胡元慶,陳萍萍,李鳳霞

（閩南師范大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,福建漳州363000）

副溶血弧菌（Vibrio parahemolyticus）是一種革蘭氏陰性的嗜鹽性桿菌，廣泛分布于近海岸的養(yǎng)殖環(huán)境、海底沉積物及各類海產(chǎn)品中，是海水養(yǎng)殖業(yè)的主要條件性致病菌，給水產(chǎn)養(yǎng)殖造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1].該菌也是最常見(jiàn)的食源性致病菌之一，近年來(lái)人類60%以上的食物中毒事件由其引發(fā)，患者常表現(xiàn)惡心、嘔吐、腹痛和腹瀉等癥狀[2].副溶血弧菌的致病性除了由溶血素TDH 和TRH、Ⅲ和Ⅳ型分泌系統(tǒng)及腸毒素等毒力因子決定，也與細(xì)菌生物被膜（biofilm，BF）的形成密切相關(guān)[3].

生物被膜是微生物為適應(yīng)不良環(huán)境，粘附于非生物或活性組織表面，分泌大量的多糖基質(zhì)、纖維蛋白、脂質(zhì)蛋白和細(xì)胞外DNA，將菌體包裹而形成的菌體聚集膜樣物[4].生物被膜作為一種特殊細(xì)菌群落，是細(xì)菌抵抗不利環(huán)境、產(chǎn)生耐藥性并導(dǎo)致宿主持續(xù)性感染的重要方式[4-5].自然界中大部分細(xì)菌以多細(xì)胞形式存在，該群體結(jié)構(gòu)可使細(xì)胞間相互協(xié)調(diào)而共生[5-6].組成生物被膜的細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular polymeric substances，EPS）將菌體包裹形成了一個(gè)物理屏障，大大增強(qiáng)了菌體對(duì)抗生素或其它有害化學(xué)物質(zhì)的抵抗力[5,7].EPS 由許多不同的生物聚合物組成，它們將各自的物理特性傳遞給基質(zhì)，從而為生物被膜提供強(qiáng)度、凝聚力和保留大小分子的能力[5].大量研究證實(shí)，幾乎所有的細(xì)菌都可形成生物被膜結(jié)構(gòu)，這也是食品加工環(huán)境中細(xì)菌持續(xù)存在的一個(gè)主要原因[7].細(xì)菌生物被膜引發(fā)的安全問(wèn)題越來(lái)越多地被國(guó)內(nèi)外學(xué)者所關(guān)注，嚴(yán)重威脅著人類的健康.

生物被膜對(duì)副溶血弧菌在環(huán)境中的持續(xù)存在和食物鏈中的傳播起關(guān)鍵作用[8].副溶血弧菌為適應(yīng)不利環(huán)境而形成生物被膜，其一旦生成就難以根除，從而引發(fā)潛在的食品安全風(fēng)險(xiǎn)[9].國(guó)內(nèi)外關(guān)于食品中副溶血弧菌生物被膜的研究越來(lái)越多，已有學(xué)者研究了各種環(huán)境因子對(duì)該菌形成生物被膜的最佳條件[10-11]，以及多種防腐劑[12]、亞硝酸鈉[13]、白藜蘆醇等物質(zhì)對(duì)該菌形成生物被膜的促進(jìn)或抑制作用[14].關(guān)于金屬離子對(duì)副溶血弧菌形成生物被膜影響的報(bào)道，主要研究了金屬陽(yáng)離子如Ca2+、Fe2+、Cu2+、Mg2+等對(duì)該菌生物被膜形成的影響[11].鉛和鎘是水體污染中常見(jiàn)的重金屬，其對(duì)副溶血弧菌形成生物被膜的影響尚無(wú)報(bào)道.本文以副溶血弧菌ATCC17802 標(biāo)準(zhǔn)株為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，研究鉛和鎘對(duì)該菌生物被膜形成的影響，可為有效控制副溶血弧菌形成生物被膜和治理水體污染提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌株：副溶血弧菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC17802，由漳州海關(guān)綜合技術(shù)服務(wù)中心惠贈(zèng).

