施江 ，王佳童 ，2，彭群華 ，呂海鵬 ，BALDERMANN susanne，林智 ?

1中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所/農(nóng)業(yè)部茶樹(shù)生物學(xué)與資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)杭州 310008；2中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，中國(guó)北京 100081；3德國(guó)萊布尼茨蔬菜與園藝作物研究所，德國(guó)柏林 14979

0 引言

【研究意義】茶葉是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物，目前已有18個(gè)省種植茶葉，截至2018年底，茶園面積達(dá)到2.93×106hm2。茶葉品質(zhì)是決定其市場(chǎng)價(jià)值的關(guān)鍵因素，主要表現(xiàn)在內(nèi)在品質(zhì)因子，如香氣、滋味，以及外在品質(zhì)因子，特別是干茶和葉底的色澤[1-2]。目前，國(guó)內(nèi)外針對(duì)茶葉香氣和滋味品質(zhì)化學(xué)方面已有系統(tǒng)的研究[3-4]，然而對(duì)干茶色澤，特別是主要貢獻(xiàn)成分-脂溶性色素，包括葉綠素類（葉綠素a和b）和類胡蘿卜素類（葉黃素、α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素、新葉黃素、玉米黃質(zhì)等）[5-6]的研究并不多見(jiàn)。茶葉中多種品質(zhì)成分的組成及含量容易受到外源誘導(dǎo)以及不同的加工工藝影響發(fā)生顯著變化[7-8]，深入研究茶葉中脂溶性色素響應(yīng)外源誘導(dǎo)變化規(guī)律，充分掌握烏龍茶制作關(guān)鍵加工工序中脂溶性色素的動(dòng)態(tài)變化，有助于為高品質(zhì)的茶葉制作提供采前外源誘導(dǎo)調(diào)控和采后精準(zhǔn)加工的科學(xué)依據(jù)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前，利用外源揮發(fā)性成分誘導(dǎo)植物體內(nèi)次生代謝產(chǎn)物的組分及含量發(fā)生變化的研究已經(jīng)成為熱點(diǎn)[7-11]。外源茉莉酸甲酯誘導(dǎo)茶樹(shù)后鮮葉中多種揮發(fā)性物，包括綠葉揮發(fā)物、萜類化合物等，非揮發(fā)性次生代謝產(chǎn)物，主要是氨基酸類、多酚類、類胡蘿卜素類等[12]發(fā)生顯著變化。類胡蘿卜素成分是茶葉中一類重要的脂溶性色素，在成品茶中貢獻(xiàn)橙色和黃色，同時(shí)是一類非常重要的茶葉香氣前體[13-14]，其降解揮發(fā)性產(chǎn)物—（α/β）-紫羅酮、二氫獼猴桃內(nèi)酯、檸檬醛、香葉酯等都是茶葉香氣的貢獻(xiàn)成分[15]。茶樹(shù)體內(nèi)的類胡蘿卜素在不同品種[14,16]、不同葉位之間的差異較大[17-19]。此外，茶葉中另外一類脂溶性色素—葉綠素 a/b，決定了成品茶的色澤（偏綠），直接反映其新鮮度。此前研究表明，這些色素類成分容易受到非生物脅迫，包括茶樹(shù)鮮葉采前外源誘導(dǎo)，以及采后加工過(guò)程中機(jī)械損傷引起的誘導(dǎo)，其組成和含量上發(fā)生改變[20-22]。烏龍茶是我國(guó)特有的一類茶，其加工過(guò)程較為復(fù)雜[23-25]，關(guān)鍵的“做青”工序，從細(xì)胞的狀態(tài)來(lái)看則是一個(gè)失水和機(jī)械損傷脅迫的生理變化過(guò)程[18,23]。“做青”過(guò)程中，類胡蘿卜素部分中間產(chǎn)物會(huì)裂解為（α/β）-紫羅酮、β-檸檬醛、二氫獼猴桃內(nèi)酯、香葉醇等，這些揮發(fā)性成分都是成品茶中重要的芳香貢獻(xiàn)成分[25-26]。最新研究結(jié)果表明，茶樹(shù)鮮葉萎凋過(guò)程中，鮮葉失水脅迫激發(fā)類胡蘿卜素裂解酶基因CCD1高表達(dá)，催化類胡蘿卜素裂解生成紫羅酮等重要香氣貢獻(xiàn)成分[27]。此外，萎凋過(guò)程中鮮葉受到機(jī)械損傷則會(huì)誘導(dǎo)CCD4高表達(dá)，使得茶葉中紫羅酮大量積累[28]。筆者課題組此前利用外源茉莉酸甲酯誘導(dǎo)茶樹(shù)鮮葉，并將該鮮葉加工成紅茶和綠茶，茶葉香氣品質(zhì)顯著提升[7-8,29]，受誘導(dǎo)后鮮葉中基因、蛋白水平也發(fā)生顯著變化?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前此類研究主要集中在茶葉加工過(guò)程中類胡蘿卜素裂解產(chǎn)生的香氣成分定性定量分析，以及部分脂溶性色素在不同茶樹(shù)品種之間的差異，尚未有對(duì)7種脂溶性色素（5種類胡蘿卜素和2種葉綠素）的含量差異及響應(yīng)外源誘導(dǎo)及烏龍茶加工過(guò)程中動(dòng)態(tài)變化的詳細(xì)研究報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究利用外源茉莉酸甲酯誘導(dǎo)提高鮮葉中類胡蘿卜素含量，掌握外源誘導(dǎo)后的茶樹(shù)鮮葉在烏龍茶加工過(guò)程中脂溶性色素動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，為制作高品質(zhì)的茶葉提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于 2020年在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所進(jìn)行。

