鄭立娟 劉健偉 秦華民 湯晨 趙旭

根尖周病是繼發(fā)于牙髓感染和損傷的一種骨破壞性炎癥病理?yè)p傷。細(xì)菌作為其始動(dòng)因子可激發(fā)宿主產(chǎn)生一系列免疫應(yīng)答，大量炎癥細(xì)胞在被激活后產(chǎn)生和釋放炎癥介質(zhì)、細(xì)胞因子和酶類(lèi)等物質(zhì)，導(dǎo)致根尖區(qū)組織破壞和牙槽骨的吸收[1]。

他汀類(lèi)調(diào)脂藥(Simvastatin)是3-羥基3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMG-CoA)抑制劑，常用于降低膽固醇水平，此外還有保護(hù)內(nèi)皮、抗炎、抗氧化等多種功能[2]，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)他汀類(lèi)藥物在調(diào)節(jié)成骨破骨平衡，抑制口腔相關(guān)炎癥中也具有重要作用[3]。

核因子-κB受體活化因子配體(RANKL)是在成骨細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞等表面表達(dá)的配體，其與核因子-κB受體活化因子(RANK)結(jié)合是誘導(dǎo)破骨細(xì)胞活化和發(fā)揮功能的必要條件，在破骨細(xì)胞的分化和成熟中起到重要作用，而RANK/RANKL的表達(dá)又受到諸多因素的調(diào)節(jié)[4]。本研究將其用在大鼠實(shí)驗(yàn)性根尖周炎中，觀(guān)察用藥后白介素-6(interleukin-6，IL-6)和RANKL在實(shí)驗(yàn)性根尖周炎發(fā)展中的變化，以及辛伐他汀對(duì)成骨細(xì)胞的影響，探討辛伐他汀在根尖周病損中的作用，為輔助根管治療的新方法提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 8 周齡SD雄性大鼠32 只，體重(250±20) g，由大連醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(human bone marrow mesenchymal stem cell，HMSC，廣州吉妮歐生物科技有限公司)。

1.1.3 主要試劑 DMEM高糖培養(yǎng)基(HyClone公司，美國(guó))；胎牛血清(FBS)、青鏈霉素試劑(GIBCO公司，美國(guó))；辛伐他汀(simvastatin，上海遠(yuǎn)慕生物)；LPS內(nèi)毒素、NC薄膜(Sigma公司，美國(guó))；胰蛋白酶、 蛋白裂解液(上海碧云天)；蛋白marker(Thermo Fisher公司，美國(guó))；脫脂奶粉(BD公司，美國(guó))； RANKL抗體、 GAPDH 抗體及羊抗兔IgG-HRP抗體(武漢三鷹生物有限公司)；人白介素6 ELISA試劑盒(武漢華美生物工程有限公司)。

1.1.4 主要儀器 二氧化碳恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)(Thermo Scientific Biological公司,美國(guó))；倒置熒光顯微鏡(Olympus公司，日本)；酶標(biāo)儀(Perkin Elmer公司，美國(guó))；HC-2518R高速冷凍離心機(jī)(安徽中科中佳科學(xué)儀器公司)；凝膠PAGE電泳儀、SDS-PAGE轉(zhuǎn)膜儀(北京六一廠(chǎng))；ECL成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司，美國(guó))。

1.2 方法

1.2.1 大鼠牙根尖周炎用藥模型建立 大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，小號(hào)球鉆于下頜第一磨牙遠(yuǎn)中窩處開(kāi)髓，放入蘸有脂多糖內(nèi)毒素(Lipopolysaccharide，LPS)的棉球并壓緊，動(dòng)物清醒后，正常飼養(yǎng)。大鼠分組情況：A組(正常對(duì)照組)：16 只，開(kāi)髓后每日生理鹽水灌胃，分別于開(kāi)髓術(shù)后1、7、14、21 d處死大鼠；B組(模型觀(guān)察組)：16 只，開(kāi)髓后每日辛伐他汀灌胃給藥，劑量為5 mg/kg·d，分別于開(kāi)髓術(shù)后1、7、14、21 d處死大鼠。所有處死的大鼠剝離下頜骨，儲(chǔ)存于4%多聚甲醛溶液中。需要進(jìn)行免疫組化的骨組織提前用EDTA溶液脫鈣處理。

