張婧蕓，劉語(yǔ)諾，王兆昊，彭愛紅，陳善春，何永睿

西南大學(xué)柑桔研究所，重慶 400712

0 引言

【研究意義】柑橘潰瘍病是由柑橘黃單胞菌柑橘致病亞種（Xanthomonas citri subsp. citri，Xcc）引起的細(xì)菌性病害，流行于世界主要柑橘產(chǎn)區(qū)，每年給柑橘產(chǎn)業(yè)造成高達(dá)數(shù)億美元的經(jīng)濟(jì)損失。柑橘潰瘍病由于危害大、傳播快、難防治，是國(guó)內(nèi)外重要的檢疫性病害[1-3]。培育并推廣抗?jié)儾〉膬?yōu)良柑橘新品種是防治柑橘潰瘍病最根本和最有效的途徑，對(duì)柑橘產(chǎn)業(yè)的健康穩(wěn)定發(fā)展具有十分重要的意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】利用抗?jié)儾〉母涕倨贩N與易感品種進(jìn)行有性雜交，從雜交后代中篩選出抗?jié)儾〉暮蟠桥嘤節(jié)儾「涕倨贩N的途徑之一[4]。但由于柑橘類果樹的遺傳背景高度雜合，基因間緊密連鎖、珠心胚干擾等原因，使得雜交育種的效率較低，難以培養(yǎng)出抗?jié)儾〉膬?yōu)良柑橘新品種。近年來(lái)，植物基因工程的迅速發(fā)展為柑橘品種改良開辟了一條新途徑，使短期內(nèi)進(jìn)行柑橘品種的定向改良成為可能[5-6]。植物受到病原物侵染后體內(nèi)的水楊酸（salicylic acid，SA）水平上升，并由病原物侵入點(diǎn)向周圍進(jìn)行擴(kuò)散，誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)獲得性抗性（systemic acquired resistance，SAR）[7-8]。在SA介導(dǎo)的SAR途徑中，病程相關(guān)基因非表達(dá)子1（non-expressor of pathogenesis-related genes 1，NPR1）以及兩個(gè)NPR1同源物NPR3和NPR4參與了植物對(duì)病原物的防御反應(yīng)[9-11]。植物細(xì)胞感知SA信號(hào)后，細(xì)胞內(nèi)的氧化還原勢(shì)發(fā)生變化，NPR1在細(xì)胞質(zhì)中由寡聚體變成單體，并在其C-末端核定位信號(hào)的介導(dǎo)下向細(xì)胞核中進(jìn)行移動(dòng)。在細(xì)胞核中，NPR1與TGA 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，促進(jìn)病程相關(guān)基因（pathogenesis-related gene，PR）的表達(dá)，增強(qiáng)植物對(duì)病原物的抗性[12-13]。通過導(dǎo)入擬南芥（Arabidopsis thaliana）的NPR1（AtNPR1）已獲得了抗?jié)儾『忘S龍病的轉(zhuǎn)基因柑橘[14-15]。AtNPR1與甜橙基因組中的CtNH1具有較高的同源性，通過超表達(dá)CtNH1提高了柑橘對(duì)潰瘍病的抗性[16]。進(jìn)一步的研究表明，超量表達(dá)AtNPR1或CtNH1組成型均提高了與防御反應(yīng)相關(guān)的基因如 CsPR1、CsPR2或 Chi1的表達(dá)。