主要藥品試劑：營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、TCBS 選擇性培養(yǎng)基，北京陸橋技術(shù)股份有限公司；硝酸鉛、四水合硝酸鎘、冰醋酸，阿拉丁控股有限公司；結(jié)晶紫，上海源葉生物科技有限公司；96孔聚苯乙稀U型細(xì)胞培養(yǎng)板，賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司.

主要儀器設(shè)備：全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（MultiSkan Go），美國(guó)ThermoFisher 公司；紫外分光光度計(jì)（UV-1100），上海美普達(dá)儀器有限公司；隔水式恒溫培養(yǎng)箱（GSP-9050MBE）、立式壓力蒸汽滅菌器（BXM-30R），上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；超凈工作臺(tái)（SW-CJ-1FD），蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（DHG-9030A），上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；恒溫振蕩搖床（HQY-C），金壇市鴻科儀器廠；電子天平（AR124CN），奧豪斯儀器有限公司.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌懸液制備

副溶血弧菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC17802劃線接種于TCBS培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h活化.挑取單菌落接種于3%NaCl營(yíng)養(yǎng)肉湯中，37 ℃，200 r/min 振蕩16～18 h，然后用含3%NaCl營(yíng)養(yǎng)肉湯將菌液稀釋至OD600=0.6備用.

1.2.2 生物被膜形成量

參照Djordjevic[15]等法并略做改進(jìn).將稀釋好的菌液分別與含3% NaCl 營(yíng)養(yǎng)肉湯按1∶3（v/v）混合均勻后，按每孔200 μL加至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每組3個(gè)平行，以無(wú)菌3%NaCl營(yíng)養(yǎng)肉湯為空白對(duì)照.37 ℃培養(yǎng)72 h 后，棄去培養(yǎng)液，每孔用250 μL 生理鹽水清洗兩次，60 ℃干燥固定30 min.每孔用200 μL 的0.1%結(jié)晶紫溶液染色5 min 后棄去染液，生理鹽水清洗3 次，60 ℃干燥10 min 后，每孔加200 μL 的33%冰醋酸作用5 min，酶標(biāo)儀測(cè)定OD630值，比較不同濃度細(xì)菌的成膜情況.

1.2.3 培養(yǎng)溫度與時(shí)間對(duì)生物被膜形成影響

將菌液與3%NaCl營(yíng)養(yǎng)肉湯按1∶3體積混勻，每孔200 μL加至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，靜置培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度分別為4、28、37 ℃，培養(yǎng)時(shí)間分別為12、24、48、72、96 h，按1.2.2中的方法測(cè)定OD630值，比較不同培養(yǎng)溫度和時(shí)間下的成膜情況.

1.2.4 重金屬離子鉛和鎘對(duì)生物被膜形成影響

向培養(yǎng)基中添加硝酸鉛和硝酸鎘至不同的終濃度（0、50、250、450、650、850 μg/L），培養(yǎng)時(shí)間設(shè)為12、24、48、72、96 h，按1.2.2方法測(cè)定OD630值，分析兩種離子對(duì)副溶血弧菌生物被膜形成的影響.

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

采用GraphPad Prism 5.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和作圖，試驗(yàn)中指標(biāo)測(cè)定均進(jìn)行了3 次，圖中用X±SD表示.

