劉春艷，劉杰 ，陳偉，朱守鴻，李燕，曹新川 ，何良榮 ，張永山*

（1塔里木大學(xué)植物科學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300）

（2中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所/棉花生物學(xué)國家重點實驗室，河南 安陽 455000）

棉花是我國重要的經(jīng)濟作物，其產(chǎn)量和品質(zhì)性狀與開花密切相關(guān)。開花是植物生長發(fā)育必經(jīng)的過程，標(biāo)志著植物由營養(yǎng)生長向生殖生長的轉(zhuǎn)變，這是一個環(huán)境信號和內(nèi)源信號共同調(diào)節(jié)的過程。不同的棉種表現(xiàn)出不同的開花時間和溫度敏感反應(yīng)，在溫度、光等環(huán)境因素中，植物對光周期的響應(yīng)是決定最佳開花時間的重要因素[1]。FT（Flowering Locus T）基因是植物開花調(diào)控途徑中的重要整合因子和關(guān)鍵基因[2]，可將上游的信號整合傳遞給下游開花發(fā)育相關(guān)基因以調(diào)控開花。FT蛋白是在植物葉片中產(chǎn)生的成花信號，通過輸導(dǎo)組織長距離運輸?shù)角o尖頂端從而促進開花[3-4]。FT基因與TFL1（Terminal Flower 1）基因均為磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白（phosphatidyl ethanolamine-binding proteins，PEBP）家族的成員，因兩個氨基酸位點的差異而具有相反的調(diào)節(jié)功能[5]，組成型表達TFL1基因可延遲開花[6]，組成型表達FT基因可提前開花[7]。

近幾年已在多種植物中克隆到FT同源基因，并通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)證明FT基因的表達可促進植物提早開花[8-10]。郭丹麗等[11]在擬南芥中過表達GhFT1基因，擬南芥出現(xiàn)早花表型。東銳等[12]克隆了棉花FT基因，轉(zhuǎn)化擬南芥表現(xiàn)為提早開花。樊紅娟等[13]發(fā)現(xiàn)FT基因能促進棉花植株開花形成花蕾，GhFT基因的表達量隨著棉花植株從營養(yǎng)生長向生殖生長的過渡越來越高。這些研究成果為進一步探索FT基因的作用機制奠定了基礎(chǔ)，然而其在基因組中的分布、進化特性仍不清楚。PEBP基因家族分為3個亞家族，本試驗利用生物信息學(xué)的方法，對FT-like亞家族中的FT基因的理化特性、基因結(jié)構(gòu)、蛋白結(jié)構(gòu)等進行詳細分析。此外，棉花中FT基因的時空表達模式研究多是針對田間材料不同發(fā)育階段而言，本試驗以陸地棉TM-1為試驗材料，除對田間GhFT基因在不同組織中的表達進行定量分析，室內(nèi)還通過不同的光周期處理驗證GhFT的表達與光周期之間的相關(guān)性，田間與室內(nèi)試驗結(jié)合以確定棉花FT基因的時空表達模式，旨在為FT基因相關(guān)研究提供理論依據(jù)，為探索FT基因在棉花發(fā)育調(diào)控中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 棉花FT同源基因鑒定及特征分析

從 Cottongen數(shù)據(jù)庫（https://www.cottongen.org/）下載雷蒙德氏棉（Gossypium raimondiiU1bich）、海島棉（Gossypium barbadenseL.）、陸地棉（Gossypium hirsutumL.）、亞洲棉（Gossypium arboreumL.）、草棉（Gossypium herbaceumL.）、長萼棉（Gossypium longicalyxHutchinson&Lee）、瑟伯氏棉（Gossypium thurberiTodaro）、澳洲棉（Gossypium australF.von Mueller）、擬似棉（Gossypium gossypioides(Ulbrich)Standley）、特倫納氏棉（Gossypium turneriFryxell）、達爾文氏棉（Gossypium darwiniiWatt）、夏威夷棉（Gossypium tomentosumNuttall ex Seemann）、黃褐棉（Gossypium mustelinumMiers ex Watt）的基因蛋白序列信息文件。