不同于AtNPR1，AtNPR4調(diào)控植株防御反應(yīng)的方式具有爭(zhēng)議性，LIU等[17]利用反向遺傳學(xué)，在研究AtNPR4的功能時(shí)發(fā)現(xiàn)，AtNPR4突變體 npr4-1對(duì)丁香假單胞菌DC3000（Pseudomonas syringe pv. tomato DC3000）敏感；且NPR4正向調(diào)控SA和茉莉酸（jasmonic acid，JA）分別誘導(dǎo)的防御反應(yīng)相關(guān)基因PR1和PDF1.2的表達(dá)。這些結(jié)果表明，AtNPR4正向調(diào)控了擬南芥對(duì)丁香假單胞菌DC3000的抗性。而另一個(gè)AtNPR4突變體npr4-3受丁香假單胞菌ES4326（Pseudomonas syringae pv. maculicola ES4326）和卵菌（Hyaloperonospora parasitica Noco2）誘導(dǎo)后，其抗性或敏感性水平并沒有發(fā)生變化；但AtNPR3/4雙突變體npr3-1/npr4-3卻表現(xiàn)出比AtNPR3單突變體npr3-1更高的PR1表達(dá)水平和更強(qiáng)的抗丁香假單胞菌 ES4326和卵菌特性，因而推測(cè)AtNPR4負(fù)向調(diào)控了植株的防御反應(yīng)[18]。DING等[11]在擬南芥原生質(zhì)體中超量表達(dá) AtNPR4，防御反應(yīng)相關(guān)基因SARD1和WRKY70的表達(dá)水平受到了抑制，進(jìn)一步證明了AtNPR4對(duì)植株防御反應(yīng)的負(fù)向調(diào)控。耐黃龍病的‘Jackson’葡萄柚受到柑橘黃龍病菌侵染后，其體內(nèi)的一個(gè)CiNPR4（Ciclev10031749m）上調(diào)表達(dá)[19]。研究表明，在甜橙中導(dǎo)入CiNPR4增加了轉(zhuǎn)基因植株對(duì)柑橘黃龍病的抗性。轉(zhuǎn)錄組分析證實(shí)，黃龍病抗性增強(qiáng)的CiNPR4轉(zhuǎn)基因植株中與防御反應(yīng)相關(guān)的基因上調(diào)表達(dá)。這些結(jié)果表明超量表達(dá)CiNPR4提高了柑橘的內(nèi)在免疫力[20]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】異源表達(dá)擬南芥AtNPR1能夠同時(shí)提高轉(zhuǎn)基因柑橘對(duì)潰瘍病和黃龍病的抗性。但AtNPR4正向還是負(fù)向調(diào)控植物防御仍具有爭(zhēng)議性，柑橘CiNPR4與柑橘潰瘍病抗性相關(guān)性鮮有研究?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以過表達(dá)抗黃龍病基因CiNPR4轉(zhuǎn)基因晚錦橙（Citrus sinensis Osbeck）為材料進(jìn)行潰瘍病抗性評(píng)價(jià)，探討 CiNPR4在柑橘潰瘍病菌生物脅迫信號(hào)途徑中相關(guān)激素應(yīng)答和抗性誘導(dǎo)的相關(guān)性，明確CiNPR4對(duì)柑橘潰瘍病的抗性機(jī)理。

