張婉琪，趙玉賓，丁繁萍，王青青，王哲紅，胡建軍*

（1塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300）

（2哈密市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，新疆 哈密 839000）

（3塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300）

（4哈密市信訪局，新疆 哈密 839000）

乳頭瘤病毒(papillomaviruses，PV)是一種常見(jiàn)的傳染性病原體，廣泛存在于自然界[1]能感染人[2-3]和大多數(shù)動(dòng)物[4-5]。其中，牛乳頭狀瘤病(Bovine papillomatosis，BP)是由牛乳頭瘤病毒(Bovine papillomavirous，BPV)引起的一種引發(fā)良性或惡性上皮細(xì)胞增生的腫瘤性疾病，也稱為疣[6]，主要表現(xiàn)為皮膚、黏膜形成纖維乳頭狀瘤[7-8]。該病呈世界流行，患畜感染病毒后或因繼發(fā)感染造成生產(chǎn)性能的下降，嚴(yán)重的惡性腫瘤病變可導(dǎo)致患畜死亡，牛乳頭狀瘤的傳播給養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[9]。

目前，已知的BPV基因型至少有24種，另外尚有未分型的假定基因型[10-11]。BPV的基因組主要由早期轉(zhuǎn)錄區(qū)、晚期轉(zhuǎn)錄區(qū)和長(zhǎng)控區(qū)3部分組成，其中L1基因位于晚期轉(zhuǎn)錄區(qū)具有一定的免疫原性，可作為基因工程疫苗的候選基因。本研究在前期已完成對(duì)新疆南疆地區(qū)牛乳頭瘤病毒1型全長(zhǎng)分析及L1基因克隆基礎(chǔ)上，以牛乳頭瘤病毒1型L1基因?yàn)槟康幕?，設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物擴(kuò)增該基因片段，將獲得的目的基因序列構(gòu)建在pET32a表達(dá)載體中，在宿主菌BL21中進(jìn)行體外誘導(dǎo)表達(dá)，以期獲得L1蛋白為后續(xù)基因工程疫苗的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

牛乳頭狀體表贅生物樣品來(lái)源于新疆南疆某牛場(chǎng)。大腸埃希菌DH5α、BL21（DE3）、原核表達(dá)載體pET-32a，均由本實(shí)驗(yàn)室自行構(gòu)建保存。2×Taq pfu PCR Mastermix，pGM-T載體連接試劑盒，普通瓊脂糖凝膠回收試劑盒，質(zhì)粒小提取試劑盒，低分子量蛋白MARK均購(gòu)自天根生物技術(shù)有限公司；限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ，XholⅠ購(gòu)自大連寶生物（TATARA）公司；E.Z.N.A.Cycle-Pure Kit、E.Z.N.A.Tissue DNA Kit購(gòu)自美國(guó)OMEGA公司；蛋白MARK購(gòu)自Thermo生物科技公司；SDS-PAGE凝膠試劑盒購(gòu)自北京索來(lái)寶生物技術(shù)有限公司；醋酸纖維膜、Western blot試劑購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；Anti-HPV antibody[BPV-1/1H8+CAMVIR]單克隆抗體購(gòu)自Abcom公司，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)購(gòu)自北京中彬金橋生物技術(shù)有限公司；顯影定影試劑盒，超敏ECL化學(xué)發(fā)光即用型底物購(gòu)自博士德生物工程有限公司；其余耗材試劑為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口的分析純?cè)噭?/p>

1.2 引物的設(shè)計(jì)與合成

依據(jù)GenBank中已發(fā)表的牛乳頭瘤病毒1型全基因組編碼序列（KX907623.1）中的L1基因，利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)1對(duì)上游下游分別含有EcoRⅠ和XholⅠ限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的引物如下。上游引物：5’-ATGAATTCATGGCGTTGTGG-3’（下劃線為酶切位點(diǎn)）；下游引物：5’-CCGCTCGAGGTGCAGTTGACTTACCTTCTG-3’（下劃線為酶切位點(diǎn)）。引物送生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3 牛乳頭瘤病毒1型L1基因的擴(kuò)增與回收

-20℃凍存DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系：模板DNA 5.0 μL，ddH2O 18.0 μL，2×Tap pfu PCR Master Mix 2.0 μL，引物 Primer F 1.0 μL，引物Primer R 1.0 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s；58℃退火45 s；72℃每kb延伸1 min30 s；35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，確定擴(kuò)增片段大小。

1.4 牛乳頭瘤病毒1型L1基因的克隆與表達(dá)