從 CottonFGD 數(shù)據(jù)庫（https://cottonfgd.org/）以PF01161為查詢條件，下載Gorai.004G264600（GrFT）基因蛋白序列，將GrFT基因編碼的蛋白序列與13個棉種分別進行雙向比對（blast），預(yù)測與GrFT同源的候選基因，選擇E值最小的基因提取其蛋白序列，利用 Pfam（http://pfam.xfam.org/search#tabview=tab1）、CDD（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi）和Batch SMART_v1.0基于保守結(jié)構(gòu)域（domain）對候選基因進行鑒定，剔除不含保守結(jié)構(gòu)域、長度異常的基因。使用CELLO v.2.5在線預(yù)測網(wǎng)站（http://cello.life.nctu.edu.tw/）對鑒定出的FT基因進行蛋白質(zhì)亞細胞定位預(yù)測，F(xiàn)T基因編碼的蛋白序列刪除ID后提交到ExPASy（https://web.expasy.org/compute_pi/）對蛋白的相對分子量和等電點進行分析。

1.2 FT同源基因系統(tǒng)進化、蛋白基序、基因結(jié)構(gòu)和保守結(jié)構(gòu)域分析

將不同物種的FT基因的蛋白序列導(dǎo)入Geneious?10.2.2進行多序列比對，簡化ID后利用MEGA 7.0軟件計算最佳模型，采用最大似然法（maximum likelihood，ML）構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。利用Simple MEME Wrapper工具（TBtools）對蛋白保守基序進行分析。整理保守結(jié)構(gòu)域信息和蛋白序列長度信息，利用Simple BioSequence Viewer工具（TBtools）進行保守結(jié)構(gòu)域繪制，利用Gene Structure View工具（TB-tools）繪制進化樹、motif、基因結(jié)構(gòu)和domain組合圖。

1.3 FT基因啟動子順式作用元件分析

從CottonFGD數(shù)據(jù)庫提取陸地棉（AD1）、海島棉（AD2）、亞洲棉（A2）和雷蒙德氏棉（D5）中FT基因編碼序列（coding sequence，CDS）上游2000 bp的序列，從Cottongen數(shù)據(jù)庫下載其余9個棉種的全基因組基因結(jié)構(gòu)注釋文件和全基因組序列文件。利用TBtools中的Gtf/Gff3 Sequences Extract工具和Fasta Extract or Filter工具分別提取9個棉種的FT基因CDS上游2 kb的序列。整合所有FT基因CDS上游2000 bp的序列，提交到PlantCARE網(wǎng)站（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）進行順式作用元件分析，利用TBtools進行可視化。

1.4 主栽棉種FT基因表達模式分析

以基因ID作為查詢條件，從Cotton Omics Database數(shù)據(jù)庫（http://cotton.zju.edu.cn/index.htm）下載陸地棉和海島棉中FT基因的表達譜數(shù)據(jù)，利用Heat-Map工具（TBtools）繪制FT基因表達熱圖。

1.5 陸地棉GhFT基因的表達模式分析

1.5.1 試驗材料與處理

以陸地棉遺傳研究的標(biāo)準系TM-1為試驗材料，種植于3個不同環(huán)境。

環(huán)境1：田間（自然光照）種植于河南省安陽市白璧鎮(zhèn)中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所東場試驗基地，于盛花期掛牌標(biāo)記當(dāng)日花，記為開花后0天（day post anthesis，DPA），并取開花當(dāng)天的不同組織（根、下胚軸、主莖莖尖、果枝莖尖、子葉、幼葉、苞葉、萼片、花瓣、花藥、花絲、柱頭、胚珠），摘取3 DPA、5 DPA、10 DPA的棉鈴，室內(nèi)剝?nèi)±w維，液氮速凍后于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

環(huán)境2：28℃溫室條件下于營養(yǎng)缽中種植，進行長日照處理（long-day，LD），光照時間16 h（09:00-次日01:00），光照強度為200 μmol/（m2·s-1），在五葉期于1 d內(nèi)間隔4 h取倒3葉和主根，盛花期取主莖葉（按照生育期的大小把葉齡劃分為8個等級，如圖1所示），液氮速凍后于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 TM-1葉齡劃分

環(huán)境3：進行短日照處理（short-Day，SD），光照時間8 h（09:00—17:00），其他條件同環(huán)境2，于五葉期1 d內(nèi)間隔4 h取倒3葉和主根，液氮速凍后于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 RNA的提取和cDNA的合成

按照EASYspin Plus植物RNA快速提取試劑盒（艾德萊生物）的操作步驟提取基因組RNA（操作均在低溫條件下進行），并用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa）試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。

