牟 丹, 楊 帆, 卡著才讓, 祁學忠, 顧智輝, 謝久祥*, 李希來*

(1.青海大學農(nóng)牧學院， 青海 西寧 810016； 2. 河南蒙古族自治縣自然資源局林業(yè)站， 青海 黃南 811599)

高加索三葉草(TrifoliumambiguumBieb.)，又稱庫拉三葉草(Kura clover)，是一種生長相對低矮、具有多分枝深根的根莖型多年生草本植物[1]，也是豆科三葉草屬中唯一具有地下根蘗和利用根蘗進行強克隆性生長的多年生長壽命草種[2]。該草具有廣泛的生態(tài)位，從近海平面至高海拔地區(qū)均可生長[3]；還具有很強的抗寒、耐水淹、抗旱和耐牧等特性[4]。據(jù)報道，高加索三葉草能在海拔3 500～3 700 m的青海省河南蒙古自治縣(河南縣)3處試驗地形成克隆植株，并自然越冬[5-6]。河南縣地處青藏高原東部，高原大陸性氣候較明顯，表現(xiàn)為氣候嚴寒，晝夜溫差大，無霜期短，極端低溫、倒春寒等災害天氣時有發(fā)生[7-8]。高加索三葉草在河南縣的成功越冬說明其能夠適應該地區(qū)的低溫天氣。

植物面臨低溫脅迫時，可通過合成并積累滲透調節(jié)物質來降低細胞冰點溫度，增強細胞保水力，緩和細胞低溫結晶，從而避免脫水傷害[9]。氨基酸及其衍生物是參與植物滲透調節(jié)的重要有機物質之一，在植物遭受低溫和水分等逆境時會大量積累[10]。低溫脅迫下，植物體內(nèi)活性氧(Reactive oxygen species,ROS)含量迅速上升，積累的自由基與細胞膜相互作用，從而對植物生長發(fā)育造成危害[11]。為清除體內(nèi)ROS并維持其平衡，植物主要依靠酶類和非酶類兩種抗氧化防御系統(tǒng)，其中非酶類抗氧化防御系統(tǒng)主要包括抗壞血酸、類黃酮和酚類等物質[12]。類黃酮化合物是植物體內(nèi)的一類次生代謝產(chǎn)物，可作為強抗氧化劑、自由基清除劑和脂質過氧化抑制劑等，在植物響應多種逆境方面起著重要作用[13]。

代謝組學被稱為新的“組學”之一，是繼基因組學、轉錄組學和蛋白組學后又一門用于研究系統(tǒng)生物學的科學[14]，被認為是植物基因組和表型之間的橋梁，已廣泛應用于植物響應低溫脅迫的研究[8]。目前，關于高加索三葉草響應低溫脅迫的代謝組學研究卻鮮見報道。本課題組于2015 年將高加索三葉草從新西蘭引種到河南縣，發(fā)現(xiàn)該植物的綠期較長，于當年11月初枯黃，在10月處于正常生長狀態(tài)，并于次年5月返青。據(jù)前期氣象觀測，河南縣春秋季節(jié)晝夜溫差大，且時有零下低溫發(fā)生(2015年至2018年間的5月和10月極端低溫分別達-6℃和-13℃，極端高溫分別為19℃和18℃)，這無疑會對正處于返青或正常生長的高加索三葉草造成一定的低溫傷害。植物面臨低溫脅迫時，會通過產(chǎn)生一些代謝物并調節(jié)其含量來抵御低溫[15]。為此，本研究對高加索三葉草進行以超高效液相色譜-串聯(lián)質譜(Ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,UPLC-MS/MS)聯(lián)用的廣泛靶向代謝組學技術檢測，比較分析不同降溫模式低溫脅迫處理與常溫處理間高加索三葉草葉片代謝物的變化，篩選響應低溫脅迫的關鍵代謝物，以期探討高加索三葉草響應低溫脅迫的代謝機制，為耐寒植物新品種培育提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為高加索三葉草的育成品種‘蒙農(nóng)三葉草1號’(TrifoliumambiguumBied‘Mengnong clover No.1’)，種子由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學王明玖教授提供。

