湯小英 戴曉云 黃彥

牙髓再生治療旨在通過細胞移植和細胞歸巢兩種方法來再生牙髓樣組織[1-3]。前者需要外來移植干細胞、復雜的程序和高昂的成本，后者利用宿主的內源性細胞來實現(xiàn)組織修復或再生，更具臨床可行性。目前臨床運用較多的牙髓再生方法是牙髓血運重建術，其目的是通過嚴格的消毒控制炎癥，刺激根尖引血以及嚴密的冠方封閉獲得牙髓組織再生。但動物實驗發(fā)現(xiàn)牙髓血運重建獲得的更多是類似牙周組織的新生物，這樣會造成牙根內鈣化，再次感染后會造成治療復雜化[4-5]。全牙髓存活可能規(guī)避牙髓血運重建獲得的牙周組織新生物造成的治療復雜化[6]。本團隊前期研究將乳牙牙髓組織自體移植入年輕恒牙根管，結果顯示植入根管內的乳牙牙髓組織保存活性，但移植牙髓成功的具體原因未知，既往研究發(fā)現(xiàn)血運重建可能是影響乳牙牙髓移植成功的重要影響因素[7]?；|膠(Matrigel)是一種可溶性的基底膜蛋白多糖基質，能夠較好的模擬基底膜的各方面的特性，有助于培養(yǎng)內皮細胞形成互相連接的毛細血管樣結構。為驗證血運重建在乳牙牙髓移植中的作用，構建裸鼠異位模型，加入基質膠來促進血管生成。

1 材料與方法

實驗方案包括照顧和使用實驗動物，均經過了南昌大學倫理委員會批準。獲取的牙齒以及牙髓，均獲得了知情同意以及經過了南昌大學附屬口腔醫(yī)院倫理委員會批準。

1.1 主要試劑和儀器

超凈工作(SW-CJ-1F，蘇州凈化)；移動渦輪機(FS15，浙江希安)； 石蠟切片機(沈陽百事通醫(yī)療有限公司)；普通光學顯微鏡(Olympus公司，日本 )；主要試劑： 三氧化物聚合體(MTA) (Dentsply公司，美國)；α-MEM培養(yǎng)基(Gibco，美國)； 多聚甲醛(賽馳生物)；三聯(lián)抗生素(索萊寶科技公司)；磷酸鹽緩沖液(PBS)(百奧萊博)；基質膠(Corning公司，美國)；抗CD31(Abcam，美國)。

1.2 實驗牙和實驗牙處理

實驗牙選擇：收集2019 年4～6 月在南昌大學附屬口腔醫(yī)院因正畸治療而拔除的健康下頜前磨牙，年齡12～15 歲,收集了前磨牙36 顆。其中實驗牙的納入標準:單根管冠根完整無齲、不松動、根尖孔未發(fā)育完成、牙周健康、牙根長度大于12 mm。

半空管牙制備及分組：用手術刀片刮出牙根根面的牙周軟組織，截去牙冠以及部分牙根，獲得根尖孔大小為2 mm，長度為8 mm的牙根，牙根用PROTAPER?預備到35#06，預備過程中17%乙二胺四乙酸(EDTA)溶液和5.25%次氯酸鈉(NaClO)溶液交替沖洗，然后沿牙根中線破開牙根，一分為二。在室溫下按順序用 5.25%NaClO溶液超聲振蕩5 min，PBS 溶液超聲振蕩5 min，17%EDTA 溶液超聲振蕩15 min，最后用PBS溶液超聲振蕩5 min，隨之使用去離子水震蕩30 min，最后置入預備好的營養(yǎng)液中浸泡，用MTA封閉冠部，操作結束后立即轉移至4 ℃恒溫冰箱備用。半空管牙分為A、B、C 3 組，每組12 顆。

乳牙牙髓獲得：收集2019 年7～8 月在南昌大學附屬口腔醫(yī)院因乳牙滯留的而拔除的健康的前牙24 顆。乳牙納入實驗的標準：冠部完整無齲、無明顯松動、X線片顯示牙根吸收未及1/3。用高速手機在乳牙牙體表面預備出一直線形的牙槽，從牙槽中間劈開乳牙，輕輕取出乳牙牙髓，立即置入預備好的營養(yǎng)液。

1.3 實驗動物選擇

6 周齡雌性裸鼠36 只，體重20～25 g(21.36±1.24)，由南昌樂悠生物科技有限公司提供，動物合格證號: SYXK(贛)2017-0002。

1.4 實驗方法

A組：將獲取的乳牙牙髓轉移至超凈臺，對乳牙牙髓表面用α-MEM 培養(yǎng)基(混合三聯(lián)抗生素液)進行沖洗，隨之將解凍成液態(tài)的基質膠(Corning公司，美國)浸乳牙牙髓，擱置室溫狀態(tài)下形成膠凍狀，將基質膠-牙髓復合體轉移至牙空管中，與半空管牙一起植入裸鼠皮下；B組：乳牙牙髓處理同A組，但是不加入基質膠，直接將乳牙牙髓轉移至半空管牙中，一起植入裸鼠皮下；C組：將備用的半空管牙根進行表面清洗，消毒后直接植入裸鼠皮下。

將所有處理好的裸鼠進行耳標標記。術后裸鼠仍置于南昌樂悠生物科技有限公司飼養(yǎng)，實驗前后未進行特殊處理，飼養(yǎng)環(huán)境無改變。由于傷口縫合以及飼養(yǎng)過程中裸鼠意外死亡等原因導致樣本缺少，在實驗中隨時補齊樣本，保證每組的樣本量恒定。確保每個樣本在裸鼠皮下生活4 周。