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)溫度和時(shí)間對(duì)生物被膜形成影響

溫度是生物被膜形成的重要影響因素.4 ℃是水產(chǎn)品低溫貯運(yùn)的溫度，28 ℃是我國(guó)南方水產(chǎn)品生產(chǎn)季的環(huán)境溫度，37 ℃是Vp 生長(zhǎng)的最適溫度，也是南方夏季的高溫條件，本實(shí)驗(yàn)考查這三個(gè)溫度對(duì)副溶血弧菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC17802 生物被膜形成的影響.由圖1可知，三個(gè)不同溫度條件下OD630值均逐漸增大，表明副溶血弧菌生物被膜的形成量隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加.4 ℃和28 ℃培養(yǎng)條件均在72 h 時(shí)OD630值達(dá)到最大，之后開(kāi)始下降.37 ℃條件下48 h 時(shí)OD630值達(dá)到最大，之后開(kāi)始下降.三個(gè)溫度條件下的生物被膜形成總體呈先升后降趨勢(shì)，符合生物被膜的形成規(guī)律，即開(kāi)始小菌落慢慢成長(zhǎng)，然后成為具有三維立體結(jié)構(gòu)的成熟型生物被膜，之后部分細(xì)胞開(kāi)始從生物被膜上脫落.在37 ℃條件下每個(gè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)得的OD630值均最大，大約是28 ℃時(shí)OD630值的2 倍，生物被膜形成量最多，28 ℃時(shí)測(cè)得的OD630值比4 ℃時(shí)大.因此，37 ℃是副溶血弧菌生物被膜形成的最佳溫度，28 ℃次之，隨后的實(shí)驗(yàn)用37 ℃和28 ℃培養(yǎng)比較不同濃度Pb2+和Cd2+對(duì)Vp生物被膜形成影響.

圖1 不同溫度條件對(duì)副溶血弧菌生物被膜形成的影響Fig.1 Effects on biofilm formation of Vibrio parahemolyticus at different temperature

2.2 重金屬離子對(duì)生物被膜形成的影響

2.2.1 結(jié)晶紫染色觀察副溶血弧菌生物被膜的形成情況

37 ℃是副溶血弧菌生物被膜形成的最佳溫度條件，觀察此培養(yǎng)條件下Pb2+和Cd2+對(duì)生物被膜形成的影響.由圖2可知（1～6 分別對(duì)應(yīng)離子濃度是0、50、250、450、650、850 μg/L），細(xì)胞培養(yǎng)板中的細(xì)菌經(jīng)結(jié)晶紫染色后，可觀察到有生物被膜形成，并隨著Pb2+和Cd2+濃度逐漸升高，生物被膜生成量逐漸下降，且呈梯度變化趨勢(shì).

圖2 不同Pb2+和Cd2+濃度對(duì)副溶血弧菌生物被膜形成的影響Fig.2 Effects of different concentrations of lead and cadmium on biofilm formation of Vibrio parahaemolyticus

2.2.2 Pb2+對(duì)副溶血弧菌生物被膜形成的影響

本實(shí)驗(yàn)考查不同的硝酸鉛終濃度（0、50、250、450、650、850 μg/L）對(duì)副溶血弧菌生物被膜形成的作用，不同的Pb2+濃度代表水環(huán)境的不同污染程度.由圖3可知，在28 ℃時(shí)向培養(yǎng)基中添加不同濃度的Pb2+，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，OD630值呈先升后降的趨勢(shì)，6個(gè)濃度條件均在72 h時(shí)OD630值達(dá)到最高.隨著Pb2+濃度的增大，OD630值呈逐漸下降的趨勢(shì)，表明Pb2+能抑制副溶血弧菌生物被膜的形成.由圖4可知，在37 ℃時(shí)向培養(yǎng)基中添加Pb2+，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，OD630值呈先升后降趨勢(shì)，6個(gè)濃度條件均在72 h時(shí)OD630值達(dá)到最高.隨著Pb2+濃度的增大，OD630值呈逐漸下降的趨勢(shì)，其中Pb2+濃度在50 μg/L和250 μg/L時(shí)，培養(yǎng)96 h的OD630低于48 h和72 h.從圖3和圖4可知，96 h培養(yǎng)組的生物被膜隨著Pb2+濃度的升高，OD630下降最多，說(shuō)明被抑制的程度也最高，這可能與該條件下生物被膜的結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定有關(guān).