1.2 試驗設計

試驗于2019年5—8月在青海大學校內(nèi)牧草試驗地和草業(yè)科學系實驗室進行。將種子播種到含混合基質的花盆中。60 d后將長勢一致的幼苗轉移到低溫人工氣候箱(光照12 h、晝夜溫度20℃/18℃、光照強度12 000 lx、濕度60%)適應性培養(yǎng)30 d。試驗分3組：常溫對照組(CK)、緩慢降溫組(Gradual cooling,GC)和驟然降溫組(Sudden cooling,SC)，每組均為3個重復。試驗具體處理及采樣過程同牟丹等[7]研究中的處理及采樣過程。采樣完成后，將剪取的葉片立即置于液氮速凍并放入-80℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 代謝物提取與檢測

取出-80℃超低溫冰箱中冷凍保存的高加索三葉草葉片，對其進行真空冷凍干燥，然后利用研磨儀研磨(30 Hz)1.5 min，稱取100 mg的粉末，利用含0.1 mg·L-1利多卡因作為內(nèi)標的70%甲醇1.0 mL于4℃提取過夜。提取后，10 000 g離心10 min，吸取上清，用微孔濾膜(孔徑0.22 μm)過濾樣品，將過濾液保存在進樣瓶中用后續(xù)分析。同時，由樣本提取物混合制備質控樣本(Quality control,QC)，用于樣本重復性分析。

數(shù)據(jù)采集儀器系統(tǒng)主要包括超高效液相色譜(Ultra performance liquid chromatography,UPLC)和串聯(lián)質譜(Tandem mass spectrometry,MS/MS)。UPLC分析條件主要包括：色譜柱：C18柱(1.8 μm×2.1 mm×100 mm)；流動相：水相為超純水(加入0.04%的乙酸)，有機相為乙腈(加入0.04%的乙酸)；洗脫梯度：0 min(水/乙腈95∶5 V/V)，11.0 min(水/乙腈5∶95 V/V)，12.0 min(水/乙腈5:95 V/V)，12.1 min(水/乙腈95∶5 V/V)，15.0 min(水/乙腈95∶5 V/V)；流速：0.4 mL·min-1；柱溫：40℃；進樣：2 μL。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

代謝產(chǎn)物分析采用多元統(tǒng)計分析，包括主成分分析法(Principal component analysis,PCA)和正交偏最小二乘判別分析法(Orthogonal partial least squares discriminant analysis,OPLS-DA)；差異代謝物(Differential metabolites,DMs)的篩選利用OPLS-DA和單變量統(tǒng)計分析T檢驗相結合的方法。

2 結果與分析

2.1 UPLC-MS/MS鑒定結果

通過UPLC-MS/MS技術平臺對常溫對照組和低溫脅迫組樣品進行分析，共檢測到894個代謝物。這些代謝物主要屬于有機酸及其衍生物(檸檬酸、草酸和蘋果酸等)、黃酮(木犀草素、芹菜素和蕓香柚皮苷等)和氨基酸衍生物(亮氨酸、組氨酸、天冬氨酸和谷氨酸等)等23個類型。

2.2 UPLC-MS/MS數(shù)據(jù)多元統(tǒng)計分析

由圖1的PCA得分圖可以看出，GC組與CK組間的模型累計解釋率為 77.3，SC組與CK組間的模型累計解釋率79.7，說明各組樣本間的總體代謝差異較明顯。圖2所示，GC組與CK組間的模型主要質量參數(shù)為R2X=0.783，R2Y=0.999，Q2=0.99，SC組與CK組間的模型主要質量參數(shù)為R2X=0.842，R2Y=1，Q2=0.994，表明該模型可靠，能很好地擬合不同處理之間代謝物的差異情況。

