gòu)自Invitrogen公司。

草地貪夜蛾（Spodoptera frugiperda）細(xì)胞系（Sf9）由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 RNA的提取與cDNA的合成

利用 RNA提取試劑盒（TIAGEN公司）提取甜菜夜蛾不同發(fā)育時(shí)期（卵、1—5齡幼蟲、雄蛹、雌蛹）及4齡幼蟲不同組織（圍食膜、血淋巴、脂肪體、馬氏管、中腸和表皮）的總 RNA，瓊脂糖凝膠電泳（TIAGEN公司）和微量分光光度計(jì)（Eppendorf公司）檢測(cè) RNA的質(zhì)量和濃度。利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA。

1.3 SeDuox全長(zhǎng)基因的克隆

根據(jù)甜菜夜蛾中腸轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫獲得 SeDuox全長(zhǎng)基因序列，利用DNAMAN V6.0軟件設(shè)計(jì)基因特異引物SeDuox-F和SeDuox-R，引物序列見表1。以甜菜夜蛾幼蟲中腸cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，PCR產(chǎn)物純化回收后連接到pEASY-Blunt克隆載體并轉(zhuǎn)入Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)過 PCR和酶切鑒定獲得的陽性克隆質(zhì)粒送到華大公司（BGI）測(cè)序。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.4 SeDuox序列分析

對(duì)SeDuox序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，通過DNAMAN V6.0軟件預(yù)測(cè)開放閱讀框、編碼氨基酸、蛋白分子量和等電點(diǎn)等；通過NetNGlyc1.0 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/）和 NetOGlyc 3.1 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc-3.1/）分別進(jìn)行N-糖基化位點(diǎn)和O-糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)；通過SignalP 5.0 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)；通過TMHMM（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）和 SMART（http://smart.embl-heidelberg.de/）在線軟件對(duì) SeDuox 蛋白跨膜區(qū)和結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)；利用ClustalX和MEGA_X軟件，采用鄰接法（neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 SeDuox-OM片段的克隆與細(xì)胞表達(dá)

SeDuox為多次跨膜蛋白，針對(duì)膜外部分SeDuox-OM（第31—589位氨基酸）進(jìn)行基因克隆與細(xì)胞表達(dá)。根據(jù)SeDuox-OM序列設(shè)計(jì)帶有酶切位點(diǎn)的擴(kuò)增引物，分別在其上游與下游加入BamH I和EcoR I酶切位點(diǎn)，引物名稱為 SeDuox-OM-F和 SeDuox-OM-R，引物序列見表 1。利用上述引物，以純化的SeDuox的PCR產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。按照Bacto-Bac? Baculovirus Expression Systems（Invitrogen 公司）說明書，利用Bac to Bac 昆蟲桿狀表達(dá)系統(tǒng)在昆蟲細(xì)胞Sf9中表達(dá)SeDuox-OM蛋白。

1.6 SeDuox時(shí)空表達(dá)分析

采用 RT-qPCR方法分析甜菜夜蛾不同發(fā)育時(shí)期和不同組織中SeDuox的轉(zhuǎn)錄水平。所用內(nèi)參基因和目的基因的引物名稱分別為SeActin-F和SeActin-R，SeqPCR-F和SeqPCR-R，引物序列見表1。以cDNA為模板，進(jìn)行RT-qPCR。PCR反應(yīng)體系（20 μL）：SYBR Premix Ex TaqTM10 μL，目的基因 cDNA 1 μL，上下游引物各1 μL，加ddH2O補(bǔ)足體系至20 μL。每個(gè)樣品進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。2-ΔΔCt法分析SeDuox的相對(duì)表達(dá)量，計(jì)算公式：

利用SPSS軟件進(jìn)行差異顯著性分析（t-test，n=3，P＜0.01或0.05）。

1.7 SeDuox的RNAi效應(yīng)

以甜菜夜蛾幼蟲中腸cDNA為模板，利用T7 Ribo MAXTMExpress RNAi System（Promega）試劑盒合成SeDuox雙鏈RNA（dsSeDuox），綠色熒光蛋白（GFP）為對(duì)照，分別以 dsSeDuox-T7-F和 dsSeDuox-R，dsSeDuox-F和 dsSeDuox-T7-R；dsGFP-T7-F和dsGFP-R，dsGFP-F和dsGFP-T7-R為引物PCR擴(kuò)增獲得合成dsRNA的正、反向模板，引物序列見表1，經(jīng) 1.2%瓊脂糖凝膠電泳和微量分光光度計(jì)檢測(cè)dsRNA純度和濃度。選取甜菜夜蛾4齡1 d幼蟲為試驗(yàn)對(duì)象，用微量注射器將 2 μL dsSeDuox（8 μg·μL-1）從幼蟲第4—5腹節(jié)處緩慢注入至血腔內(nèi)，注入方向與蟲體血淋巴流動(dòng)方向一致，以注射dsGFP為對(duì)照。注射完成后，幼蟲于正常條件飼養(yǎng)，分別于48 h和72 h時(shí)解剖甜菜夜蛾幼蟲中腸組織，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，RT-qPCR檢測(cè)SeDuox基因沉默情況，反應(yīng)體系及分析方法同1.6。

