程 喆 文 靜 韓 瑩 金建秋 李斌斌 宋江園 徐 偲 劉曉丹 崔紅梅 趙忠芳 王 倩 郭 驤 魯明星 劉宏偉

天皰瘡是一種自身免疫性大皰類疾病，中老年人好發(fā)，亞洲地區(qū)的黃色人種也是好發(fā)人群[1，2]。尋常型天皰瘡（pemphigus vulgaris，PV）是口腔黏膜最常見(jiàn)的一型。

PV 被認(rèn)為是一種自身免疫病，患者循環(huán)血中出現(xiàn)針對(duì)自身棘層細(xì)胞表面橋粒的特異性抗體，這些特異性抗體靶抗原是橋粒芯蛋白3（desmoglein-3，Dsg3）和橋粒芯蛋白 1（desmoglein-1，Dsg1）。這兩種橋粒芯蛋白一旦遭到攻擊，上皮細(xì)胞間緊密連接被破壞，就會(huì)導(dǎo)致“棘層松解”，形成“上皮內(nèi)皰”[2～4]。

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測(cè)抗 Dsg3、Dsg1 抗體是近年來(lái)在我國(guó)逐漸采用的診斷方法之一，它可以定性和定量地判斷病情的輕重、指導(dǎo)臨床治療的激素用量[5，6]。本研究將采用多種實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)指標(biāo)分析ELISA 法在診斷口腔天皰瘡中的價(jià)值。

資料和方法

1.研究對(duì)象

選擇2010.1.1～2019.12.31 期間就診于北京大學(xué)口腔醫(yī)院口腔黏膜科的患者，符合以下納入排除標(biāo)準(zhǔn)。

（1）納入標(biāo)準(zhǔn)：①實(shí)驗(yàn)組：經(jīng)臨床和病理診斷為天皰瘡的患者；②對(duì)照組：經(jīng)臨床和病理診斷為類天皰瘡的患者；③年齡為18～85 歲；④未經(jīng)任何治療；⑤無(wú)合并的其他口腔黏膜病；⑥進(jìn)行了ELISA 檢查Dsg3 和Dsg1；⑦無(wú)其他免疫系統(tǒng)疾病和嚴(yán)重全身疾患；⑧無(wú)精神障礙；⑨同意進(jìn)入本研究。

（2）排除標(biāo)準(zhǔn)：①年齡小于18 歲或大于85 歲；②處于妊娠期或哺乳期的女性；③過(guò)敏體質(zhì)者；④病損區(qū)域曾經(jīng)激光、放射或化學(xué)藥物治療；⑤有其他惡性腫瘤等嚴(yán)重全身疾患；⑥有精神障礙；⑦其他原因致不能配合檢查。

2.診斷金標(biāo)準(zhǔn)

天皰瘡和類天皰瘡的診斷參照《口腔黏膜病學(xué)》和《口腔組織學(xué)與病理學(xué)》的診斷標(biāo)準(zhǔn)[2，19]。以組織病理學(xué)診斷作為金標(biāo)準(zhǔn)。

3.ELISA 檢測(cè)方法及結(jié)果的判讀

患者于醫(yī)院檢驗(yàn)科行血清抗Dsg1 和Dsg3 抗體的檢測(cè)。

結(jié)果判讀：抗Dsg1 抗體水平：≥20U/ml 為陽(yáng)性，14～20U/ml 為不確定，＜14U/ml 為陰性?？?Dsg3抗體水平：≥20U/ml 為陽(yáng)性，7～20U/ml 為不確定，＜7U/ml 為陰性?？笵sg1 或Dsg3 抗體任一結(jié)果為陽(yáng)性時(shí)，則記ELISA 結(jié)果為“陽(yáng)性”；其余情況則記為陰性。

4.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

患者的信息進(jìn)行雙人平行錄入，再加第三人核對(duì)，無(wú)誤后使用 IBM SPSS 17.0 軟件（SPSS，Chicago，IL，USA）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料的檢驗(yàn)采用卡方檢驗(yàn)，計(jì)量資料采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。計(jì)算ELISA 法檢出抗Dsg1 或Dsg3 抗體的靈敏度、特異度、準(zhǔn)確度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值和約登指數(shù)，并繪制ROC 曲線。