圖1 不同降溫模式低溫脅迫下代謝物的PCA得分圖

2.3 差異代謝物的篩選

本研究依據(jù)OPLS-DA模型參數(shù)VIP得分值(VIP ≥ 1)及T檢驗的P值(P< 0.05)篩選不同降溫模式低溫脅迫處理與常溫處理間(即GC-vs-CK和SC-vs-CK)的差異代謝物(Differential metabolites,DMs)，且當某一代謝物含量的差異倍數(shù)(即處理組含量與對照組含量的比值)大于1時認為該代謝物上調，小于1時認為該代謝物下調。與CK相比，在GC組中篩選出124個DMs(49個上調，75個下調)，在SC組中篩選出139個DMs(64個上調，75個下調)。GC和SC處理組的DMs均屬于氨基酸及衍生物和有機酸及衍生物等19個類型(表1)。此外，通過韋恩分析直觀展示了GC和SC這 2個處理組中共有或特有的DMs。由圖3所示，2個處理組共同擁有103個DMs；GC組特有21個DMs，SC組特有36個DMs。

圖3 不同降溫模式低溫脅迫下DMs的韋恩圖

2.4 DMs的富集分析

為了解不同降溫模式低溫脅迫下高加索三葉草葉片中代謝物質的總體代謝途徑，分別對GC和SC這2個處理組的DMs進行京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路注釋，即將各個DMs對應的KEGG編號映射到KEGG網(wǎng)站中。由KEGG通路注釋總覽表可看出(表2)，2個處理組的DMs均主要富集在氨基酸代謝和次生代謝產(chǎn)物生物合成2個類別中。此外，為篩選不同降溫模式低溫脅迫下顯著性差異變化的代謝通路，對2個處理組的DMs進行了通路富集分析。如圖4的富集分析結果所示，GC和SC處理組的DMs均在ABC轉運蛋白、丁酸代謝、組氨酸代謝、煙酸和煙酰胺代謝和氨酰tRNA生物合成5通路顯著富集(P<0.05)；而SC組的DMs還在β-丙氨酸代謝、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝和甘油酯代謝通路中顯著富集(P<0.05)。

表2 不同降溫模式低溫脅迫下DMs的KEGG通路注釋

圖4 不同降溫模式低溫脅迫處理下DMs的代謝通路富集圖

2.5 響應低溫脅迫的關鍵代謝物分析

為了比較分析響應低溫脅迫的關鍵代謝物變化情況，本研究對GC和SC這2個處理組的DMs結合通路富集情況進行整理，繪制了簡化代謝圖(圖5)。該圖涉及多條重要的代謝途徑，例如淀粉和蔗糖代謝、三羧酸循環(huán)(Tricarboxylic acid cycle,TCA)、丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代謝、精氨酸和脯氨酸代謝、苯丙烷生物合成和類黃酮生物合成等代謝通路。圖5直觀地反映了不同降溫模式低溫脅迫處理與常溫處理間的代謝物變化情況，從整體上可看出低溫脅迫對氨基酸代謝和類黃酮生物合成過程中的代謝物種類和含量影響較大，對TCA循環(huán)和糖代謝過程中的代謝物種類和含量影響較小(因各代謝物含量的值較大，圖中不方便展示，故本文用差異倍數(shù)進行展示)。氨基酸代謝過程中，與CK相比，在GC和SC這2個處理組中，亮氨酸、賴氨酸和4-氨基丁酸(別名：γ-氨基丁酸，Gamma-aminobutyric acid,GABA)的含量均極顯著增加(P<0.01)，天冬氨酸的含量均顯著增加(P<0.05)，谷氨酸和脯氨酸的含量均極顯著下降(P<0.01)；而酪氨酸的含量僅在SC組顯著增加(P<0.05)。類黃酮生物合成過程中，與CK相比，在GC和SC這2個處理組中，矢車菊素的含量均顯著上調(P<0.05)；木犀草素的含量也均上調，且上調的差異倍數(shù)均最大，分別達到598 518.52和291 851.85；而紫鉚因的含量僅在GC組顯著上調(P<0.05)，新橙皮苷的含量僅在SC組顯著上調(P<0.05)。TCA循環(huán)過程中，與CK相比，在GC和SC這2個處理組中，僅有檸檬酸的含量均極顯著上調(P<0.01)。糖代謝過程中，與CK相比，在GC和SC這2個處理組中，尿苷二磷酸葡萄糖(UDP-葡萄糖)的含量均增加，而蔗糖的含量均極顯著降低(P<0.01)。