1.1 材料與試劑

3—4年生盆栽‘金萱’茶樹(shù)400盆，種植于溫室中。

甲醇、四氫呋喃分別購(gòu)買于德國(guó)柏林 Th. Geyer公司和美國(guó)VWR International公司，二氯甲烷、2-丁醇購(gòu)買于德國(guó)Merck公司。

分析色譜柱：C30-column（YMC Co. Ltd.，Kyoto，Japan，YMC C30，100 mm×2.1 mm，3 μm）。

1.2 儀器與設(shè)備

安捷倫超高效液相色譜（Infinity 1290，Agilent Tech，美國(guó)）串聯(lián)四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（Q-ToF 6540，Agilent Tech，美國(guó)）。

1.3 方法

1.3.1 茶葉樣品制備 0.25%茉莉酸甲酯溶液（2.5 mL茉莉酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品預(yù)溶于22.5 mL無(wú)水乙醇中，后溶解于1 L純水中），均勻噴施于茶樹(shù)鮮葉表面至掛滴，分別于噴施后0（對(duì)照樣品，CK）、12、24、48和168 h采摘一芽二葉，每次采摘1—2 kg，勻堆后取3份（每份30 g）小袋分裝，立即用液氮速凍并保存于-80℃超低溫冰箱，剩余鮮葉進(jìn)行傳統(tǒng)烏龍茶加工工藝：鮮葉（FL）→做青 1（W1）→做青 2（W2）→做青3（W3）→殺青→揉捻（R）→烘干（OT）加工，得到成品烏龍茶。具體的“做青”工藝如下：第一次搖青30 s，攤放2 h（W1），隨后收攏并第二次搖青45 s，攤放4 h（W2），收攏鮮葉進(jìn)行第三次搖青60 s，攤放6 h（W3）。隨后進(jìn)行殺青（320℃，2 min），揉捻（“輕-重-輕”）1 h，最后干燥（110℃，15 min；95℃，35 min）。

1.3.2 茶葉中類胡蘿卜素提取 準(zhǔn)確稱量 50 mg冷凍干燥茶樣（均勻研磨），置于 Eppendorf試管，加入500 μL甲醇/四氫呋喃（THF）（1﹕1，v/v），在20℃下以1 400 r/min振蕩5 min，隨后在4 500 r/min轉(zhuǎn)速下離心5 min，收集離心后上清液于4 mL玻璃瓶中，重復(fù)以上步驟3—5次，合并上清液。玻璃瓶置于氮吹儀上，吹干上清液中的有機(jī)溶劑。繼續(xù)充入少量N2作為保護(hù)氣體，迅速蓋上瓶蓋，保存到-80℃冰箱，用于UHPLC-QToFMS分析。