近日，第三屆中國(guó)工業(yè)車輛行業(yè)新技術(shù)（叉車安全）研討會(huì)上，林德市場(chǎng)策略及解決方案高級(jí)總監(jiān)陳曉春先生圍繞設(shè)備、操作者、場(chǎng)所及管理等四個(gè)維度分享了林德如何利用創(chuàng)新為用戶叉車安全作業(yè)保駕護(hù)航的最佳實(shí)踐。會(huì)后舉行了第二屆中國(guó)工業(yè)車輛創(chuàng)新獎(jiǎng)（整車獎(jiǎng)）頒獎(jiǎng)典禮，林德窄通道三向堆垛叉車（搬運(yùn)機(jī)器人）Linde Robotics K-Mat、林德L A B叉車（自動(dòng)化改裝基礎(chǔ)版）獲得銅獎(jiǎng)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

供試 7個(gè) CiNPR4轉(zhuǎn)基因株系（N1、N2、N8、N12、N20、N21和N28）[20]以及野生型（WT）晚錦橙均來(lái)自于西南大學(xué)柑桔研究所國(guó)家柑桔品種改良中心。試驗(yàn)于2020年4月開始，在西南大學(xué)柑桔研究所國(guó)家柑桔品種改良中心完成。

1.2 CiNPR4轉(zhuǎn)基因植株的潰瘍病抗性評(píng)價(jià)

在進(jìn)行潰瘍病抗性評(píng)價(jià)前3 d，將Xcc菌株YN1（本實(shí)驗(yàn)室保存）在LB固體培養(yǎng)基上活化[21]。接種前1 d，挑選活化的Xcc置于LB液體培養(yǎng)基中，在220 r/min、28℃的搖床上振蕩培養(yǎng)過夜。用紫外光分光光度計(jì)測(cè)量菌液的OD600值。用LB液體培養(yǎng)基稀釋菌液，使其OD600值為0.1，繼續(xù)在上述培養(yǎng)條件下振蕩培養(yǎng)至OD600值為0.5。菌液置離心管中，在離心機(jī)上以5 000 r/min離心10 min，棄上清，收集菌體。加入與上清液等體積的無(wú)菌水重懸。將菌液進(jìn)行連續(xù)梯度稀釋1 000倍（5×105cfu/mL）備用。選取完全展開的6個(gè)月葉齡CiNPR4轉(zhuǎn)基因株系和WT植株的葉片，無(wú)菌水洗凈，平鋪至150 mm的培養(yǎng)皿中，并在葉柄處放置一塊充分吸水的脫脂棉。用針頭（0.5 mm）在葉脈分左右兩邊針刺葉片，每邊針刺相同孔數(shù)，每個(gè)針孔接種1 μL上述Xcc稀釋菌液。培養(yǎng)皿用Parafilm膜封口，于28℃、光照16 h·d-1的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每天觀察一次發(fā)病情況，接種后10 d觀察病情并拍照。用ImageJ軟件統(tǒng)計(jì)葉片接種點(diǎn)處潰瘍病斑的面積。相對(duì)抗病率=轉(zhuǎn)基因植株的病斑面積/WT植株的病斑面積[22]。試驗(yàn)3次重復(fù)。

這回馬臉發(fā)飆了，掄起胳膊，左右開弓，把我當(dāng)個(gè)陀螺抽。起初我還能聽到啪啪的響聲，后來(lái)耳朵里只剩下嗡嗡的轟鳴了。馬臉打累了，住了手直喘氣，掏出根醬色的長(zhǎng)煙卷，點(diǎn)著后吧嗒吧嗒抽著。

Xcc生長(zhǎng)曲線的分析參照PENG等[22]的方法進(jìn)行。分別于接種后0、1、3、5、7和9 d用直徑為0.5 cm的打孔器取下轉(zhuǎn)基因植株和 WT植株接種區(qū)域的葉圓片，3個(gè)葉圓片為一組，放入1.5 mL的離心管中，加入200 μL的無(wú)菌水，搗碎，定容至1 000 μL，連續(xù)梯度稀釋，取50 μL的菌液涂布LB平板，28℃培養(yǎng)2 d，統(tǒng)計(jì)菌斑個(gè)數(shù)。每平方厘米葉片組織中的 Xcc細(xì)胞=（菌斑個(gè)數(shù)×稀釋倍數(shù)×1000）/[50×π（直徑/2）2×3]。試驗(yàn)3次重復(fù)。

1.3 內(nèi)源SA和JA含量的測(cè)定

根據(jù)與CiNPR4互作的候選蛋白的cDNA序列以及pGADT7質(zhì)粒序列，以EcoR I和BamH I為酶切位點(diǎn)，按上述方法設(shè)計(jì)同源重組引物（表 1）。按照上述 1.4中的方法提取 WT植株的 RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以晚錦橙的 cDNA序列為模板，利用同源重組引物對(duì)分別進(jìn)行擴(kuò)增。參照上述誘餌質(zhì)粒的構(gòu)建方法將候選蛋白的cDNA序列插入pGADT7中，獲得獵物質(zhì)粒pGADT7:候選蛋白。