Logistics 回歸分析的方法選擇向后：條件，協(xié)變量的進(jìn)入概率為0.05，刪除概率為0.10。本研究所有P值均為雙側(cè)檢驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著性水平設(shè)置為P＜0.05。

結(jié) 果

研究對(duì)象包括140 例實(shí)驗(yàn)組的PV 患者以及157 例對(duì)照組的類天皰瘡患者（表1）。實(shí)驗(yàn)組患者中男性44 例，女性96 例，就診時(shí)年齡分布為20～82歲，平均 50.42±12.76 歲；對(duì)照組中男性 53 例，女性125 例，就診年齡分布為26～85 歲，平均59.71±11.81歲。兩組患者間性別差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而年齡差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

納入的2 組患者均具有口腔黏膜損害。實(shí)驗(yàn)組140 例PV 患者中139 例出現(xiàn)鮮紅糜爛面，占99.3%；111 例出現(xiàn)周緣擴(kuò)展或尼氏征，占79.3%；109 例出現(xiàn)口腔黏膜云霧狀水腫，占77.9%；20 例出現(xiàn)水皰病損，占14.3%；33 例患者具有皮膚病損，占23.4%。對(duì)照組157 類天皰瘡患者中，127 例出現(xiàn)糜爛面，占80.9%，顯著低于實(shí)驗(yàn)組，P＜0.05，且糜爛面上覆黃色偽膜，而非鮮紅糜爛面；57 例出現(xiàn)水皰病損，占36.3%，顯著高于實(shí)驗(yàn)組，P＜0.05；出現(xiàn)周緣擴(kuò)展或尼氏征52 例，占33.1%，顯著低于實(shí)驗(yàn)組，P＜0.05；類天皰瘡的口腔黏膜云霧狀水腫（1.9%）及皮損（3.8%）很少見(jiàn)，顯著低于實(shí)驗(yàn)組，P＜0.05；（表 1）。

表1 兩組患者的臨床表現(xiàn)及比率

141 例 PV 患者中，69 例抗 Dsg1 抗體陽(yáng)性，129例抗 Dsg3 抗體陽(yáng)性，131；對(duì)照組中，7 例抗 Dsg1 抗體陽(yáng)性，5 例抗Dsg3 抗體陽(yáng)性?？ǚ綑z驗(yàn)兩組有顯著差異，P＜0.05（表 2）。

表2 ELISA 法檢出抗Dsg1 和抗Dsg3 抗體陽(yáng)性

ELISA 法診斷口腔天皰瘡價(jià)值的診斷指標(biāo)：敏感度為 93.6%（131/140），特異度為 93.3%（147/157），準(zhǔn)確度為93.6%（279/297），陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為92.9%（131/141），陰性預(yù)測(cè)值為 94.2%（147/156），約登指數(shù)為87.2%（93.6%+93.6%-1）。見(jiàn)表3。

表3 評(píng)估ELISA 法診斷價(jià)值的指標(biāo)

ROC 曲線見(jiàn)圖1，結(jié)果顯示抗Dsg3 抗體的ROC 曲線在坐標(biāo)系中最靠近左上角，具有最大的曲線下面積（0.942），診斷能力最強(qiáng)，ELISA 結(jié)果和云霧狀水腫緊隨其后。