1.3.3 UHPLC-QToFMS分析 取出保存的樣品，用50μL二氯甲烷（DCM）復(fù)溶后渦旋，繼續(xù)加入200 μL異丙醇后渦旋（可借助超聲水浴助溶），PTEE過(guò)濾膜過(guò)濾復(fù)溶液后以3 000 r/min離心2 min，吸取離心液置于進(jìn)樣瓶，充入少量保護(hù)性氣體 N2，進(jìn)行UHPLC-QToFMS進(jìn)樣分析，具體參數(shù)如下：色譜柱選擇YMC C30 （100 mm×2.1 mm，3 μm，YMC Co.Ltd.，Japan）；流動(dòng)相A為甲醇、甲基叔丁基醚、水混合溶液（體積比 81﹕14﹕4），B為甲醇、甲基叔丁基醚、水混合溶液（體積比6﹕90﹕4）；流速控制0.2 mL·min-1；類胡蘿卜素分離梯度設(shè)置，30 min內(nèi)流動(dòng)相A梯度由100%均勻降低至0；分析設(shè)備為Agilent 1290 Infinity UHPLC串聯(lián)Agilent 6230 ToFMS，離子源切換至APCI，正離子模式。

1.3.4 定性定量分析 本研究中所用的 5種類胡蘿卜素及葉綠素a/b，均為通過(guò)單一標(biāo)樣建立外標(biāo)法進(jìn)行定性定量分析得到，具體參考 MAGENEY等[30]提出的方法。首先，精確稱取α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素、葉黃素、玉米黃質(zhì)、新葉黃素、葉綠素a和葉綠素b各2.5 mg分別置于25 mL容量瓶中，少量二氯甲烷溶解，純乙腈定容，配制成濃度為100 μg?mL-1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，-20℃保存。分別配制0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10和 40 μg?mL-1等濃度的單一標(biāo)準(zhǔn)品溶液。UPLC-QToFMS采集相應(yīng)的質(zhì)譜峰面積，α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素（[M+H]+537.446）、葉黃素（[M-H2O+H]+551.425）、玉米黃質(zhì)（[M+H]+569.435）以及新葉黃素（[M?H2O+H]+583.415）建立外標(biāo)曲線。隨后借助Agilent Mass Hunter進(jìn)行定性定量分析獲得的數(shù)據(jù)，對(duì)茶葉中類胡蘿卜素含量進(jìn)行分析。所有樣本進(jìn)行 3次生物學(xué)分析，表與圖中的數(shù)據(jù)均是3次重復(fù)的平均值，并且本研究中的定量結(jié)果均以在干茶中的含量表示。

1.3.5 統(tǒng)計(jì)分析 數(shù)據(jù)定性定量后，進(jìn)行在線多元統(tǒng)計(jì)分析（MetaboAnalyst）。

2 結(jié)果

2.1 茶樹(shù)鮮葉及成品茶中脂溶性色素組成及含量

根據(jù)筆者實(shí)驗(yàn)室前期已經(jīng)建立的靶標(biāo)代謝組學(xué)方法對(duì)7種脂溶性色素定性定量分析（圖1）。從表 1的數(shù)據(jù)分析可以看出，‘金萱’茶樹(shù)鮮葉中葉綠素 a的含量為 986.71 μg·g-1，葉綠素 b的含量為 521.48μg·g-1，而類胡蘿卜素類成分的含量則相對(duì)較低，其中含量最高的葉黃素為 405.06 μg·g-1，含量最低的 α-胡蘿卜素含量?jī)H為 42.24 μg·g-1。據(jù)報(bào)道[19,28]，茶中的類胡蘿卜素主要分布于葉片，葉黃素和 β-胡蘿卜素是茶葉中主要的類胡蘿卜素，其他含量相對(duì)較低的有α-胡蘿卜素、新葉黃素、玉米黃質(zhì)等。茶樹(shù)鮮葉采摘后按照烏龍茶加工工藝，制作得到的成品茶中，除了α-胡蘿卜素含量略有增加，其他脂溶性色素含量均有所下降。葉綠素 a下降最顯著，僅為鮮葉中含量的18.34%，葉綠素b下降至164.92 μg·g-1，葉黃素減少至 277.36 μg·g-1，下降了 31.53%，β-胡蘿卜素下降最顯著。