1.2.2 X線(xiàn)掃描 X線(xiàn)牙片機(jī)拍攝下頜骨標(biāo)本，8 mA、70 kV、0.08 s條件下曝光。將X線(xiàn)影像導(dǎo)入Image-Pro Plus 6.0生物圖像處理軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.3 骨組織RANKL免疫組織化學(xué)染色 (1)脫蠟，將組織切片用二甲苯及乙醇脫蠟；(2)水化，緩慢水流下沖洗10 min，之后用PBS溶液洗滌；(3)抗原修復(fù)，將洗滌后的組織切片放入檸檬酸鹽緩沖液中，于微波爐解凍檔修復(fù)20 min，室溫冷卻后，PBS溶液洗滌；(4)內(nèi)源性過(guò)氧化酶滅活，滴加3%過(guò)氧化氫溶液，放置10 min，之后用PBS溶液沖洗3 次，每次5 min；(5)血清封閉及孵一抗，滴加山羊血清，在室溫下封閉30 min，吸干封閉液后滴加稀釋的RANKL抗體(1∶150)，于4 ℃冰箱過(guò)夜孵育；(6)孵二抗，次日取出切片，室溫下恢復(fù)1 h后滴加生物素化二抗，室溫孵育45 min，PBS溶液洗滌；(7)標(biāo)記二抗，滴加相應(yīng)工作液標(biāo)記二抗，室溫下孵育45 min，PBS溶液洗滌；(8)顯色，滴加新配制的DAB顯色液，于顯微鏡下觀(guān)察顯色；(9)復(fù)染，在緩慢水流下洗滌切片，滴加蘇木精染液復(fù)染，并用流水沖洗；(10)脫水，中性樹(shù)脂封片。于顯微鏡下觀(guān)察染色結(jié)果。

1.2.4 HMSC細(xì)胞培養(yǎng) HMSC細(xì)胞于37 ℃，5%CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)基為DMEM高糖培養(yǎng)基+10%胎牛血清+1%雙抗。在達(dá)到指數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，用含有成骨誘導(dǎo)劑的培養(yǎng)基進(jìn)行成骨誘導(dǎo)。實(shí)驗(yàn)分組情況：A組：常規(guī)培養(yǎng)；B組：常規(guī)培養(yǎng)+1 μg/mL LPS(或+50 ng/mL IL-6)；C組：B組+10-7mol/L 辛伐他??；D組：B組+10-5mol/L 辛伐他汀。

1.2.5 ELISA法測(cè)定IL-6 按實(shí)驗(yàn)分組對(duì)細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)處理，收集細(xì)胞上清液。向空白樣品孔中加入樣品稀釋液100 μL，向標(biāo)準(zhǔn)樣品孔加入稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品溶液100 μL，向待測(cè)樣品孔加入待測(cè)細(xì)胞上清樣品100 μL，膠紙封板后箱孵育90 min。加生物素化抗體工作液，膠紙封板后孵育60 min，棄去孔內(nèi)液體后甩干洗板。加酶聯(lián)工作液，膠紙封板后孵育60 min，棄去孔內(nèi)液體后甩干洗板。加顯色液顯色30 min，加終止液。使用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔在450 nm波長(zhǎng)處的A值，記錄并分析處理數(shù)據(jù)。