1.4 RNA的提取和表達(dá)分析

按照上述1.3中的方法對(duì)CiNPR4轉(zhuǎn)基因植株和WT植株的葉片進(jìn)行Xcc接種。分別收集未處理和接種Xcc后0、3和5 d的葉片50 mg，葉片收集后迅速投入液氮中，利用 RNA快速提取試劑盒（RN09，Aidlab，北京，中國(guó)）提取總RNA，方法參照說(shuō)明書。對(duì)RNA樣品濃度和質(zhì)量測(cè)定后，將500 ng的RNA用iScriptTMcDNA Synthesis Kit試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用 ABI 7500熒光定量 PCR儀（PE Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA，USA）進(jìn)行CsPR1和CsPDF1.2的表達(dá)分析。CsPR1、CsPDF1.2和內(nèi)參基因Actin的表達(dá)分析引物見表1。反應(yīng)體系（12 μL）：6 μL 熒光染料試劑 iTaqTMUniversal SYBR? Green Supermix（Bio-Rad，Hercules，CA，USA），上、下游引物各0.3 μL，cDNA模板1 μL，加ddH2O至12 μL。采用2-ΔΔCt法[24]，以各自健康的植株為參照，Actin為內(nèi)參基因，分別計(jì)算相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因植株和WT植株感病后的CsPR1和CsPDF1.2表達(dá)水平。試驗(yàn)3次重復(fù)。

1.5 酵母雙雜交分析

CsPR1和CsPDF1.2分別是SA和JA介導(dǎo)的植物防御反應(yīng)途徑中的標(biāo)志性基因。為了進(jìn)一步分析CiNPR4在 Xcc生物脅迫信號(hào)途徑相關(guān)激素應(yīng)答和抗性誘導(dǎo)過程中的作用，對(duì)Xcc誘導(dǎo)后5個(gè)轉(zhuǎn)基因株系和WT植株葉片中CsPR1和CsPDF1.2的表達(dá)情況進(jìn)行分析。以各自健康的植株為參照，Xcc處理0 d時(shí)，所有檢測(cè)的轉(zhuǎn)基因株系和WT植株中CsPR1的表達(dá)水平無(wú)明顯變化；Xcc處理3 d時(shí)，轉(zhuǎn)基因株系N1、N2、N12、N21和N28中CsPR1的表達(dá)水平迅速上升，與WT植株相比存在顯著差異；Xcc誘導(dǎo)5 d時(shí)，CsPR1的表達(dá)水平在轉(zhuǎn)基因株系N1、N2和N21中繼續(xù)上升，而在N12轉(zhuǎn)基因株系中有所下降，在N28轉(zhuǎn)基因株系中基本保持不變，但所有檢測(cè)的轉(zhuǎn)基因株系中CsPR1的表達(dá)水平仍然顯著高于WT植株；而WT植株中的CsPR1的表達(dá)在Xcc誘導(dǎo)后無(wú)顯著性變化（圖2-C），上述結(jié)果表明 CiNPR4正向調(diào)控轉(zhuǎn)基因植株體內(nèi)CsPR1的表達(dá)。

以CiNPR4的cDNA序列設(shè)計(jì)引物對(duì)CiNPR4-f/CiNPR4-r（表 1），以 pUC57:CiNPR4質(zhì)粒（本實(shí)驗(yàn)室保存，此質(zhì)粒含有CiNPR4的cDNA序列）為模板，擴(kuò)增獲得CiNPR4的cDNA序列。對(duì)酵母載體pGBKT7進(jìn)行EcoR I單酶切，回收產(chǎn)物與CiNPR4的 cDNA序列通過同源重組試劑盒（Cat639648，TaRaKa，大連，中國(guó)）進(jìn)行同源重組并進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，cDNA序列正確的質(zhì)粒確認(rèn)為誘餌質(zhì)粒pGBKT7:CiNPR4。

萌萌噠吧唧吧唧地猛吞幾口，心滿意足地說(shuō)：“作為一個(gè)幸福的當(dāng)代人，在空調(diào)房里吹著暖氣吃雪糕，是對(duì)冬天最大的尊重。”

按上述1.2中的方法準(zhǔn)備OD600值為0.5的Xcc菌液。采取健康的轉(zhuǎn)基因植株和WT植株充分展開的葉片，參照DUAN等[23]的方法將OD600為0.5的Xcc菌液用1 mL去針頭的注射器接種轉(zhuǎn)基因植株和WT植株葉片，于28℃、光照16 h·d-1、相對(duì)濕度85%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。接種后0、3和5 d分別采集0.5 g的葉片。葉片收集后迅速用液氮速凍，用植物激素SA和JA酶聯(lián)免疫試劑盒（Sinobestbio，上海，中國(guó)）分別測(cè)定SA和JA的含量。SA和JA含量測(cè)定由賽諾生物科技有限公司（上海，中國(guó)）完成。試驗(yàn)3次重復(fù)。