表1 外源茉莉酸甲酯誘導(dǎo)后的鮮葉加工成烏龍茶過(guò)程中葉綠素和類胡蘿卜素含量變化Table 1 Changes of carotenoids and chlorophyll a/b in oolong tea manufacturing from tea leaves treated with methyl jasmonate(μg·g-1 DW)

2.2 外源茉莉酸甲酯誘導(dǎo)后茶葉中脂溶性色素組成及其含量

外源茉莉酸甲酯誘導(dǎo)后，‘金萱’茶樹(shù)鮮葉中葉綠素a/b的含量隨著時(shí)間推移變化明顯。如圖2所示，誘導(dǎo)后48 h內(nèi)，葉綠素a含量較對(duì)照鮮葉中（0 h）增加，隨后含量顯著下降；葉綠素b在茉莉酸甲酯誘導(dǎo)后的鮮葉中始終處于下降的趨勢(shì)。

外源茉莉酸甲酯誘導(dǎo)后，‘金萱’茶樹(shù)鮮葉中 5種類胡蘿卜素含量隨著時(shí)間的推移變化復(fù)雜（圖3）。此前，研究人員[19,23]對(duì)超過(guò)100份茶種質(zhì)資源中的β-胡蘿卜素和葉黃素含量進(jìn)行分析，也表明該兩種成分是茶葉中含量最高的類胡蘿卜素成分，且在不同品種中變異倍數(shù)顯著，表現(xiàn)為成熟葉的含量高于嫩葉。鮮葉中含量最高的葉黃素在12 h樣品中含量顯著下降，在24 h的樣品中其含量較對(duì)照升高（圖3）。香葉基香葉基焦磷酸（geranylgeranyl diphosphate，GGPP）是類胡蘿卜素合成的直接前體，有研究表明，提高1-脫氧木酮糖-5-磷酸合成酶、1-脫氧木酮糖-5-磷酸還原酶（1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase, DXS；1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase，DXR）等基因表達(dá)能夠顯著提高茶葉中類胡蘿卜素合成積累，而這些關(guān)鍵基因能夠響應(yīng)多種外源激素誘導(dǎo)，包括茉莉酸甲酯[28-29]。β-胡蘿卜素在茉莉酸甲酯誘導(dǎo)后的鮮葉中含量始終低于對(duì)照樣品，其中誘導(dǎo)12 h的樣品中含量?jī)H為116.36 μg·g-1，減少了34.55%。新葉黃素和α-胡蘿卜素含量響應(yīng)外源茉莉酸甲酯誘導(dǎo)的變化規(guī)律較為相似，誘導(dǎo)后的鮮葉中含量有不同程度下降，僅在24 h樣品中含量略高于對(duì)照。玉米黃質(zhì)在外源誘導(dǎo)后的鮮葉中變化較為顯著，其中48 h樣品中含量下降至82.76 μg·g-1，僅為對(duì)照含量的70.5%，然而在168 h樣品中該成分含量上升至171.93 μg·g-1，增幅達(dá)到1倍以上。根據(jù)此前報(bào)道[23,30-34]，番茄紅素β-環(huán)化酶（lycopeneβ-cyclase，LCYB）和番茄紅素ε-環(huán)化酶（lycopeneε-cyclase，LCYE）對(duì)底物（α-胡蘿卜素和β-胡蘿卜素）選擇的偏好性造成了植物體內(nèi)環(huán)化類胡蘿卜素（葉黃素、玉米黃質(zhì)、新葉黃素等）的比例差異，利用外源誘導(dǎo)這些基因表達(dá)調(diào)控類胡蘿卜素的生物合成也是一種重要的品質(zhì)調(diào)控手段。