圖3 28 ℃時(shí)不同Pb2+濃度對(duì)副溶血弧菌生物被膜形成的影響Fig.3 Effects of different Pb2+concentrations on the biofilm formation of Vibrio parahaemolyticus at 28 ℃

圖4 37 ℃時(shí)不同Pb2+濃度下副溶血弧菌生物被膜形成的影響Fig.4 Effects of different Pb2+concentrations on the biofilm formation of Vibrio parahaemolyticus at 37 ℃

2.2.3 Cd2+對(duì)副溶血性弧菌形成生物被膜的影響

本實(shí)驗(yàn)考查不同的Cd2+終濃度（0、50、250、450、650、850 μg/L）對(duì)副溶血弧菌生物被膜形成的作用，不同的終濃度代表水體中Cd2+不同的污染程度.由圖5可知，在28 ℃時(shí)向培養(yǎng)基中添加Cd2+，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，OD630值呈先升后降的趨勢(shì)，在72 h 時(shí)OD630值達(dá)到最高.隨著Cd2+濃度的增大，OD630值呈逐漸下降的趨勢(shì)，其中培養(yǎng)96 h 的OD630在Cd2+濃度為0～450 μg/L 范圍時(shí)均低于24、48、72 h.由圖6可知，在37 ℃時(shí)向培養(yǎng)基中添加Cd2+，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，OD630值呈先升后降的趨勢(shì)，Cd2+濃度為0～450 μg/L范圍組于72 h時(shí)OD630值達(dá)到最高.隨著Cd2+濃度的增大，OD630值呈逐漸下降的趨勢(shì)，其中培養(yǎng)96 h的OD630在Cd2+濃度為50～650 μg/L 范圍時(shí)均低于24、48、72 h，這可能因?yàn)榕囵B(yǎng)96 h 時(shí)生物被膜降解脫落，形成量減少.

圖5 28 ℃時(shí)不同Cd2+濃度對(duì)副溶血弧菌生物被膜形成的影響Fig.5 Effects of different Cd2+concentrations on the biofilm formation of Vibrio parahaemolyticus at 28 ℃

圖6 37 ℃時(shí)不同Cd2+濃度對(duì)副溶血弧菌生物被膜形成的影響Fig.6 Effects of different Cd2+concentrations on the biofilm formation of Vibrio parahaemolyticus at 37 ℃

3 討論

溫度和時(shí)間是影響生物被膜形成的重要參數(shù)[8,13].本研究首先分析了4、28、37 ℃對(duì)副溶血弧菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC17802 生物被膜形成的影響.結(jié)果表明在37 ℃條件下48 h 時(shí)生物被膜形成量達(dá)到最大，之后逐漸下降，與查飛等的研究結(jié)果一致[16].生物被膜的這種形成規(guī)律，主要因?yàn)榧?xì)菌生物被膜的形成包括黏附、成熟和脫落3個(gè)階段，起始階段菌膜與固體介質(zhì)的黏附能力較弱，隨著菌膜成熟而形成穩(wěn)定的生物被膜結(jié)構(gòu)，然后胞外多糖分泌減少導(dǎo)致菌膜衰亡脫落[16].