氮磷鉀是植物生長(zhǎng)最基本的3種必需大量元素，與其生長(zhǎng)密切相關(guān)，施用量的不同對(duì)植物性狀的表達(dá)有不同程度的影響[1-3]。復(fù)色紫薇是花色存在特異性的一類紫薇，通過長(zhǎng)期栽培實(shí)踐發(fā)現(xiàn)，這類紫薇對(duì)肥料敏感性較高，不同施肥模式會(huì)使復(fù)色紫薇表現(xiàn)一定的性狀差異[4-8]。關(guān)于復(fù)色紫薇專項(xiàng)施肥模式即施用方法和施用時(shí)間的設(shè)計(jì)試驗(yàn)很少有涉及。本研究以3個(gè)復(fù)色紫薇品種為研究對(duì)象，研究在不同施肥方法、肥料配比和施肥時(shí)間下復(fù)色紫薇性狀的差異，并形成復(fù)色紫薇專有的施肥模式。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

誘餌質(zhì)粒和獵物質(zhì)粒在酵母菌株Y2HGold中的共轉(zhuǎn)化以及共轉(zhuǎn)化子的篩選參照Matchmaker? Gold Yeast Two-Hybrid System（TaKaRa）試劑盒的操作方法進(jìn)行。此試劑盒中包含載體pGBKT7和pGADT7、酵母菌株Y2HGold、標(biāo)準(zhǔn)的陽(yáng)性對(duì)照（pGBKT7-53和pGADT7-T）和陰性對(duì)照（pGBKT7-Lam和pGADT7-T）。

1.6 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)使用IBM SPSS 19統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件（SPSS Inc.，Chicago，IL，USA）進(jìn)行鄧肯方差分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差顯示，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 CiNPR4轉(zhuǎn)基因植株的潰瘍病抗性分析

分析潰瘍病菌接種后0、1、3、5、7和9 d，5個(gè)轉(zhuǎn)基因株系（N1、N2、N12、N21和N28）晚錦橙葉片內(nèi)細(xì)菌的生長(zhǎng)。結(jié)果顯示，WT植株接種Xcc后至第7天，接種部位Xcc細(xì)菌總量急劇上升，而N1、N2、N12、N21和N28轉(zhuǎn)基因株系接種部位Xcc細(xì)菌總量在整個(gè)觀察期的增長(zhǎng)較為緩慢。Xcc接種9 d后，對(duì)5個(gè)轉(zhuǎn)基因株系和WT植株葉片接種部位的Xcc細(xì)菌總量進(jìn)行方差分析，結(jié)果顯示，5個(gè)轉(zhuǎn)基因株系葉片內(nèi)Xcc細(xì)菌總量顯著低于WT植株；N2轉(zhuǎn)基因株系中 Xcc細(xì)菌總量顯著低于 N1株系。這些結(jié)果表明CiNPR4的過表達(dá)降低了 Xcc在寄主上的生長(zhǎng)能力，與表型一致（圖1-D）。

對(duì)7個(gè)轉(zhuǎn)基因株系（N1、N2、N8、N12、N20、N21和N28）進(jìn)行潰瘍病的離體抗性分析。針刺法離體接種Xcc，以WT植株為對(duì)照，3 d后轉(zhuǎn)基因植株和WT植株葉片針刺點(diǎn)有輕微的損傷，針刺孔中有白色且形似愈傷樣的組織。隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)，白色愈傷樣的組織突出針刺孔，但不同的轉(zhuǎn)基因株系白色愈傷樣組織團(tuán)的大小存在差異（圖1-A）。接種Xcc 10 d后，統(tǒng)計(jì)植株葉片針刺點(diǎn)的病斑面積，轉(zhuǎn)基因株系N1、N2、N12、N21和N28的葉片潰瘍病病斑面積顯著低于對(duì)照（圖 1-B）。根據(jù)病斑面積計(jì)算相對(duì)抗病率后顯示，轉(zhuǎn)基因株系N8和N20與WT的相對(duì)抗病率無(wú)顯著性差異，但 N1、N2、N12、N21和 N28轉(zhuǎn)基因株系的相對(duì)抗病率顯著低于WT植株，分別為WT植株的79.3%、58.5%、65.4%、49.3%和55.6%（圖1-C），表明過表達(dá)CiNPR4能夠顯著提高晚錦橙對(duì)柑橘潰瘍病的抗性。