圖1 8 種方法診斷天皰瘡的ROC 曲線

抗Dsg3 抗體、ELISA 結(jié)果和云霧狀水腫的ROC 曲線在坐標(biāo)系中靠近左上角，診斷能力很強(qiáng)。

8 種臨床或?qū)嶒?yàn)室指標(biāo)的P 值均小于0.05，說(shuō)明本研究選取的8 個(gè)診斷試驗(yàn)指標(biāo)均對(duì)于診斷天皰瘡有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。按照ROC 曲線下面積從大到小排列的指標(biāo)順序是：抗Dsg3 抗體陽(yáng)性、ELISA（抗Dsg1或Dsg3 抗體陽(yáng)性、云霧狀水腫、周緣擴(kuò)展或尼氏征、抗Dsg1 抗體陽(yáng)性、皮損、鮮紅糜爛面和水皰?？笵sg3 抗體陽(yáng)性、ELISA 結(jié)果和云霧狀水腫的ROC曲線同樣很靠近左上角，是正向預(yù)測(cè)里面積＞0.85的、效果很好的診斷實(shí)驗(yàn)指標(biāo)；周緣擴(kuò)展或尼氏征、抗Dsg1 抗體陽(yáng)性、皮損和鮮紅糜爛面的ROC 曲線下面積是大于0.5 的正向預(yù)測(cè)值，但在0.5～0.7 之間的診斷效果欠佳。水皰的ROC 曲線下面積是小于0.5 的是反向預(yù)測(cè)值，診斷不準(zhǔn)確，見(jiàn)表4。

表4 ROC 曲線下的面積

以是否診斷為天皰瘡為因變量，以性別、年齡、有無(wú)皮損、有無(wú)鮮紅糜爛面、有無(wú)云霧狀水腫、有無(wú)水皰、有無(wú)周緣擴(kuò)展或尼氏征、Dsg1 結(jié)果、Dsg3 結(jié)果和Dsg1 結(jié)果、Dsg1 或Dsg3 結(jié)果作為協(xié)變量，進(jìn)行Logistics 回歸分析。揭示：抗Dsg3 抗體陽(yáng)性（OR＝23.332，P＝0.000）、云霧狀水腫（OR＝19.725，P＝0.000）、周緣擴(kuò)展或尼氏征（OR＝4.822，P＝0.027）、年齡（OR＝6.106，P＝0.013）是診斷為天皰瘡的風(fēng)險(xiǎn)因素。而性別、皮損、鮮紅糜爛面、有無(wú)水皰、抗Dsg1抗體陽(yáng)性和ELISA 結(jié)果患天皰瘡無(wú)顯著性相關(guān)（表5）。

表5 天皰瘡的Logistics 回歸分析

討 論

PV 是一種嚴(yán)重的慢性自身免疫性大皰性疾病，可以導(dǎo)致全身皮膚或者黏膜反復(fù)起皰、破潰、糜爛、滲出，其中口腔黏膜是起最常見(jiàn)的初發(fā)區(qū)域，甚至有的患者僅有口腔黏膜病損。本研究中PV 患者全部具有口腔病損，只有約四分之一的患者具有皮膚病損。

PV 預(yù)后較差，給患者的生活帶來(lái)極大地不適，如病情不加控制，甚至能引起電解質(zhì)紊亂、嚴(yán)重感染、惡病質(zhì)，最終危及生命[2]。因此疑似PV 的患者應(yīng)該引起臨床大夫的重視，做到早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療，以減輕患者的痛苦，避免病情加重，同時(shí)也可以從某種程度上控制糖皮質(zhì)激素的用量，預(yù)防其副作用的發(fā)生。

對(duì)本研究選取一些天皰瘡臨床特征性指標(biāo)，如鮮紅糜爛面、水皰、周緣擴(kuò)展或尼氏征，其判斷是具有主觀性的，是需經(jīng)過(guò)訓(xùn)練的口腔黏膜病?？漆t(yī)生才能識(shí)別的。因?yàn)樘彀挴彴l(fā)生的是上皮內(nèi)皰，皰壁很薄，水皰難以長(zhǎng)期存留在口腔而不易多見(jiàn)，這是水皰比率低的原因；皰破后露出的鮮紅糜爛面就較水皰更多見(jiàn)，因此鮮紅糜爛面的發(fā)生比率高于水皰；周緣擴(kuò)展或尼氏征需檢查者掌握技巧和具有檢查意識(shí)，檢出率也因此不高；云霧狀水腫雖檢出比率高，但是常不易與口腔黏膜白色病損鑒別，特異性差；就診于口腔黏膜科的天皰瘡患者皮損比率本身就很低；相比之下，用ELISA 法檢出抗 Dsg3、抗 Dsg1 抗體就很客觀，且陽(yáng)性率遠(yuǎn)高于上述天皰瘡臨床指標(biāo)，是口腔黏膜病專科醫(yī)師和口腔全科醫(yī)師都可依據(jù)的診斷指標(biāo)。