1.2.6 Western blot法檢測(cè)RANKL蛋白表達(dá) 按實(shí)驗(yàn)分組對(duì)細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)處理，收集蛋白并定量后進(jìn)行SDS-PAGE電泳。按照濃縮膠80 V恒壓，分離膠120 V恒壓的條件進(jìn)行電泳，待蛋白指示劑到達(dá)膠底時(shí)停止電泳。取出聚丙烯酰胺凝膠，按照蛋白質(zhì)Marker的指示切下所需部分，按照凝膠的大小裁切NC膜，并在兩側(cè)加放數(shù)層濾紙，從負(fù)極到正極的順序?yàn)闉V紙、凝膠、NC膜、濾紙，轉(zhuǎn)膜條件為250 mA恒流1 h。完成轉(zhuǎn)膜后，對(duì)NC膜進(jìn)行裁切并將其放入新鮮配制的5%的脫脂奶粉中封閉2 h。滴加稀釋后的一抗溶液(RANKL，1∶500)，4 ℃冰箱過(guò)夜孵育。次日取出，于搖床上洗去多余一抗，擦干后孵育二抗(1∶3 000)，室溫孵育1 h，TBST洗膜。將發(fā)光液A、B以1∶1比例混合均勻后放入顯影儀顯影，并對(duì)樣本條帶結(jié)果記錄分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié) 果

2.1 實(shí)驗(yàn)性根尖周炎牙槽骨吸收病灶X線(xiàn)影像分析

X線(xiàn)片示：術(shù)后7 d，對(duì)照組和辛伐他汀干預(yù)組大鼠出現(xiàn)根尖病灶，牙槽骨和牙骨質(zhì)有輕微的破壞，但對(duì)照組與辛伐他汀干預(yù)組無(wú)明顯差異; 此后，病灶的面積逐漸增大，21 d 時(shí)病灶的面積達(dá)到最大值。術(shù)后14 d起，辛伐他汀干預(yù)組的病灶區(qū)域面積開(kāi)始小于對(duì)照組(P<0.05)，術(shù)后21 d辛伐他汀干預(yù)組的病灶區(qū)域面積明顯小于對(duì)照組(P<0.001)(圖 1)。

2.2 RANKL免疫組化染色

普通光學(xué)顯微鏡觀(guān)察根尖組織病理切片。免疫組化陽(yáng)性結(jié)果呈棕黃色，對(duì)照組和用藥組的RANKL表達(dá)在術(shù)后1 d時(shí)少量出現(xiàn)，7 d時(shí)開(kāi)始增加。對(duì)照組在14 d時(shí)繼續(xù)增加，在21 d左右達(dá)峰值; 而辛伐他汀用藥組的RANKL表達(dá)從14 d開(kāi)始少于對(duì)照組，21 d時(shí)對(duì)照組的RANKL表達(dá)量明顯高于辛伐他汀用藥組(圖 2)。

圖 1 實(shí)驗(yàn)性根尖周炎牙槽骨吸收病灶X線(xiàn)掃描影像分析

圖 2 RANKL在各組大鼠根尖病灶中的表達(dá)

2.3 細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-6的測(cè)定

按細(xì)胞培養(yǎng)分組收集藥物刺激后的上清培養(yǎng)液,根據(jù)ELISA試劑盒說(shuō)明建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。分組檢測(cè)各組IL-6水平，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常培養(yǎng)組相比，LPS感染組中IL-6的表達(dá)明顯增高(P<0.001)，而在此基礎(chǔ)上辛伐他汀會(huì)抑制細(xì)胞IL-6的表達(dá)(P<0.001)，且辛伐他汀的劑量越高，抑制效果越明顯(圖 3)。

2.4 細(xì)胞RANKL蛋白表達(dá)情況

Western blot結(jié)果顯示，與正常培養(yǎng)組相比，IL-6刺激組中RANKL的表達(dá)明顯增高(P<0.001)，辛伐他汀會(huì)抑制細(xì)胞的RANKL蛋白的表達(dá)(P<0.001)，且辛伐他汀的劑量越高，抑制效果越明顯。與對(duì)照組相比，LPS感染組中RANKL的表達(dá)明顯增高(P<0.001)，而在此基礎(chǔ)上辛伐他汀會(huì)降低細(xì)胞的RANKL蛋白的表達(dá)(P<0.001)，同時(shí)辛伐他汀的劑量越高，抑制效果越明顯。表明辛伐他汀可抑制IL-6所導(dǎo)致的RANKL的激活，進(jìn)而抑制炎癥反應(yīng)(圖 4)。