誘餌質(zhì)粒 pGBKT7-CiNPR4分別與獵物質(zhì)粒pGADT7-CsTGA2和pGADT7-CsTGA6共轉(zhuǎn)入Y2HGold，并將共轉(zhuǎn)化子分別涂布在DDO和QDO/X/ABA培養(yǎng)基上。結(jié)果表明，所有的共轉(zhuǎn)化子在 DDO培養(yǎng)基上都生長(zhǎng)白色菌斑，而只有CiNPR4與CsTGA2組合在QDO/X/ABA培養(yǎng)基上長(zhǎng)出藍(lán)色菌斑（圖 3-A）。獵物質(zhì)粒pGADT7-CsTGA6和pGADT7-CsTGA2分別與pGBKT7空載雜交后在QDO/X/ABA培養(yǎng)基上沒有出現(xiàn)藍(lán)色菌斑，表明獵物蛋白本身并不能自激活（圖3-B）。陽(yáng)性對(duì)照pGBKT7-53與pGADT7-Rec存在互作，共轉(zhuǎn)化后在QDO/X/ABA培養(yǎng)基上長(zhǎng)出藍(lán)色菌斑，而陰性對(duì)照pGBKT7-Lam與pGADT7-Rec不存在互作，共轉(zhuǎn)化后在QDO/X/ABA培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)（圖3-C）。結(jié)果表明，CiNPR4與CsTGA2蛋白存在互作。

2.2 CiNPR4轉(zhuǎn)基因植株中SA和JA含量的變化

接種Xcc 0、3和5 d后，測(cè)定植株葉片內(nèi)SA和JA含量。處理0 d時(shí)，轉(zhuǎn)基因株系N1、N2、N12、N21和N28體內(nèi)的SA含量與野生型無(wú)顯著差異。處理3 d時(shí)，N1、N12、N21和N28轉(zhuǎn)基因植株葉片中SA含量急劇上升，與WT植株相比達(dá)到顯著的差異水平，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，SA水平進(jìn)一步增加；N2轉(zhuǎn)基因植株在處理3 d時(shí)SA含量達(dá)到最高，在處理5 d時(shí)SA含量有所下降但仍保持較高水平；而WT植株在整個(gè)觀察期間 SA的水平基本保持不變（圖2-A）。

對(duì)于轉(zhuǎn)基因植株體內(nèi)的JA含量來(lái)說(shuō)，Xcc誘導(dǎo)0 d時(shí)，所有檢測(cè)的轉(zhuǎn)基因植株體內(nèi)含量顯著低于 WT植株的JA含量；Xcc誘導(dǎo)3 d時(shí)，JA含量在轉(zhuǎn)基因植株體內(nèi)稍微上升，達(dá)到與WT植株無(wú)顯著差異的水平；Xcc誘導(dǎo)5 d時(shí)，JA含量在轉(zhuǎn)基因植株體內(nèi)急劇上升，達(dá)到比WT植株顯著高的水平；而WT植株在整個(gè)觀察期間JA含量無(wú)顯著差異（圖2-B）。結(jié)果表明，受 Xcc誘導(dǎo)后，CiNPR4的過表達(dá)顯著上調(diào)晚錦橙葉片內(nèi)SA和JA含量，對(duì)SA和JA在體內(nèi)的積累有著正向調(diào)控作用。

2.3 CsPR1和CsPDF1.2的表達(dá)分析

根據(jù)CiNPR4蛋白與TGA轉(zhuǎn)錄因子相互作用網(wǎng)絡(luò)，預(yù)測(cè) CiNPR4分別與 Ciclev10005080m和Ciclev10001081m 基因編碼的蛋白互作[19]。以甜橙為參考基因組，將這兩個(gè)基因在 https://www.citrusgenomedb.org/網(wǎng)站上進(jìn)行blastx分析[25]，找到與Ciclev10005080m和 Ciclev10001081m基因編碼的氨基酸序列相同或者相似性較高的基因，這些基因所編碼的蛋白為候選蛋白。