1.5.3 熒光定量PCR

在GhFT基因（登錄號：HM631972）的編碼序列中設(shè)計一對特異引物GhFT_248_F和GhFT_457_R，并用棉花中Actin14同源基因（GI號：AY305733）作為內(nèi)參基因設(shè)計特異引物進行定量分析，引物序列信息見表1。

表1 引物信息

熒光定量PCR體系由5.0 μL 2×SYBR Premix Ex Taq染料，0.2 μL ROX Reference Dye Ⅱ，1.6 μL模板，0.4 μL Primer-F，0.4 μL Primer-R，2.4 μL滅菌水組成，總體系為10 μL。利用Applied Biosystems 7500 Realtime PCR System熒光定量PCR儀進行擴增，檢測每份樣品的GhFT基因和Actin內(nèi)參基因的CT值，反應(yīng)程序為95℃ 30 s、95 ℃ 5 s、60 ℃ 34 s，40個循環(huán)。每個樣品3個生物學(xué)重復(fù)，每次試驗設(shè)置3個技術(shù)重復(fù)。

1.5.4 數(shù)據(jù)處理

使用Microsoft Office Excel 2016整理數(shù)據(jù)，用SPSS Statistics 17.0進行差異顯著性（P＜0.05）檢驗，用Origin 9.1、Prism 8.0.2等軟件進行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 13個棉種FT同源基因及其序列特征

通過序列比對和保守結(jié)構(gòu)域篩選，13個棉種共鑒定出18個FT基因，其中二倍體棉種均有1個FT基因，四倍體棉種A、D亞組各有1個FT基因，按照物種－基因的命名方式對鑒定出的FT基因進行命名（表2），并對其序列特征進行分析。從表2可以發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)T基因的長度介于795 bp和3580 bp之間，除GkirFT基因和GthuFT基因外，不同棉種中的FT基因序列長度差異不大。CDS長度除GthuFT基因（591 bp）外其余FT基因均為525 bp。來自不同棉種的FT基因的相對分子量沒有明顯差別，平均為19.56 kDa，編碼的蛋白長度均為174個氨基酸。除GheFT基因（等電點為7.8）、GthuFT基因（等電點為9.45）和GkirFT基因（等電點為9.45），其余15個FT基因的等電點為6.73。對來自13個棉種的18個FT基因編碼的蛋白進行亞細胞定位預(yù)測，結(jié)果表明，16個基因均定位于細胞質(zhì)和細胞外，只有GkirFT基因在葉綠體有定位。

表2 棉花FT基因的序列特征

2.2 FT基因系統(tǒng)進化、蛋白基序、基因結(jié)構(gòu)和保守結(jié)構(gòu)域分析

采用最大似然法構(gòu)建13個棉種FT基因的系統(tǒng)進化樹（圖2），整個進化樹主要分為2個亞組，組Ⅰ僅有2個成員，即GthuFT基因和GkirFT基因；組Ⅱ包含來自11個棉種的16個成員。保守基序分析發(fā)現(xiàn)，18個FT基因均含有Motif 1（50個保守氨基酸）、Motif 2（50個保守氨基酸）、Motif 3（36個保守氨基酸）和Motif 4（26個保守氨基酸），說明這18個基因擁有相似的功能。基因結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，不同棉種中的FT基因含有相同數(shù)量的外顯子和內(nèi)含子（4個外顯子，3個內(nèi)含子），根據(jù)外顯子與內(nèi)含子結(jié)構(gòu)可將所有FT基因分為2組，這與ML進化樹的分組結(jié)果一致。保守結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，同一組的FT基因具有相同的結(jié)構(gòu)域，組Ⅰ的基因都含有4個PEBP結(jié)構(gòu)域，組Ⅱ的基因均含有4個PLN00169結(jié)構(gòu)域。