成品茶樣中葉綠素a含量與0 h對(duì)照相比均顯著下降，而葉綠素b含量則在前48 h樣品中略有升高，但未達(dá)到顯著差異水平，直至誘導(dǎo)168 h樣品中含量顯著下降（圖4-A）。成品茶中5個(gè)類胡蘿卜素中，葉黃素含量最高，利用茉莉酸甲酯誘導(dǎo)后的鮮葉制作得到的成品茶樣品（12、24、48 h）含量較對(duì)照顯著升高，其中48 h的樣品中含量最高，達(dá)到377.82 μg·g-1，而在168 h樣品中含量急劇下降至189.43 μg·g-1。類胡蘿卜素是茶葉重要致香物質(zhì)的前體物，特別是β-胡蘿卜素是茶葉香氣形成的重要來(lái)源，其含量及變化對(duì)茶葉品質(zhì)起著至關(guān)重要的作用[5]。β-胡蘿卜素含量在誘導(dǎo)后的成品茶中都較對(duì)照下降，但未達(dá)到顯著差異。茶葉加工過(guò)程中，類胡蘿卜素主要通過(guò)酶促和非酶促（光、熱等）2種方式氧化降解形成茶葉香氣品質(zhì)貢獻(xiàn)成分（（α/β）-紫羅酮、橙花叔醇、二氫獼猴桃內(nèi)酯、α-法呢烯、香葉基丙酮等）[24,27-28,30,32]。最新研究表明，茶樹(shù)鮮葉萎凋過(guò)程中，β-紫羅酮大量積累主要是類胡蘿卜素裂解酶（carotenoid cleavage dioxygenase 1 and 4）催化類胡蘿卜素裂解產(chǎn)生[27-28]。茉莉酸甲酯誘導(dǎo)后前48 h制得的烏龍茶樣品中，新葉黃素和玉米黃質(zhì)的含量都較對(duì)照有所升高，并且都在 24 h的處理樣中達(dá)到最高值（圖4-B），兩者在48 h處理樣中含量顯著下降。α-胡蘿卜素的含量變化不同于其他4種類胡蘿卜素，受茉莉酸甲酯誘導(dǎo)，其含量在24 h的樣品中達(dá)到最大值。

2.3 外源茉莉酸甲酯誘導(dǎo)后茶葉感官品質(zhì)提升

類胡蘿卜素是茶葉中多種重要香氣成分的前體物質(zhì)，其含量的提高必然影響成品茶香氣品質(zhì)。因此，本研究開(kāi)展成品茶感官品質(zhì)評(píng)價(jià)分析，進(jìn)一步驗(yàn)證了外源茉莉酸甲酯誘導(dǎo)后茶樹(shù)鮮葉加工制作的烏龍茶香氣品質(zhì)顯著提升（表2）。實(shí)驗(yàn)室組建的5人感官審評(píng)小組開(kāi)展多次感官評(píng)價(jià)，結(jié)果表明，利用茉莉酸甲酯誘導(dǎo)12 h的鮮葉制作得到的烏龍茶香氣品質(zhì)最高，表現(xiàn)出持久的濃郁花香，茶湯中也帶有輕微的花香，然而其葉底較對(duì)照樣品柔軟性更差，也更加偏暗一些。誘導(dǎo)24和48 h后的鮮葉加工得到的烏龍茶香氣品質(zhì)也得到了顯著提升，茶湯中也有輕微花香。誘導(dǎo)168 h（一周）的鮮葉制作得到的烏龍茶，香氣品質(zhì)表現(xiàn)出持久的果蜜香。感官結(jié)果一定程度上可以證實(shí)茉莉酸甲酯誘導(dǎo)后，鮮葉加工成烏龍茶香氣品質(zhì)得到顯著提升。

表2 外源茉莉酸甲酯誘導(dǎo)后茶鮮葉加工的成品烏龍茶感官品質(zhì)Table 2 Sensory evaluation of made oolong tea prepared from fresh leaves treated by exogenous methyl jasmonate

2.4 烏龍茶“做青”工序前后茶葉中脂溶性色素動(dòng)態(tài)變化

本研究對(duì)烏龍茶加工過(guò)程中的關(guān)鍵“做青”工序以及殺青后揉捻的樣品中這些脂溶性色素的含量進(jìn)行動(dòng)態(tài)變化監(jiān)測(cè)，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行均一化處理后制作相應(yīng)的熱圖，便于更加清晰比較脂溶性色素的變化規(guī)律（表1，圖5）。