1.8 SeDuox RNAi對(duì)腸道菌群密度的影響

解剖注射dsSeDuox后48、72 h的甜菜夜蛾幼蟲含內(nèi)容物的腸道組織，利用血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒（TIAGEN公司）提取腸道細(xì)菌總DNA，RT-qPCR檢測(cè)SeDuox干擾后腸道細(xì)菌總量、腸道有益菌蒙氏腸球菌（Enterococcus mundtii）及腸道潛在致病菌蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）總量變化，引物名稱分別為16S-F和16S-R，Es-F和Es-R，Bc-F和Bc-R，引物序列見表1，反應(yīng)體系及分析方法同1.6。

1.9 Bt GS36對(duì)SeDuox及抗菌肽基因的表達(dá)調(diào)控

選取對(duì)甜菜夜蛾高活性的 Bt GS36菌株，利用RT-qPCR方法分析甜菜夜蛾幼蟲對(duì)Bt的免疫響應(yīng)。將Bt GS36接種于LB液體培養(yǎng)基，37℃，220 r/min過夜培養(yǎng)。第2天將過夜培養(yǎng)的Bt GS36按1﹕100的比例接種于1/2 LB液體培養(yǎng)基，30℃，220 r/min，38 h時(shí)，收集孢晶混合物，保存于-80℃冰箱備用。

將 100 μL Bt GS36 菌液（180 μg·mL-1）均勻涂布于飼料表面，自然風(fēng)干后，將經(jīng)過12 h饑餓處理的甜菜夜蛾3齡1 d幼蟲放在飼料上。每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)15頭試蟲，以表面涂布清水的飼料為對(duì)照。每隔 12 h解剖收集甜菜夜蛾腸道，RT-qPCR分析SeDuox及抗菌肽基因表達(dá)量的變化，抗菌肽基因引物為Attacin-F和Attacin-R，Definsin-F和Definsin-R，PGRP-F和PGRP-R，引物序列見表1，反應(yīng)體系及分析方法同1.6。

2 結(jié)果

2.1 SeDuox序列分析

SeDuox（GenBank登錄號(hào)：MN966681）開放閱讀框?yàn)? 497 bp，編碼1 498個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)蛋白分子量為171.62 kD，等電點(diǎn)為8.81。NetOGlyc 3.1 Server和 NetNGlyc1.0 Server預(yù)測(cè)有 12個(gè) O-糖基化位點(diǎn)（60TRKT、63TPAS、66SYAD、84TLSK、165SPNS、212TKRV、571SKLP、1121SDFR、1425SRTS、1427TSMF、1428SMFT、1431TGLK），6個(gè)N-糖基化位點(diǎn)（101NRTA、198NGSL、540NSTS、569NASK、743NLTQ、1483NRTR）（圖1）。TMHMM和SMART在線軟件預(yù)測(cè)SeDuox蛋白包括3個(gè)跨膜區(qū)，含有過氧化物酶結(jié)構(gòu)域、N-端鈣離子結(jié)合域、鐵還原酶結(jié)構(gòu)域、黃素腺嘌呤二核苷酸結(jié)構(gòu)域、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸結(jié)構(gòu)域（圖2）。

2.2 SeDuox系統(tǒng)發(fā)育分析

通過NCBI Blast分析比對(duì)可知SeDuox氨基酸序列與近緣物種草地貪夜蛾（GenBank登錄號(hào)：XP_035439968.1）和斜紋夜蛾（Spodoptera litura）（GenBank登錄號(hào)：XP_022813998.1）Duox氨基酸序列相似性最高，分別為91.31%和91.51%。從NCBI數(shù)據(jù)庫中下載22種昆蟲的Duox氨基酸序列，利用ClustalX軟件與 SeDuox的氨基酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)，MEGA_X軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）發(fā)現(xiàn)SeDuox與斜紋夜蛾、草地貪夜蛾的Duox相似度最高，表明 Duox在這幾種昆蟲中同源性較高，親緣關(guān)系較近。