純化回收的L1基因和pET-32a進(jìn)行轉(zhuǎn)化連接，并在大腸桿菌細(xì)胞中表達(dá)。以不同濃度的IPTG(0.4～ 1.0 mmol/L)和不同時(shí)間間隔(1 h、2 h、3 h、4 h、5h、6 h)誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白，檢測(cè)其最佳表達(dá)水平，采用SDS-PAGE分析蛋白表達(dá)情況。重組蛋白經(jīng)His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒(包涵體蛋白)純化，SDS-PAGE和Western blot鑒定分析。

2 結(jié)果

2.1 L1基因的PCR擴(kuò)增與重組載體的構(gòu)建

以牛乳頭瘤病毒1型為模版基因組，設(shè)計(jì)L1基因特異性引物，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠，結(jié)果表明，PCR產(chǎn)物擴(kuò)增大小為1488 bp，與預(yù)期目的片段大小相符，未見(jiàn)非特異性擴(kuò)增條帶（圖1）。用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和XholⅠ分別雙酶切膠回收目的片段和pET-32a質(zhì)粒，分別純化回收目的基因L1小片段和載體pET-32a大片段，連接轉(zhuǎn)化，菌液PCR擴(kuò)增，將鑒定為陽(yáng)性克隆的重組質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ和XholⅠ雙酶切，獲得約5.4 kb和1.5 kb兩條帶，大小與載體片段和目的片段長(zhǎng)度相符（圖2）。測(cè)序結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)原核表達(dá)載體構(gòu)建成功。

圖1 BPV1L1 PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

圖2 重組質(zhì)粒pET-32a-BPV-L1的PCR和酶切鑒定

2.2 基因序列分析

經(jīng)測(cè)序后，獲得L1基因全長(zhǎng)序列，序列長(zhǎng)度為1488 bp，與BPV-1參考株（X02346和NC001522）核苷酸同源性均達(dá)到99.70%，氨基酸同源性均達(dá)到99.20%；與BPV-2型參考株（PPB2CG和KC878306）的核苷酸同源性均達(dá)到了84.50%，氨基酸同源性分別為 92.50%、92.10%；與 BPV-13型參考株（JQ798171）的核苷酸同源性達(dá)到了85.70%；氨基酸同源性為92.70%。L1基因與BPV-1參考株（X02346和NC001522）相比，5處發(fā)生突變：A135G、C1043A、C1052A、G1192C、C1251G，其中同義突變兩處，錯(cuò)義突變3處，348位氨基酸由蘇氨酸變?yōu)樘於彼峒碩hr→Asn，351為氨基酸由蘇氨酸變?yōu)橘嚢彼峒碩hr→Lys，398位氨基酸由谷氨酸變?yōu)楣劝滨０芳碐lu→Gln。

2.3 L1蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)

參照ExPASy Tools軟件將L1基因核苷酸序列轉(zhuǎn)為氨基酸序列，比對(duì)結(jié)果如表1。

表1 L1蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)

2.4 L1蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)

參照ExPASy Tools軟件中的SOSUI分析工具，將L1基因核苷酸序列轉(zhuǎn)為氨基酸序列，比對(duì)結(jié)果顯示，L1二級(jí)結(jié)構(gòu)中無(wú)規(guī)則卷曲所有結(jié)構(gòu)中占39.80%，見(jiàn)表2。

表2 L1蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)

2.5 L1蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

參照ExPASy Tools軟件中的SWISS-MODEL和Phyre分析工具，將L1基因核苷酸序列轉(zhuǎn)為氨基酸序列，在線分析蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)可見(jiàn)，預(yù)測(cè)的蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)表明多呈現(xiàn)無(wú)規(guī)則卷曲的分布，如圖3。

圖3 L1蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

2.6 牛乳頭瘤病毒1型L1基因原核表達(dá)與檢測(cè)

提取IPTG誘導(dǎo)后的BL21大腸桿菌中的蛋白，經(jīng)12%分離膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析得到大小約在75 kD處有目的條帶，而空的表達(dá)載體pET-32a在該位置處沒(méi)有條帶(圖4)，結(jié)果與預(yù)期結(jié)果相同，說(shuō)明L1蛋白可以在外源細(xì)胞（BL21）中表達(dá)。

2.7 重組蛋白誘導(dǎo)條件的優(yōu)化

經(jīng)測(cè)序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21后，在不同IPTG誘導(dǎo)濃度下，當(dāng)IPTG終濃度為0.8 mmol/L時(shí)可以從蛋白電泳圖中明顯看出重組蛋白表達(dá)；當(dāng)改變誘導(dǎo)時(shí)間時(shí)，誘導(dǎo)時(shí)間為4 h時(shí)，從蛋白電泳條帶可明顯看出重組蛋白表達(dá)；結(jié)果如圖5所示。