整個(gè)“做青”過(guò)程中（W1—W3），與對(duì)應(yīng)階段的對(duì)照樣品相比，葉綠素a含量在茉莉酸甲酯誘導(dǎo)后的樣品中均顯著下降，而葉綠素b含量則在12 h后的樣品中顯著升高。5種類胡蘿卜素的含量動(dòng)態(tài)變化則更加復(fù)雜，含量最高的葉黃素，經(jīng)歷第一次搖青攤放后，在24和48 h的樣品中含量顯著上升（與0 h樣品相比）；第二次搖青攤放后，對(duì)照樣品中葉黃素含量則顯著高于茉莉酸甲酯誘導(dǎo)處理后樣品中的含量；第三次搖青攤放后的樣品中，除了茉莉酸甲酯誘導(dǎo)處理24 h的樣品中葉黃素含量略有升高外，其余誘導(dǎo)后的樣品中該物質(zhì)的含量均比對(duì)照樣品低。β-胡蘿卜素的含量變化表現(xiàn)簡(jiǎn)單一些，茉莉酸甲酯誘導(dǎo)后，該成分在整個(gè)鮮葉“做青”過(guò)程中，處理后樣品中的含量始終比對(duì)照低。與該成分變化規(guī)律相反，玉米黃質(zhì)和α-胡蘿卜素的含量在茉莉酸甲酯誘導(dǎo)后的鮮葉“做青”后的樣品中，始終維持非常高的含量，表現(xiàn)出極顯著差異。在第一次搖青攤放后的茉莉酸甲酯誘導(dǎo)樣品中，新葉黃素含量顯著高于0 h樣，第二次和第三次“做青”樣品中，其含量大幅度下降。

鮮葉“做青”結(jié)束后，高溫殺青鈍化酶活性，此后進(jìn)行揉捻工序。對(duì)揉捻后的茶樣進(jìn)行脂溶性色素含量動(dòng)態(tài)變化分析，結(jié)果表明這些脂溶性成分受加工工藝以及茉莉酸甲酯外源誘導(dǎo)雙重影響。在茉莉酸甲酯誘導(dǎo)后的樣品中，葉綠素a的含量顯著下降，盡管在24 h樣品中的含量（614.67 μg·g-1）與對(duì)照樣含量（634.32 μg·g-1）較為接近，但依舊有所減少。葉綠素b則呈現(xiàn)相反的趨勢(shì)，與對(duì)照相比（346.8 μg·g-1），茉莉酸甲酯誘導(dǎo)12 h后樣品中該類胡蘿卜素成分含量顯著升高，最高達(dá)到 440.66 μg·g-1。葉黃素、α-胡蘿卜素、玉米黃質(zhì)（12 h樣品除外）在茉莉酸甲酯誘導(dǎo)后的樣品中含量均顯著高于對(duì)照；β-胡蘿卜素的含量顯著低于對(duì)照；新葉黃素的含量則在12和24 h的樣品中較高。

3 討論

茶葉中脂溶性色素是直接影響干茶、茶湯色澤的重要因子，具有非常重要的研究意義[9-10,18]。利用外源茉莉酸甲酯誘導(dǎo)調(diào)控茶鮮葉中脂溶性色素，掌握烏龍茶制作關(guān)鍵加工工序中脂溶性色素的動(dòng)態(tài)變化，有望為今后茶樹(shù)鮮葉采后精準(zhǔn)加工以達(dá)到提高茶葉品質(zhì)提供充足的科學(xué)依據(jù)。

3.1 外源茉莉酸甲酯誘導(dǎo)提高茶葉中類胡蘿卜素含量，提升成品茶香氣品質(zhì)