圖5 不同降溫模式低溫脅迫處理下的DMs變化情況

3 討論

低溫脅迫可導致植物形態(tài)和生理生化等方面改變，如滲透保護劑積累、抗氧化劑合成、代謝途徑改變等[16]。本研究通過對不同降溫模式低溫脅迫處理與常溫處理的高加索三葉草葉片代謝物進行比較，發(fā)現(xiàn)GC和SC這2個處理組的代謝物含量相較CK均有顯著變化。進一步篩選，在2個處理組中均得到大量的DMs，這些DMs均主要屬于氨基酸及衍生物和有機酸及衍生物等類型。GC組的DMs數(shù)量較SC組少，說明高加索三葉草響應驟然降溫的代謝組變化可能更強烈，可通過產(chǎn)生更多種類的代謝物來抵御突然的零下低溫。從總體代謝途徑看，GC和SC處理組的DMs均主要富集在氨基酸代謝和次生代謝產(chǎn)物的生物合成中，說明這2個代謝類別在高加索三葉草面臨不同降溫模式低溫脅迫時均具有重要作用。

氨基酸是植物體內(nèi)一種重要的滲透調節(jié)物質，能直接或是間接對環(huán)境中的壓力(溫度、水分、鹽堿等)做出響應[17-18]，其含量常在低溫脅迫下增加[19]。本研究中，GC和SC處理組的GABA、亮氨酸、組氨酸和賴氨酸等氨基酸及衍生物的含量在低溫脅迫后均顯著增加，推測積累這些氨基酸是高加索三葉草在低溫脅迫下維持滲透平衡的一種策略。GABA作為一種非蛋白氨基酸，在應激反應中扮演的角色與脯氨酸類似，可通過增強抗氧化酶活性和減少活性氧積累來減輕逆境對植物的傷害[20]。本研究中，GABA含量在常溫處理下幾乎為零，而在不同降溫模式低溫脅迫下卻大量增加，這和Mazzucotelli等[21]的研究結果類似，說明高加索三葉草可能通過合成大量的GABA來減輕低溫脅迫造成的傷害。亮氨酸屬于支鏈氨基酸(Branched chain amino acids,BCAAs)，而BCAAs在包括冷脅迫在內(nèi)的非生物脅迫條件下普遍積累，且可作為保護性滲透劑[22-23]。本研究發(fā)現(xiàn)GC和SC這2個處理組中的亮氨酸含量均顯著上調，上調倍數(shù)分別是26.05和43.17，可看出該物質對維持低溫脅迫下高加索三葉草葉片的滲透平衡起著重要作用。組氨酸、賴氨酸和半胱氨酸等氨基酸被認為是抗氧化氨基酸[24]，因易于與-OH或-SH發(fā)生反應而實現(xiàn)抗氧化能力[25]。因此，推測低溫脅迫后顯著增加的組氨酸和賴氨酸在高加索三葉草抗氧化過程發(fā)揮了一定的作用。

另一方面，本研究還發(fā)現(xiàn)部分氨基酸及衍生物的含量在不同降溫模式的低溫脅迫下均有所降低，其中谷氨酸含量在GC和SC處理組中均顯著降低，這與趙春旭等人[8]的研究結果類似。谷氨酸參與多種與植物抗逆相關的非蛋白氨基酸(如GABA)或蛋白氨基酸(如脯氨酸和精氨酸)的合成，可被谷氨酸脫羧酶直接轉化為GABA，還可被谷氨酸脫氫酶脫氨生成α-酮戊二酸進入TCA循環(huán)[26]。因此，結合本研究中GABA含量在2個處理組均大量增加的結果，說明高加索三葉草葉片中谷氨酸可能被轉化為了GABA，也可能被轉化為α-酮戊二酸參與到和抗逆相關的TCA循環(huán)之中[27]。脯氨酸作為滲透調節(jié)物質、保護蛋白質分子和活性氧清除劑等在植物抗寒方面扮演著多種角色，并在植物面臨低溫脅迫時表現(xiàn)為普遍積累[28]。然而，本研究中不同降溫模式的低溫脅迫均使高加索三葉草葉片脯氨酸含量降低，推測隨著低溫脅迫時間的延長，高加索三葉草某些組織或器官因受傷害無法產(chǎn)生更多的脯氨酸，也可能因為上游合成脯氨酸的前體物質谷氨酸含量減少使其積累速率小于分解速率，最終導致含量降低。賈向榮[29]發(fā)現(xiàn)黃精(Polygonatum.sibiricumRed.)葉片脯氨酸含量在低溫脅迫4 h內(nèi)呈下降趨勢，并在脅迫4 h時含量降到最低值，這與本研究結果相似。酪氨酸是合成多酚類化合物的芳香族氨基酸之一[30]，而多酚類化合物具有良好抗氧化能力，可通過消除自由基活性來保護組織免受氧化損害[31]。本研究發(fā)現(xiàn)酪氨酸的含量僅在SC組顯著增加，說明高加索三葉草面臨驟然降溫時，可能通過合成更多的酪氨酸來促進多酚類化合物的合成，從而清除體內(nèi)多余的自由基，進一步減少驟然降溫對其的傷害。