沿海水域特別是海灣，已成為重要的海水養(yǎng)殖區(qū)域，同時(shí)也受到人類開(kāi)發(fā)活動(dòng)的干擾比較嚴(yán)重，尤其是重金屬污染.楊妙峰[17]等于2019年對(duì)漳州東山灣海域養(yǎng)殖的貝類體內(nèi)的重金屬含量進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)華貴櫛孔扇貝的Cd超標(biāo).黃玉英[18]等2020年分析了福州和泉州沿海養(yǎng)殖環(huán)境中貝類重金屬污染狀況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)泉州的毛蚶中Cr含量超出限量值.微生物生活在富含重金屬的環(huán)境中，通常會(huì)產(chǎn)生多種重金屬抗性和解毒機(jī)制[19].而生物被膜的形成通常與微生物對(duì)金屬的耐受性有關(guān)[20].假單胞菌產(chǎn)生的胞外多糖（EPS）對(duì)重金屬的生物吸附或富集是細(xì)菌抗重金屬特性的重要機(jī)制之一[19].微生物EPS對(duì)生物被膜和細(xì)胞聚集體的形成起著至關(guān)重要的作用，它有助于保護(hù)細(xì)胞免受惡劣環(huán)境的侵害，并能結(jié)合大量的重金屬[21].生物被膜和浮游細(xì)胞對(duì)重金屬的敏感性不同[22].研究表明，重金屬的絡(luò)合或固存作用以及阻止其在生物被膜中的擴(kuò)散可能是保護(hù)細(xì)胞免受重金屬毒性的重要原因[19].由于微生物EPS參與了溶液中重金屬的絮凝和結(jié)合作用，因此其在生物修復(fù)過(guò)程中也具有特殊的意義[23].

副溶血弧菌已被認(rèn)為是全世界食源性疾病的一個(gè)主要原因，它能夠產(chǎn)生比其浮游形式更能抵抗消毒劑和抗生素的生物被膜[24].生物被膜的形成是一個(gè)復(fù)雜的動(dòng)態(tài)過(guò)程，取決于細(xì)菌的性質(zhì)和培養(yǎng)溫度，而對(duì)于副溶血弧菌生物被膜的形成，這種相關(guān)性還不清楚[24].生物被膜的形成是食品工業(yè)的重要難題，因?yàn)檫@些生物被膜可能是交叉污染的來(lái)源，降低了食品的安全性[25].副溶血弧菌可以形成穩(wěn)定的生物被膜，其生物被膜的形成與培養(yǎng)時(shí)間、溫度、重金屬鉛和鎘濃度有著密切的關(guān)系.本實(shí)驗(yàn)中副溶血弧菌形成生物被膜的最佳時(shí)間為72 h，最佳培養(yǎng)溫度為37 ℃.培養(yǎng)基中添加Pb2+和Cd2+均會(huì)抑制副溶血弧菌形成生物被膜，添加的硝酸鉛和硝酸鎘濃度為50 μg/L時(shí)出現(xiàn)抑制作用，隨著硝酸鉛和硝酸鎘濃度越高，測(cè)得的OD630值越小.本實(shí)驗(yàn)中得出副溶血弧菌生物被膜最佳培養(yǎng)溫度是37 ℃，而梁宏雁等[11]的實(shí)驗(yàn)中最佳培養(yǎng)溫度為28 ℃，所以在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中同時(shí)比較在37 ℃和28 ℃條件下重金屬對(duì)生物被膜形成的影響.硝酸鉛對(duì)副溶血弧菌生物被膜起抑制作用，這可能是加入Pb2+的培養(yǎng)液具有親水性，生物有機(jī)體分散生長(zhǎng).本實(shí)驗(yàn)中副溶血弧菌生物被膜形成量隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，72 h 處達(dá)到最大值，這符合細(xì)菌生物被膜的形成過(guò)程，在0至72 h里生物被膜逐漸生長(zhǎng)到成熟，之后生物被膜降解，細(xì)胞脫落，生物被膜形成量下降.

總之，研究副溶血弧菌形成生物被膜的最佳時(shí)間和溫度以及重金屬鉛和鎘對(duì)其形成生物被膜的影響，確定水中Pb2+、Cd2+一定程度的污染是否會(huì)抑制副溶血弧菌形成生物被膜，可為深入研究重金屬對(duì)該菌形成生物被膜的作用奠定基礎(chǔ)，也為有效控制該菌形成生物被膜提供參考.