圖2 FT基因的進化、基因結(jié)構(gòu)及編碼蛋白結(jié)構(gòu)分析

2.3 FT基因啟動子順式作用元件

為了進一步研究FT基因的調(diào)控機制，提取FT基因CDS上游2 kb的核苷酸序列進行啟動子區(qū)域順勢作用元件預(yù)測，結(jié)果如圖3所示?？偣差A(yù)測到15種順勢作用元件，這些順式作用元件決定了FT基因?qū)δ婢趁{迫（低溫、干旱、缺氧等）、激素（生長素、脫落酸、赤霉素等）、光等的響應(yīng)機制。18個FT基因中GturFT基因含有的作用元件類型最豐富（11類），GrFT基因和GbFT.A基因含有的元件類型最少，均為5類。此外，15種順勢作用元件中有3種類型是獨特的，參與胚乳表達（endosperm expression）的順式調(diào)節(jié)元件僅GthuFT基因含有，參與晝夜節(jié)律（circadian control）控制的順式調(diào)節(jié)元件僅GbFT.D基因含有，涉及防御和應(yīng)激反應(yīng)（defense and stress responsive）的順式作用元件僅GhFT.D基因含有。所有的FT基因除GthuFT基因外均含有赤霉素響應(yīng)元件，除GkirFT基因均含有光響應(yīng)元件，推測FT基因的表達受光周期調(diào)控。

圖3 FT基因啟動子順式作用元件分布

2.4 主栽棉種FT基因表達模式分析

以陸地棉和海島棉中FT基因為代表，從公共數(shù)據(jù)庫下載相應(yīng)基因的表達譜數(shù)據(jù)，對FT基因的表達模式進行分析。從圖4可以看出，GbFT.A基因、GbFT.D基因、GhFT.A基因、GhFT.D基因在Hai7124的10 DPA、20 DPA的纖維、胚珠、花藥、花瓣、雌蕊、根和莖中幾乎不表達，在副萼、葉、萼片中有表達，在花托中優(yōu)勢表達，A亞組的2個FT基因在25 DPA的纖維中有相對較高表達。對FT基因在TM-1不同組織中表達進行分析發(fā)現(xiàn)，4個基因在胚珠、花藥、花瓣、根和莖中幾乎不表達，在葉中有較高表達，A亞組的2個基因在20 DPA的纖維、花托中優(yōu)勢表達，在副萼、雌蕊中有較高表達，D亞組的2個基因在花托中有優(yōu)勢表達。

圖4 FT基因表達熱圖

2.5 陸地棉GhFT基因的表達模式分析

2.5.1GhFT基因在不同組織中的mRNA轉(zhuǎn)錄水平比較

提取田間TM-1不同組織的RNA，反轉(zhuǎn)錄后進行GhFT基因熒光定量表達分析，結(jié)果如圖5所示：GhFT基因在苞葉中的表達量最高；其次是萼片；在子葉，莖尖和柱頭中的表達量相較于其他組織略高；在幼葉、花瓣、花絲、胚珠、5 DPA纖維、10 DPA纖維中只能檢測到微弱的GhFT基因表達；在根、下胚軸、花藥、3 DPA的纖維中幾乎無表達。

圖5 GhFT基因在不同組織的表達量

2.5.2GhFT基因在不同葉齡中的mRNA轉(zhuǎn)錄水平比較

GhFT基因在變態(tài)型葉（苞葉和萼片）中的表達量均高于幼葉，推測GhFT基因可能在較成熟的葉片中具有高表達，與模式植物擬南芥的表達模式相符。因此本試驗對室內(nèi)長日照條件下取得的1～8葉齡的葉片進行表達定量分析，結(jié)果如圖6A所示：隨著葉齡的增加，GhFT基因的表達量也在增加，至葉齡8時到達最大。GhFT基因在成熟葉片中的表達量高于葉片剛發(fā)育時期的表達量，這也為實驗取樣提供一個數(shù)據(jù)依據(jù)。在此基礎(chǔ)上，本試驗對成熟葉片不同部位進行了GhFT基因表達量分析（圖6B），方差分析結(jié)果顯示同一葉片不同部位中的GhFT基因表達量不存在顯著差異，在取樣時應(yīng)當(dāng)盡量選取成熟葉片來檢測GhFT基因的表達量。

圖6 葉片中GhFT基因的表達量

2.5.3GhFT基因在不同光周期處理下mRNA轉(zhuǎn)錄水平比較

TFL1基因在根中具有較高表達[14]，F(xiàn)T基因與其擁有相反的調(diào)節(jié)功能，猜測FT基因在根中也會有相應(yīng)表達，且FT基因在成熟葉片中具有高表達，順式作用元件分析顯示FT基因的表達可能受光周期調(diào)控，為了探索FT基因與光周期的相關(guān)性，對五葉期的葉和根中的GhFT表達進行定量分析以研究GhFT基因在不同光周期處理下mRNA轉(zhuǎn)錄水平。