2.3 SeDuox及SeDuox-OM的克隆與細(xì)胞表達(dá)

PCR擴(kuò)增獲得SeDuox及其膜外編碼基因SeDuox-OM（第31—589位氨基酸），大小分別為4 497和1 677 bp（圖4-A、4-B）。

構(gòu)建的重組質(zhì)粒 pFastBacTMHTA-SeDuox-OM，經(jīng)雙酶切鑒定載體片段和基因片段大小分別為4 856和1 677 bp（圖5-A）。將鑒定正確的重組質(zhì)粒pFastBacTMHTA-SeDuox-OM轉(zhuǎn)化至DH10 Bac感受態(tài)細(xì)胞中，挑取單克隆，經(jīng)PCR鑒定，獲得條帶大小為4 107 bp，表明重組病毒 Bacmid-SeDuox-OM 構(gòu)建成功（圖5-B）。鑒定正確的Bacmid-SeDuox-OM經(jīng)純化后，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞Sf9。取轉(zhuǎn)染后72 h的P3病毒上清進(jìn)行Western blot鑒定。結(jié)果表明重組病毒Bacmid-SeDuox-OM成功轉(zhuǎn)染昆蟲Sf9細(xì)胞，并表達(dá) SeDuox-OM 蛋白，分子量約為 80 kD（圖5-C）。

2.4 SeDuox表達(dá)模式分析

利用RT-qPCR分析SeDuox在甜菜夜蛾4齡幼蟲不同組織（圍食膜、馬氏管、表皮、血淋巴、脂肪體、中腸）和不同發(fā)育時(shí)期（卵、1—5齡幼蟲、雌蛹、雄蛹）的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，SeDuox在甜菜夜蛾各組織中均有表達(dá)，其中在圍食膜和中腸表達(dá)量較高（圖6-A）。不同發(fā)育時(shí)期中在卵期表達(dá)量最高，1齡幼蟲期表達(dá)量最低，之后隨著齡期增長(zhǎng)呈先升高后降低的趨勢(shì)（圖6-B）。

2.5 SeDuox的RNAi效應(yīng)

根據(jù)試劑盒說明書合成dsSeDuox和dsGFP，利用微量分光光度計(jì)檢測(cè)dsSeDuox和dsGFP的濃度。用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，電泳結(jié)果顯示dsSeDuox和dsGFP條帶大小分別為453和420 bp（圖7），可以用于后續(xù)試驗(yàn)。向甜菜夜蛾4齡幼蟲體內(nèi)注射 dsRNA進(jìn)行 SeDuox基因沉默，相比于dsGFP對(duì)照組，甜菜夜蛾被注射dsRNA后的48 h和72 h，SeDuox表達(dá)量分別下調(diào)了62.08%和74.94%（圖8），實(shí)現(xiàn)了 SeDuox的沉默。

2.6 SeDuox基因沉默對(duì)腸道菌群的影響

注射dsSeDuox 48 h和72 h，甜菜夜蛾幼蟲腸道細(xì)菌菌群密度顯著高于dsGFP對(duì)照組，分別為對(duì)照組的55.46倍和7.30倍（圖9-A），其中蒙氏腸球菌密度顯著降低，48 h和72 h時(shí)分別下調(diào)了78.99%和75.07%，而蠟樣芽孢桿菌密度在72 h時(shí)上調(diào)了43.75%（圖9-B、9-C），推測(cè)SeDuox在維持甜菜夜蛾腸道微生物菌群穩(wěn)態(tài)中起重要作用。

2.7 Bt GS36對(duì)SeDuox及抗菌肽基因表達(dá)的影響

RT-qPCR分析Bt GS36對(duì)SeDuox及抗菌肽相關(guān)基因表達(dá)量的影響。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，取食Bt GS36 48 h時(shí)，甜菜夜蛾幼蟲腸道SeDuox的表達(dá)量顯著增加，之后表達(dá)量逐漸降低，而抗菌肽相關(guān)基因表達(dá)量相對(duì)較低，表明此時(shí)宿主主要通過提高SeDuox的表達(dá)水平產(chǎn)生腸道免疫響應(yīng)從而抵抗蘇云金桿菌的侵染（圖10-A）；取食Bt GS36后分析不同時(shí)間點(diǎn)抗菌肽基因表達(dá)水平，結(jié)果顯示，12 h和24 h時(shí)，Attacin表達(dá)量顯著增加；36 h時(shí)，Defensin表達(dá)量顯著增加；72 h和96 h，PGRP表達(dá)量顯著增加（圖10-B、10-C、10-D）。結(jié)果表明，甜菜夜蛾取食Bt GS36后，SeDuox與抗菌肽基因協(xié)同作用，調(diào)控宿主腸道免疫系統(tǒng)從而抵御蘇云金桿菌的侵染。