通過CiNPR4蛋白與TGA轉(zhuǎn)錄因子相互作用網(wǎng)絡(luò)分析，CiNPR4可能的誘餌蛋白是Ciclev10005080m和Ciclev10001081m，以甜橙基因組為參考，通過氨基酸序列比對(duì)，Cs5g11160和Cs1g16230為甜橙中的同源基因，編碼的氨基酸序列具有 100%和 98.9%的相似性。Cs1g16230和Cs5g11160蛋白分別屬于TGA6和TGA2蛋白，因而在本研究中，分別將Cs1g16230和Cs5g11160命名為CsTGA6和CsTGA2。

2.4 酵母雙雜交分析

同樣，以各自健康的植株為參照，Xcc處理 0 d時(shí)，所有檢測(cè)的轉(zhuǎn)基因株系和WT植株中CsDF1.2的表達(dá)水平無(wú)明顯變化；Xcc處理3 d時(shí)，CiNPR4過表達(dá)株系和WT植株中CsDF1.2下調(diào)表達(dá)，且轉(zhuǎn)基因株系與對(duì)照之間無(wú)顯著差異；Xcc誘導(dǎo) 5 d，CsPDF1.2在所有的CiNPR4轉(zhuǎn)基因株系和WT植株中的表達(dá)水平均上升，但WT植株的CsPDF1.2表達(dá)水平顯著高于 CiNPR4轉(zhuǎn)基因株系（圖 2-D），上述結(jié)果表明CiNPR4抑制了轉(zhuǎn)基因植株體內(nèi)CsPDF1.2的表達(dá)。

術(shù)后有5例患者發(fā)生并發(fā)癥，發(fā)生率為1.25%（5/400）。對(duì)患者的護(hù)理滿意度進(jìn)行調(diào)查，其中218例患者滿意，163例患者一般滿意，19例患者不滿意，護(hù)理滿意度為95.25%（381/400）。

為了進(jìn)一步證實(shí)互作的真實(shí)性，對(duì) CiNPR4與CsTGA2共轉(zhuǎn)化子在QDO/X/ABA培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的藍(lán)色菌落進(jìn)行PCR分析，分別擴(kuò)增CiNPR4與CsTGA2的基因片段。結(jié)果顯示，在CiNPR4與CsTGA2共轉(zhuǎn)化的酵母菌落中分別能擴(kuò)增出CiNPR4和CsTGA2基因片段（圖3-D），表明CiNPR4與CsTGA2確實(shí)存在互作。

3 討論

在NPR基因家族中，NPR4調(diào)控了植物對(duì)病原物的防御反應(yīng)。研究表明，NPR4調(diào)控植株的防御反應(yīng)與其氨基酸序列C-末端的VDLNETP基序有關(guān)[11]。分別來(lái)源于甜橙和草莓的 NPR4蛋白 CsNPR4和FvNPRL-1氨基酸序列的 C-末端分別含有 IDLNETP和VDLNETP基序[20]，這兩種蛋白負(fù)向調(diào)控植物對(duì)病原物的防御反應(yīng)[26-27]。將NPR4的VDLNETP基序中‘DLN’3個(gè)氨基酸突變成與NPR1相同的‘GVK’后，會(huì)導(dǎo)致NPR4的抑制功能喪失[11]。與AtNPR1類似，CiNPR4蛋白氨基酸序列的 C-末端完全缺失VDLNETP基序[20,28]。在柑橘黃龍病易感品種晚錦橙中導(dǎo)入CiNPR4增加了轉(zhuǎn)基因植株對(duì)柑橘黃龍病的抗性，表明不含VDLNETP基序的CiNPR4正向調(diào)控了植株的防御反應(yīng)[20]。在本研究中，過表達(dá)CiNPR4抗黃龍病的轉(zhuǎn)基因晚錦橙，同時(shí)也獲得了潰瘍病抗性，進(jìn)一步證明了CiNPR4能夠正向調(diào)控植物防御反應(yīng)。