有機酸(特別是TCA循環(huán)中的有機酸)含量可反映植株的生長和代謝活性[32]。TCA循環(huán)是連接糖代謝和氨基酸代謝的重要樞紐，能為植物提供能量，在植物遭遇逆境時起著重要作用[33]。本研究中，作為TCA循環(huán)中間產(chǎn)物之一的檸檬酸，其含量在GC和SC這2個處理組中均顯著增加，分別是CK的6.11倍和10.79倍。由此說明，低溫脅迫下，高加索三葉草體內(nèi)TCA循環(huán)可能被增強，進而產(chǎn)生更多的能量以補充抵御低溫期間的能量消耗，同時驗證了前文谷氨酸含量降低的情況。此結果與低溫脅迫下梭梭(Haloxylonammodendron)幼苗的代謝響應情況較為相似[34]。

類黃酮化合物是植物中一類重要的次生代謝產(chǎn)物，具備抗氧化、清除自由基的活性，低溫環(huán)境更有利于其合成與積累[35-36]。本研究發(fā)現(xiàn)高加索三葉草經(jīng)不同降溫模式低溫脅迫處理后，葉片中多種類黃酮化合物的含量顯著增加。其中，GC和SC處理組中的矢車菊素和木犀草素2種類黃酮化合物的含量均顯著高于CK，推測高加索三葉草可通過積累矢車菊素來提高抗氧化能力從而增強其抗寒力，還可通過積累木犀草素來清除體內(nèi)過多的自由基，進而提高低溫脅迫下的抗氧化能力，這分別與齊睿[37]對四季秋海棠(Begoniasimperflorens)和Kim等[38]對寬葉胡枝子(Lespedezamaximowiczii)的研究結果類似。據(jù)報道，同屬類黃酮的紫鉚因和新橙皮苷也具抗氧化作用[39-41]。本研究中，紫鉚因含量僅在GC組顯著增加，而新橙皮苷含量僅在SC組顯著增加，說明高加索三葉草在面臨不同降溫模式的低溫脅迫時，可能采用不同的抗低溫策略，即紫鉚因可能在緩慢降溫中起重要作用，而新橙皮苷可能在驟然降溫中起重要作用。

4 結論

本研究通過超高效液相色譜-串聯(lián)質譜聯(lián)用的廣泛靶向代謝組學技術在高加索三葉草葉片中共檢測出894種代謝物，并發(fā)現(xiàn)緩慢降溫和驟然降溫2處理組中的部分代謝物含量均與常溫對照組存在顯著差異(P<0.05)。差異代謝物均主要富集在氨基酸代謝和次生代謝物生物合成類別；紫鉚因的含量僅在緩慢降溫組中顯著增加(P<0.05)，酪氨酸和新橙皮苷的含量僅在驟然降溫組中顯著增加(P<0.05)；GABA、亮氨酸、組氨酸、賴氨酸、檸檬酸、矢車菊素和木犀草素的含量在緩慢降溫和驟然降溫2處理組中均顯著增加(P<0.05)，這些代謝物可作為高加索三葉草響應低溫脅迫的關鍵代謝物。