茉莉酸甲酯是一種高效的誘導(dǎo)子，已被廣泛應(yīng)用于改善作物品質(zhì)，如香氣、滋味、保質(zhì)期等[12-13]，然而，此前利用外源茉莉酸甲酯誘導(dǎo)提升茶葉品質(zhì)的研究和應(yīng)用仍不多見(jiàn)。有學(xué)者研究了茉莉酸酯類對(duì)葡萄果實(shí)著色及品質(zhì)的影響[14]，結(jié)果表明外源茉莉酸甲酯誘導(dǎo)能夠在前期提升類胡蘿卜素含量，后期其含量下降。本研究明確了茶鮮葉以及成品茶中葉黃素是含量最高的類胡蘿卜素類成分，而外源茉莉酸甲酯誘導(dǎo)處理后一定時(shí)間段內(nèi)（24 h），鮮葉中以葉黃素為主的類胡蘿卜素類成分含量能夠顯著增加，制作得到的成品茶葉黃素含量較對(duì)照高。通過(guò)對(duì)對(duì)照（未受茉莉酸甲酯誘導(dǎo)）鮮葉加工得到成品烏龍茶中脂溶性色素的結(jié)果分析，本研究中鑒定的2種葉綠素和5種類胡蘿卜素含量均呈下降趨勢(shì)，且下降幅度較大；然而，利用茉莉酸甲酯誘導(dǎo)處理后的茶樹(shù)鮮葉在加工過(guò)程中類胡蘿卜素下降幅度較小。采前外源誘導(dǎo)顯著影響脂溶性色素的組成及含量，同時(shí)加工工藝對(duì)成品茶中最終含量的影響也十分顯著。此外，外源茉莉酸甲酯誘導(dǎo)后的鮮葉加工成烏龍茶，其香氣品質(zhì)得到顯著提升，呈現(xiàn)持久濃郁的花果香。類胡蘿卜素降解形成的香氣成分，如β-紫羅酮、二氫獼猴桃內(nèi)酯、檸檬醛等在茶葉中貢獻(xiàn)花果香。茶葉加工過(guò)程中，由于存在高溫（殺青、干燥）和酶促（揉捻、發(fā)酵）等作用，茶葉中類胡蘿卜素類成分，特別是葉黃素大幅度降解，較對(duì)照減少約65%以上。此外，在茶葉加工過(guò)程中，尤其是鮮葉萎凋過(guò)程中的α-和β-胡蘿卜素等則降解成為揮發(fā)性成分α-和β-紫羅酮，玉米黃質(zhì)和新葉黃素則會(huì)在類胡蘿卜素氧化裂解酶的作用下降解成其他一些揮發(fā)性成分[27-28]。