不需要放玩具引誘，因?yàn)椴鸵魏筒途弑旧韺?duì)于寶寶來(lái)講就是個(gè)新鮮玩具了，最開始可以允許他探索，適當(dāng)?shù)亍巴妗笔澄锘蛏鬃樱侵荒茉诔燥埖臅r(shí)間段“玩”。

柑橘潰瘍病與細(xì)菌性白葉枯病的病原菌同屬于黃單胞菌，研究表明，JA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)增加了玉米對(duì)細(xì)菌性白葉枯病的抗性[29]。相似地，在本研究中，野生型晚錦橙受Xcc感染后，盡管其體內(nèi)的JA含量并沒有發(fā)生顯著變化，但 JA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中防御反應(yīng)相關(guān)基因CsPDF1.2在感染Xcc 5 d后顯著上調(diào)表達(dá)，而SA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的防御反應(yīng)基因CsPR1的表達(dá)水平在Xcc誘導(dǎo)期間無(wú)顯著變化，表明野生型晚錦橙啟動(dòng)JA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抵抗Xcc的入侵。這種現(xiàn)象發(fā)生的原因可能是野生型晚錦橙受Xcc誘導(dǎo)后調(diào)控了JA信號(hào)而非JA水平，與OsNPR1調(diào)控SA和JA介導(dǎo)的信號(hào)而不是它們的水平提高水稻中防御反應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)水平結(jié)果一致[30]。但是，在晚錦橙中導(dǎo)入CiNPR4后，在Xcc的誘導(dǎo)下，SA和JA的水平都顯著提高，相應(yīng)地，SA介導(dǎo)的防御反應(yīng)相關(guān)基因CsPR1的表達(dá)水平顯著上升，而CiNPR4轉(zhuǎn)基因植株體內(nèi)高水平的JA并未強(qiáng)烈地誘導(dǎo)CsPDF1.2的表達(dá)，在Xcc誘導(dǎo)5 d時(shí)，CiNPR4轉(zhuǎn)基因植株擁有顯著低于 WT植株的CsPDF1.2表達(dá)水平，這些結(jié)果表明 CiNPR4促進(jìn)了SA介導(dǎo)的CsPR1表達(dá)，而抑制了JA介導(dǎo)的CsPDF1.2表達(dá)，此研究結(jié)果不同于AtNPR4正向地調(diào)控SA和JA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的防御反應(yīng)相關(guān)基因 PR-1和PDF1.2的表達(dá)[17]，而與AtNPR1正向地調(diào)控SA信號(hào)而抑制 JA信號(hào)途徑中相關(guān)基因的表達(dá)結(jié)果相同[31]。這種現(xiàn)象的出現(xiàn)可能是因?yàn)镃iNPR4的C-末端不含有AtNPR4氨基酸序列C-末端的VDLNETP基序，而與AtNPR1的C-末端具有某些相似性。

5.企業(yè)與外部利益相關(guān)者的和諧是構(gòu)建和諧企業(yè)的重點(diǎn)。企業(yè)與外部利益相關(guān)者的和諧的基礎(chǔ)是建立企業(yè)與外部利益相關(guān)者的信任機(jī)制。

研究表明，NPR類蛋白不能直接結(jié)合 DNA，需要通過與TGA轉(zhuǎn)錄因子互作，調(diào)控SA下游基因的表達(dá)[11,32]。本研究表明，柑橘 CiNPR4通過與 CsTGA2轉(zhuǎn)錄因子互作，對(duì)SA和JA分別介導(dǎo)的防御反應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)水平進(jìn)行調(diào)控，從而增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植株對(duì)柑橘潰瘍病的抗性。但CiNPR4與CsTGA2形成的復(fù)合物是否結(jié)合在CsPR1和CsPDF1.2的啟動(dòng)子上還需進(jìn)一步的研究。

4 結(jié)論

黃龍病抗性增強(qiáng)的CiNPR4轉(zhuǎn)基因植株獲得了增強(qiáng)的柑橘潰瘍病抗性。CiNPR4與CsTGA2轉(zhuǎn)錄因子互作，在Xcc的誘導(dǎo)下，通過正向調(diào)控SA而抑制JA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中防御反應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)水平，從而提高CiNPR4轉(zhuǎn)基因植株對(duì)柑橘潰瘍病的抗性。