室內(nèi)長日照處理條件下，24 h內(nèi)每間隔4 h取樣進行熒光定量PCR，定量分析結(jié)果驗證了GhFT的表達與光周期之間的相關(guān)性。結(jié)果如圖7所示：GhFT基因在根中幾乎不表達，在葉片中的最高表達量顯著高于在根中的表達量。葉片中GhFT基因的表達量在光照條件下一直在下降，至暗培養(yǎng)開始（16 h）降至1 d內(nèi)的最低點，然后開始積累，暗培養(yǎng)結(jié)束（24 h或0 h）時GhFT基因的表達量達到最大，說明在LD處理下，葉片中GhFT基因的表達量是在黑暗條件下進行積累的。

圖7 長日照處理下GhFT基因在葉片和根中的表達量

從圖8可以看出：在短日照處理下，GhFT基因在根中的最高表達量顯著高于在葉中的最高積累量；1 d內(nèi)GhFT基因在根和葉片中的表達量變化呈晝夜節(jié)律現(xiàn)象。根中GhFT基因表達量在光照條件下（0～8 h）急劇下降，暗培養(yǎng)4 h后急劇上升至暗培養(yǎng)8 h（16 h）達到1 d內(nèi)的最高點，然后急劇下降，暗培養(yǎng)12 h后達到1 d內(nèi)的最低點，繼續(xù)暗培養(yǎng)又開始上升，說明在SD處理下根中GhFT基因表達是在暗培養(yǎng)條件下進行積累的。葉片中GhFT的mRNA水平與GUO D L等[15]的結(jié)果一致，在光照4 h后達到1 d內(nèi)最高點，然后開始慢慢下降，直到暗培養(yǎng)12 h（20 h）后降至1 d內(nèi)最低點，之后表達量逐漸上升，表明SD處理條件下葉片中GhFT基因的表達量是在光照培養(yǎng)開始前已經(jīng)開始積累。

圖8 短日照處理下GhFT基因在葉片和根中的表達量

3 結(jié)論與討論

本研究利用生物信息學(xué)的方法從13個棉種中鑒定出了18個FT基因，這些基因具有相似的功能，其理化性質(zhì)、保守基序沒有明顯差異，進化關(guān)系分析結(jié)果顯示同一類群的FT基因的基因結(jié)構(gòu)和蛋白結(jié)構(gòu)相似。定量分析結(jié)果顯示陸地棉TM-1不同組織中GhFT基因的表達量存在較大差異，GhFT基因在胚珠、根中表達量很低，在萼片中表達量較高，這與基于公共數(shù)據(jù)分析的FT基因的表達模式一致。東銳等[12]的研究表明FT基因在葉片和胚珠的表達量較高，這與本研究結(jié)果存在分歧，可能是光照時長差異造成的。針對FT基因的研究，通常情況下會選擇RNA含量和豐度較高的幼嫩葉片。本研究結(jié)果表明葉片越成熟，GhFT基因的表達量越高，同一葉片不同部位中的表達量不存在顯著差異，取樣時選擇成熟的葉片比選取初生的嫩葉進行定量分析結(jié)果更可靠，這對研究FT基因適宜取樣時期的選擇具有指導(dǎo)意義。本研究在分析葉片中GhFT基因的表達量隨葉齡變化的情況時未曾考慮衰老葉片，針對實驗完整性有待進一步補充驗證。

擬南芥和菊花FT同源基因的表達與日照長短息息相關(guān)，F(xiàn)T基因在不同的日照長度下mRNA轉(zhuǎn)錄水平不同，只在適宜開花的光照條件下才會積累。長日照屬性的擬南芥AtFT基因僅在長日照下積累，菊花CmFT基因是在短日照下有相對較高的積累，長日照處理下幾乎不表達[16]。本研究結(jié)果表明GhFT基因的表達同AtFT基因和CmFT基因一樣受光周期的影響，在LD處理下，GhFT基因在根中幾乎不表達，在葉片中具有相對較高的表達；在SD處理下，GhFT基因在葉片和根中均有表達，在根中的表達積累明顯高于LD處理下的，這可為研究GhFT基因?qū)嶒灜h(huán)境的選擇提供參考。棉花葉片和根中的GhFT基因表達量在不同的光照時間下表達量不同，并對光照時間長短存在響應(yīng)機制[15]，這與光周期誘導(dǎo)開花密切相關(guān)，具體調(diào)控機制有待進一步探索。