3.2 外源誘導(dǎo)與“做青”機(jī)械損傷雙重脅迫調(diào)控茶葉中脂溶性色素的動(dòng)態(tài)變化

筆者課題組前期的研究結(jié)果表明[7-8]，外源茉莉酸甲酯誘導(dǎo)處理茶樹(shù)鮮葉后，多條香氣合成相關(guān)的代謝通路，尤其是萜類代謝通路發(fā)生顯著變化，該途徑中DXS、DXR、NECD，以及類胡蘿卜素氧化裂解酶（carotenoids cleavage dioxygenases，CCDs）等基因表達(dá)發(fā)生顯著變化。在誘導(dǎo)的前24 h，這些基因大部分呈現(xiàn)上調(diào)的趨勢(shì)，成為采前誘導(dǎo)調(diào)控類胡蘿卜素積累的主要因素。ZENG等[35]在最新的烏龍茶香氣品質(zhì)形成的論文中總結(jié)出烏龍茶加工過(guò)程中茶樹(shù)鮮葉仍處于較為鮮活狀態(tài)，鮮葉中多條茉莉酸依賴代謝通路中基因和酶活性差異表達(dá)，能夠顯著影響成品茶中香氣品質(zhì)成分的組分及含量。烏龍茶作為我國(guó)特有的一種高香型特種茶，其特殊的“做青”工藝多被看作是一種持續(xù)性機(jī)械損傷，而這些代謝途徑中基因受到外源誘導(dǎo)調(diào)控和“做青”機(jī)械損傷發(fā)生差異表達(dá)，最終調(diào)節(jié)茶葉中次生代謝產(chǎn)物的組分和含量。“做青”過(guò)程相當(dāng)于茶樹(shù)葉片處于逆境脅迫的過(guò)程，茶鮮葉中多條代謝途徑中的基因差異表達(dá)，尤其是萜類代謝途徑中的牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合成酶（geranyl geranyl diphosphate synthase，GGPPS）以及萜類化合物形成相關(guān)的酶基因（CsMVK）等表達(dá)增長(zhǎng)顯著[26-28]。在烏龍茶“做青”過(guò)程中，一方面離體為鮮葉葉片營(yíng)造了一個(gè)逆境環(huán)境，促使細(xì)胞內(nèi)發(fā)生微妙的變化，如細(xì)胞膜透性改變、多酚類物質(zhì)氧化、脂質(zhì)降解、葉綠素a/b降解等；另一方面持續(xù)的外源誘導(dǎo)和機(jī)械損傷加劇激發(fā)細(xì)胞內(nèi)各種內(nèi)含物的轉(zhuǎn)化，這些變化為烏龍茶獨(dú)特品質(zhì)的形成奠定了基礎(chǔ)[23,29]。安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)宋傳奎教授課題組最新研究發(fā)現(xiàn)，CCD4在鮮葉受到機(jī)械損傷等脅迫下，表達(dá)量顯著提升，催化類胡蘿卜素類成分的9-10以及9’-20’雙鍵生成β-紫羅酮等芳香成分；而CCD1則被證明在鮮葉萎凋失水脅迫的過(guò)程中大量表達(dá)，催化類胡蘿卜素裂解生成β-紫羅酮等[27-28]。此外，脫落酸在植物逆境脅迫響應(yīng)中發(fā)揮著重要作用，9-順式環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶（9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase，NCED）是植物脫落酸（abscisic acid，ABA）生成的關(guān)鍵酶，調(diào)控該酶合成的關(guān)鍵基因在“做青”階段的表達(dá)先升高后降低[36-37]，而茶鮮葉中多種類胡蘿卜素均是 ABA合成途徑中的重要中間代謝物。

然而，本研究重點(diǎn)關(guān)注了茶葉中7種脂溶性色素在烏龍茶加工過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化，僅從代謝水平研究了脂溶性色素響應(yīng)外源誘導(dǎo)和加工機(jī)械損傷，并未深入研究涉及到的基因、蛋白等分子水平。因此，查明類胡蘿卜素代謝途徑中相關(guān)基因與中間代謝產(chǎn)物受到采前外源誘導(dǎo)后的差異表達(dá)，及其與采后“做青”加工工序中機(jī)械損傷引起的二次誘導(dǎo)之間關(guān)系的研究亟待深入。然而，外源茉莉酸甲酯誘導(dǎo)提升鮮葉及成品茶中類胡蘿卜素含量仍舊處于基礎(chǔ)研究階段，目前僅在大棚溫室中進(jìn)行，實(shí)際茶園的大面積應(yīng)用還受到環(huán)境氣候影響。此外，由于目前茉莉酸甲酯價(jià)格昂貴，后續(xù)可尋找茉莉酸甲酯廉價(jià)替代誘導(dǎo)劑在茶園大面積應(yīng)用。

4 結(jié)論

本研究利用外源茉莉酸甲酯誘導(dǎo)茶樹(shù)鮮葉，對(duì)誘導(dǎo)后的鮮葉進(jìn)行烏龍茶加工，成品茶香氣品質(zhì)得到顯著提升。此外，通過(guò)基于UPLC-QToF/MS靶標(biāo)代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)茶葉中7種脂溶性色素成分進(jìn)行絕對(duì)定量，明確了葉黃素是茶鮮葉和成品茶中含量最高的類胡蘿卜素成分，掌握了類胡蘿卜素成分在烏龍茶加工過(guò)程中的變化規(guī)律。本研究利用外源誘導(dǎo)改變鮮葉中5種重要類胡蘿卜素含量，提高成品茶中類胡蘿卜素含量，誘導(dǎo)24 h的樣品中類胡蘿卜素含量顯著提升。解析了烏龍茶加工過(guò)程中關(guān)鍵加工工序—“做青”階段脂溶性色素動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，探明了采前茉莉酸甲酯誘導(dǎo)以及采后“做青”機(jī)械損傷雙重脅迫下，茶葉中脂溶性色素類成分的組分及其含量變化。