圖5 重組蛋白誘導(dǎo)條件優(yōu)化電泳圖

2.8 重組蛋白可溶性分析及純化蛋白Western blot檢測(cè)

按照優(yōu)化后條件誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白，超聲破碎后分別收集沉淀和上清進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，結(jié)果表明蛋白主要在沉淀中（包涵體）表達(dá)（圖6）。收集純化后蛋白，轉(zhuǎn)膜后經(jīng)1:1500稀釋的商品化的一抗Anti-HPV antibody[BPV-1/1H8+CAMVIR]孵育，再經(jīng)1:2000稀釋的特定的HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗即辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)孵育。用手術(shù)剪剪取75 kD處PVDF膜，經(jīng)過(guò)X膠片的顯影定影后，可見(jiàn)明顯條帶（圖6），表明目的蛋白表達(dá)成功。

圖6 重組蛋白可溶性分析及Western blot檢測(cè)

3 討論

乳頭瘤病是自然界中一種較為常見(jiàn)的腫瘤性疾病，可以感染多種宿主。大多數(shù)的牛乳頭瘤病毒感染患畜可以自行痊愈，但嚴(yán)重的惡性腫瘤是無(wú)法治愈的，甚至可引起患畜死亡，造成養(yǎng)牛業(yè)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。新疆本地也有發(fā)生，賀志昊[14]對(duì)新疆北疆地區(qū)牛乳頭瘤病毒感染進(jìn)行了流行病學(xué)研究，并對(duì)主要流行株進(jìn)行了基因分型和蛋白表達(dá)研究。王青青等[15]、張婉琪等[16-18]對(duì)新疆南疆地區(qū)的牛乳頭狀瘤感染進(jìn)行了鑒定與分型工作。目前，國(guó)內(nèi)外還沒(méi)有合適的疫苗用于BPV的預(yù)防，因此疫苗的研究具有實(shí)踐意義。

BPV為DNA病毒，閉合環(huán)狀雙鏈結(jié)構(gòu)，無(wú)囊膜、核衣殼呈二十面立體對(duì)稱。全基因組序列長(zhǎng)約7.3～8.0 kbp，含有牛乳頭瘤病毒基因組所具有的結(jié)構(gòu)特征。在晚期表達(dá)的基因組中包含L1和L2，在BPV基因組中，作為最保守的片段常被用來(lái)鑒定新的基因型。LOVE A J等[19]研究首次報(bào)道了在本氏煙草內(nèi)成功表達(dá)并分離了完整的BPV-1L1類病毒顆粒(VLPs)，且證明了這些病毒顆?？梢鸶邚?qiáng)度的特異性免疫反應(yīng)，為潛在疫苗的制備提供了一個(gè)新的方向。

目前，解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的常見(jiàn)實(shí)驗(yàn)方法主要為核磁共振、X射線晶體學(xué)和冷凍電鏡等，實(shí)驗(yàn)成本相對(duì)較高。特別是對(duì)于體外表達(dá)存在困難的大分子量的單一蛋白來(lái)說(shuō)，獲得高質(zhì)量樣品用于結(jié)構(gòu)解析是具有挑戰(zhàn)性的，蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)為蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的研究提供了可能。

本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)BPV-1 L1蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析可知，蛋白不穩(wěn)定系數(shù)為39.42，平均疏水性-0.466，表明該蛋白是具有親水性且分子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定；蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析可知，無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)占比高，達(dá)到39.80%，L1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)以無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)為主要優(yōu)勢(shì)；同時(shí)，在蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)中，BPV-1 L1蛋白的無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)多位于分子表面，而無(wú)規(guī)卷曲占據(jù)較多，容易形成抗原表位，而L1蛋白這種三級(jí)結(jié)構(gòu)保守性所對(duì)應(yīng)的多種抗原表位對(duì)刺激機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性抗體十分有利，有助于篩選相應(yīng)的抗原決定簇和靶向目標(biāo)分子，可進(jìn)一步利用其研發(fā)疫苗。

L1基因編碼的蛋白具有較高的保守性，是病毒的主要衣殼蛋白，同時(shí)也是常見(jiàn)的用于研究乳頭瘤病毒基因疫苗的備選基因。本研究中Western blot試驗(yàn)也證實(shí)了經(jīng)蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)獲得的純化L1蛋白能與牛乳頭瘤病毒1型特異性抗體發(fā)生結(jié)合反應(yīng)，具有良好的反應(yīng)原性，驗(yàn)證了本研究中的L1蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)為有效的，這為研制疫苗奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)成功構(gòu)建BPV-1-L1原核表達(dá)體系并表達(dá)目的蛋白，為后續(xù)L1基因相關(guān)疫苗與診斷試劑的研究奠定了基礎(chǔ)。