天皰瘡的診斷往往需要多種方法共同驗(yàn)證，其檢查方法隨時(shí)代發(fā)展日益成熟進(jìn)步，時(shí)至今日，天皰瘡的常用檢查方法包括：臨床檢查、組織病理學(xué)檢查、脫落細(xì)胞學(xué)檢查、直接免疫熒光、間接免疫熒光和ELSIA[6～10]。其中ELISA 是最新提出的檢測(cè)手段，一經(jīng)應(yīng)用便因其少創(chuàng)廣受歡迎，早在上世紀(jì)90 年代就有學(xué)者認(rèn)為ELISA 的敏感度和特異性均很高[11]，是診斷天皰瘡的可靠檢查手段。但在最近10 年，ELISA 才在我國(guó)得到廣泛的認(rèn)同和開(kāi)展。

抗Dsg3、抗Dsg1 抗體這兩種橋粒芯蛋白均隸屬于橋粒鈣黏素家族，可以起到黏附、連接、支持的作用，具有連接相鄰上皮細(xì)胞，維持正常細(xì)胞和組織形態(tài)的功能。一旦Dsg1、Dsg3 遭到攻擊，鈣黏素復(fù)合體的構(gòu)象和穩(wěn)定性均受影響，橋粒的形成受抑，上皮細(xì)胞間的緊密連接被破壞，就會(huì)導(dǎo)致“棘層松解”，形成“上皮內(nèi)皰”[2～4]。因此，抗 Dsg3、抗 Dsg1 抗體既反映天皰瘡的發(fā)病機(jī)制，也與臨床皰損緊密關(guān)聯(lián)。

根據(jù)長(zhǎng)期文獻(xiàn)報(bào)道，ELISA 診斷天皰瘡的敏感度為 80%～100%[12～17]，特異性可達(dá) 90%以上[12，16，17]。在我們的研究中，ELISA 的敏感度和特異性分別為93.6%和93.3%，與既往的研究一致。其準(zhǔn)確度也具有較高的水平，是可靠的診斷工具。

ELISA 在具有高度敏感度和特異性的同時(shí)，還可以區(qū)分PV 的不同表型，這是由于Dsg1 和Dsg3在人體不同部位具有相異的表達(dá)和分布：在口腔黏膜和食管，Dsg3 在上皮全層均有表達(dá)，Dsg1 在基底部表達(dá)較多而在全層較少；而在表皮內(nèi)，Dsg3 在基底部的角質(zhì)形成細(xì)胞高表達(dá)，Dsg1 在表皮全層表達(dá)，特別是表皮的上部表達(dá)更高。血清中存在的抗Dsg1 和抗Dsg3 的自身抗體的量不同也就導(dǎo)致了PV 患者在表皮中形成水皰的位置的多樣性，最終可以將其區(qū)分為黏膜主導(dǎo)型和皮膚黏膜型[6]。黏膜主導(dǎo)型PV 患者血清中僅有抗Dsg3，由于Dsg1 可補(bǔ)償抗Dsg3 抗體在皮膚造成的損傷，故皮膚損害較輕，或沒(méi)有損害；但無(wú)法彌補(bǔ)抗Dsg3 抗體在黏膜處造成的對(duì)Dsg3 的破壞，故黏膜損害較重。皮膚黏膜型PV患者的血清中同時(shí)存在抗Dsg1 和抗Dsg3 抗體，因此出現(xiàn)皮膚和黏膜損傷[18]。

這種Dsg1 和Dsg3 的表達(dá)和分布差異，也可以解釋多因素回歸分析的結(jié)果：選取的研究對(duì)象以黏膜損害為主，少有出現(xiàn)皮損，理論上外周血中抗Dsg1 抗體的水平較低，因而研究中實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組只在抗Dsg3 抗體陽(yáng)性上的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而在抗Dsg1 抗體陽(yáng)性上的差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；受抗Dsg1 抗體陽(yáng)性的影響，ELISA 整體結(jié)果的差異也不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這也提示，對(duì)于臨床疑似口腔天皰瘡的患者，其ELISA 結(jié)果中抗Dsg3 抗體的結(jié)果對(duì)于確診更有意義。