3 討論

昆蟲腸道上皮細(xì)胞為了防御外來致病菌而同時(shí)不影響腸道共生菌的穩(wěn)定，其必須在免疫應(yīng)激和免疫耐受之間保持一種穩(wěn)態(tài)平衡，及時(shí)地響應(yīng)腸道微生物群落的變化[21]。已有研究證明，由雙重氧化酶 Duox介導(dǎo)產(chǎn)生的ROS在昆蟲腸道免疫中發(fā)揮重要作用[12]。而昆蟲中 Duox蛋白的研究多數(shù)關(guān)于黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）、橘小實(shí)蠅等[16-17]，SeDuox在甜菜夜蛾腸道中的生物學(xué)功能尚不清楚。本研究克隆了SeDuox，其開放閱讀框?yàn)? 497 bp，編碼1 498個(gè)氨基酸。利用NCBI Blast分析比對(duì)可知SeDuox與鱗翅目昆蟲斜紋夜蛾、草地貪夜蛾的相似性較高，主要包括過氧化物酶結(jié)構(gòu)域、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸結(jié)構(gòu)域、N-端鈣離子結(jié)合域、鐵還原酶結(jié)構(gòu)域和黃素腺嘌呤二核苷酸結(jié)構(gòu)域，與家蠶、橘小實(shí)蠅等多種物種相似，系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果也表明Duox在不同物種間十分保守，推測(cè)其可能具有保守的生物學(xué)功能。本研究實(shí)現(xiàn)了 SeDuox-OM 蛋白在昆蟲細(xì)胞中成功表達(dá)，后續(xù)可對(duì)該蛋白進(jìn)行功能研究。通過對(duì) SeDuox表達(dá)模式分析，SeDuox在圍食膜和中腸中高表達(dá)，表明SeDuox可能在甜菜夜蛾腸道免疫中發(fā)揮了重要作用；SeDuox從卵期到蛹期均有表達(dá)，表明其參與甜菜夜蛾整個(gè)生活史。

已有研究證明，在果蠅的腸道上皮細(xì)胞中，Duox介導(dǎo)產(chǎn)生ROS作為第一道防線，起著防御主導(dǎo)作用[12]；斑馬魚（Brachydanio rerio var）上皮細(xì)胞Duox活化產(chǎn)生H2O2來清除致病菌的侵染[22]；敲除Duox的果蠅，其腸道菌落穩(wěn)態(tài)失衡[20]；橘小實(shí)蠅BdDuox的敲除導(dǎo)致宿主腸道細(xì)菌總量增加，而腸道共生菌腸球菌的相對(duì)豐度降低[16]。本研究利用RNAi技術(shù)探究SeDuox的功能，發(fā)現(xiàn)SeDuox的沉默可導(dǎo)致甜菜夜蛾腸道菌群載量上調(diào)，腸道潛在致病菌蠟樣芽孢桿菌總量上調(diào)，腸道共生菌蒙氏腸球菌總量下降，腸道微生物的失調(diào)可能引起昆蟲死亡。Bt是重要的殺蟲微生物，廣泛用于害蟲防治，2006年，BRODERICK等研究表明昆蟲腸道微生物是Bt殺蟲活性所必需[23]，消除昆蟲腸道微生物后可降低昆蟲免疫反應(yīng)，從而顯著降低Bt的敏感性[24]，也有研究者提出不同觀點(diǎn)，認(rèn)為Bt的殺蟲活性與腸道細(xì)菌無關(guān)[25]。由于腸道微生物與宿主昆蟲之間有著復(fù)雜又密切的關(guān)系，Bt殺蟲過程中三者如何相互作用，以及宿主免疫系統(tǒng)如何起調(diào)控作用尚未明確。有研究報(bào)道甜菜夜蛾幼蟲取食Bt Vip3毒素后，包括AMP在內(nèi)的大多數(shù)免疫應(yīng)答基因顯著上調(diào)，并干擾宿主的腸道微生物群，由此產(chǎn)生的失調(diào)反過來又刺激 AMP的表達(dá)和Duox產(chǎn)生ROS[26-27]。棉鈴蟲取食Bt SY80后，在特定的時(shí)期，其中腸HaDuox表達(dá)水平顯著增加[28]。本研究發(fā)現(xiàn)甜菜夜蛾攝入Bt GS36后，SeDuox與抗菌肽基因協(xié)同作用調(diào)控宿主腸道免疫系統(tǒng)從而抵御 Bt的侵染，推測(cè) SeDuox在抵御昆蟲腸道病原物侵入前期發(fā)揮重要作用，維持腸道免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)和菌群平衡。

4 結(jié)論

甜菜夜蛾 SeDuox為跨膜蛋白，具有典型的過氧化物酶結(jié)構(gòu)域，其在昆蟲中具有高度進(jìn)化保守性。SeDuox在腸道免疫及腸道細(xì)菌調(diào)控中具有重要作用，可能與抗菌肽基因協(xié)同作用進(jìn)行宿主的免疫調(diào)控以抵抗蘇云金桿菌的侵染。