圖 3 LPS及辛伐他汀對(duì)HMSCs IL-6表達(dá)的影響

3 討 論

成骨細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)RANKL，RANKL的胞外受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域能夠與破骨細(xì)胞前體細(xì)胞表達(dá)的RANK相結(jié)合，激活RANK信號(hào)通路[5]。RANK接收到的信號(hào)將經(jīng)由TRAF-6等一系列信號(hào)分子傳導(dǎo)至核因子-κB，進(jìn)而信號(hào)入細(xì)胞核，增加c-Fos的表達(dá)，啟動(dòng)破骨細(xì)胞生成基因的轉(zhuǎn)錄，最終產(chǎn)生成熟的破骨細(xì)胞[4]。所以RANK/RANKL信號(hào)通路是維持成骨破骨平衡的重要信號(hào)通路。該通路受到激素、細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子等多種物質(zhì)的調(diào)節(jié)[6-8]，故研究其在炎癥過(guò)程中的變化具有重要意義。

本研究通過(guò)X線(xiàn)掃描發(fā)現(xiàn)，辛伐他汀處理根尖周炎模型大鼠可抑制炎癥反應(yīng)，在第14天和21天時(shí)病灶面積小于未處理組，同時(shí)免疫組化染色檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，大鼠根尖炎模型生理鹽水組中，RANKL的表達(dá)逐漸增多，在第3周末時(shí)達(dá)到高峰，而辛伐他汀用藥處理會(huì)減少大鼠根尖炎模型中RANKL的表達(dá)，在第14天和21天時(shí)最為明顯。以上結(jié)果表明辛伐他汀可抑制大鼠根尖周炎的炎癥進(jìn)程。

圖 4 辛伐他汀和IL-6對(duì)HMSC細(xì)胞RANKL蛋白表達(dá)的影響

IL-6是一種多功能的細(xì)胞因子，有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，在骨結(jié)合初期，可由成骨細(xì)胞分泌[9]。以往研究表明IL-6與牙齦炎和牙周炎的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系，是引起根尖周骨質(zhì)破壞的重要炎癥因子[10]。IL-6由成骨細(xì)胞激活分泌，可直接作用于成骨細(xì)胞，提高RANKL的表達(dá)[11]，抑制成骨細(xì)胞活性；或通過(guò)其他炎癥因子，間接作用于破骨細(xì)胞[12]，引起破骨細(xì)胞的增殖分化，增加周?chē)装Y，促進(jìn)骨基質(zhì)的降解，骨吸收發(fā)生，從而打破骨形成與骨吸收的這一動(dòng)態(tài)平衡[13]。研究表明，應(yīng)用人工合成的IL-6刺激骨細(xì)胞后，通路中的JAK2蛋白磷酸化程度增加，提示IL-6 可以促進(jìn)骨細(xì)胞表達(dá)RANKL，并且與JAK2 的活化密切相關(guān)[11]。為了探究辛伐他汀在根尖周炎中的作用機(jī)制，實(shí)驗(yàn)研究了LPS刺激成骨細(xì)胞后其對(duì)IL-6的影響。ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清液發(fā)現(xiàn)，LPS可促進(jìn)IL-6的表達(dá)，而辛伐他汀可抑制LPS引起的IL-6上調(diào)。進(jìn)一步研究表明，在成骨細(xì)胞中IL-6刺激可上調(diào)RANKL蛋白的表達(dá)，同樣辛伐他汀可抑制這種上調(diào)作用。以上結(jié)果表明，用內(nèi)毒素處理細(xì)胞后，RANKL的表達(dá)增多，而辛伐他汀會(huì)通過(guò)抑制IL-6的表達(dá)減小這種作用，且辛伐他汀的濃度越高，對(duì)RANKL的抑制效果越明顯，Western blot檢測(cè)也證明了以上結(jié)論。

總之，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了適當(dāng)劑量的辛伐他汀能夠抑制成骨細(xì)胞中IL-6的表達(dá)，并通過(guò)RANK-RANKL信號(hào)通路影響破骨細(xì)胞的成熟和炎癥進(jìn)程。這些實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)也為臨床根尖周炎發(fā)病機(jī)制的研究及新的治療方法提供了一定的理論依據(jù)。