ROC 曲線或稱為受試者工作特征曲線，可用來(lái)表達(dá)靈敏度與特異度的關(guān)系。通常選用ROC 曲線下的面積大小作為評(píng)價(jià)診斷試驗(yàn)績(jī)效的指標(biāo)，最完美和理想的診斷試驗(yàn)的ROC 曲線下的面積大小應(yīng)該等于或接近1。ROC 曲線越向左上偏，曲線下的面積越大，其診斷試驗(yàn)識(shí)別患者和非患者的能力越高。我們的研究中選取了臨床表現(xiàn)及ELISA 檢測(cè)中的8個(gè)指標(biāo)作為診斷試驗(yàn)指標(biāo)，分別繪制了ROC 曲線進(jìn)行比較，最終發(fā)現(xiàn)“抗Dsg3 抗體陽(yáng)性”的ROC 曲線在坐標(biāo)系中最靠近左上角，具有最大的曲線下面積（0.942），說(shuō)明在上述8 種指標(biāo)中，抗Dsg3 抗體陽(yáng)性在診斷口腔天皰瘡時(shí)具有最高的應(yīng)用價(jià)值。ELISA 結(jié)果（Dsg3+Dsg1）和云霧狀水腫2 個(gè)指標(biāo)同樣具有較高的曲線下面積（均＞0.85），分別為0.936和0.881，對(duì)于診斷口腔天皰瘡亦具有較高的價(jià)值。

天皰瘡的Logistics 回歸分析中，最后留在方程中的變量有5 個(gè)：抗Dsg3 抗體陽(yáng)性、云霧狀水腫、周緣擴(kuò)展或尼氏征、年齡和水皰，前4 個(gè)因素與天皰瘡的診斷顯著相關(guān)?？笵sg3 抗體陽(yáng)性的概率是對(duì)照組患者的23.332 倍；天皰瘡患者出現(xiàn)云霧狀水腫的比率是對(duì)照組患者的19.725 倍；天皰瘡患者出現(xiàn)周緣擴(kuò)展或尼氏征的可能性是對(duì)照組患者的4.822倍；天皰瘡患者比對(duì)照組患者早發(fā)病10 年的可能性是對(duì)照組患者的6.106 倍。

本研究中發(fā)現(xiàn)ELSIA 的敏感度為93.6%，特異性為93.6%，準(zhǔn)確度為93.6%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為92.9%，陰性預(yù)測(cè)值為94.2%，約登指數(shù)為87.2%。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組在“抗Dsg3 抗體結(jié)果抗體陽(yáng)性”、“云霧狀水腫”和“年齡”因素上具有顯著差異。結(jié)合Logistics 回歸分析和ROC 曲線下面積分析，綜合評(píng)估結(jié)果顯示ELSIA 法有很強(qiáng)的診斷能力，對(duì)天皰瘡的診斷具有很好應(yīng)用價(jià)值。

除此以外，相比于組織病理學(xué)、直接免疫熒光和間接免疫熒光，ELISA 還具有操作簡(jiǎn)便、微創(chuàng)、對(duì)設(shè)備要求較低的優(yōu)勢(shì)，同時(shí)，由于ELISA 的結(jié)果為定量結(jié)果，治療中可多次檢測(cè)進(jìn)行對(duì)比，分析患者身體中自身抗體滴度以實(shí)現(xiàn)指導(dǎo)用藥，起到精準(zhǔn)治療的目的。

綜合上述多因素分析和ROC 曲線的結(jié)果，我們不難發(fā)現(xiàn)，通過(guò)ELISA 法檢測(cè)外周血中自身抗體，特別是抗Dsg3 抗體來(lái)診斷口腔天皰瘡，方法簡(jiǎn)便，微痛無(wú)創(chuàng)，具有較高的敏感度和特異性，對(duì)于口腔天皰瘡的診斷具有重要意義。