1.5 術后操作、組織學及免疫組化分析

術后4 周后裸鼠脫頸處死，取出牙根，置入組織固定液中48 h，17%EDTA 進行脫鈣，每24 h更換1 次脫礦液，3 月后待脫礦完成，切片，制成玻片。進行HE組織化學檢查。A及B組標本進行雙抗染色人源性CD31(servicebio、 GB21401)、鼠源性CD31(servicebio、 GB21403),最后DAPI(servicebio、G1012-100ML)復染細胞核。所有的結果都有兩位檢驗科醫(yī)師閱片。

牙髓存活判斷標準：根管內HE染色可見血管以及細胞，人源性CD31染色陽性。

2 結 果

2.1 HE染色結果

A組牙根內含有裹有基質膠的乳牙牙髓，在HE染色中，有10 例牙根內可見成纖維細胞以及血管，成纖維細胞類似牙髓細胞，血管內可見血細胞(圖 1A); B組：牙根內含有未裹有基質膠的乳牙牙髓，在HE染色中，有5例牙根內可見成纖維細胞以及血管，成纖維細胞類似牙髓細胞，血管內可見血細胞(圖 1B)；C組：無牙髓放入，因此HE染色未見成纖維細胞或牙髓細胞，但是根管內均可見大量淋巴細胞,紅細胞以及血管(圖 1C)。

2.2 免疫組織化學染色結果

雙抗染色合成圖(圖 2)顯示，A組10 例樣本中人源性CD31和鼠源性CD31抗體染色陽性；表明A組有10 例根管內牙髓組織為活性，活性組織內含有鼠來源血管供。B組5 例樣本中人源性CD31和鼠源性CD31抗體染色陽性；表明B組有5 例根管內牙髓組織為活性，活性組織內含有鼠來源血管供。

2.3 乳牙牙髓存活數(shù)比較

見表 1。用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行卡方檢驗，P<0.05。

表 1 3 組移植中牙髓存活數(shù)(n)

圖 1 半空根管內植入移植物后4 周后組織學觀察 (HE， ×100)

圖 2 半空根管內植入移植物后4 周后免疫熒光檢測 (免疫熒光, ×100)

3 討 論

本研究前期將比格犬的乳牙牙髓組織自體移植入牙髓壞死的年輕恒牙的根管中，發(fā)現(xiàn)植入乳牙牙髓后的根管壁持續(xù)增厚、牙根增長、根尖孔直徑減小，這證明了乳牙牙髓組織自體移植的可實施性[6-7]。來源于乳牙牙髓的干細胞以及來自根尖周的干細胞甚至歸巢的骨髓干細胞都可提供種子細胞，而牙髓組織本身可作為支架，牙髓組織內以及來自根尖血液均可提供生長因子[8-11]。但是牙髓移植成功的具體原因仍未知。血運重建是組織工程成功的關鍵，牙髓位于不可讓的髓腔內，血管來源單一，通過根尖孔來源供應營養(yǎng)牙髓，因此血液供應影響牙髓移植的成功[12]。

基質膠是一種可溶性的基底膜蛋白多糖基質，基底膜蛋白多糖廣泛存在于細胞膜表面和細胞基質中。其主要成分類似于哺乳動物的基底膜的生物活性基質，能夠較好的模擬基底膜的各方面的特性[13-16]。與多種因子交互作用，從而參與機體的許多生理過程。研究發(fā)現(xiàn)原代培養(yǎng)的各種內皮細胞，在基質膠上6～12 h內均能形成互相連接的毛細血管樣結構[17]。本研究將乳牙牙髓與基質膠相結合，一方面能夠很好的將乳牙牙髓固定在SEC中，另一方面由于基質膠內含生長因子以及各種營養(yǎng)物質等，可保證乳牙牙髓營養(yǎng)供給，維持乳牙牙髓的活性。

牙本質組織經過消毒和處理后，可以暴露出新鮮的前期牙本質，而其中包含多種牙本質基質蛋白和細胞因子，被稱為天然的誘導因子儲備庫[18-20]。既往研究證實牙本質片不僅具有與成牙本質細胞相匹配的孔徑大小及孔隙率，而且可提供多種牙齒發(fā)育和再生所必需的重要因子，可以誘導種子細胞的黏附、增殖、分化，形成牙本質-牙髓復合體，因此根管腔具有獨特的誘導微環(huán)境條件[21-22]。本研究采用根管腔為載體，HE染色可見有牙髓細胞，可能為來自本身乳牙牙髓細胞，也可能來自乳牙牙髓干細胞分化形成。實驗未見形成牙本質-牙髓復合體，可能為觀察時間不夠，或者乳牙牙髓細胞的直徑不能適應年輕恒牙牙本質小管直徑。

本研究對牙進行半空管處理，當半空管牙放置于裸鼠皮下時，根管內有來自裸鼠組織的血細胞以及血管，這說明不僅基質膠促進血管生成，來自裸鼠的血液也一同保障乳牙牙髓的血液供應。

本實驗進一步驗證乳牙牙髓移植的可行性，乳牙牙髓組織內的干細胞發(fā)揮主要作用；通過SEC加大血運通路，基質膠促進血管新生增加血運，從而增加乳牙牙髓移植后活性。