斯彩娟 章小艷 王衛(wèi)光 周 鋒 張 倫

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)是一種慢性、非特異性腸道炎癥，西方發(fā)達國家發(fā)生率較高[1]。近年來，我國UC發(fā)生率呈逐年上升趨勢[2]。據(jù)統(tǒng)計我國UC發(fā)生率約為11.6/10萬[3]。UC病程遷延易復發(fā)，極易發(fā)生癌變，已成為引起結(jié)腸癌的主要原因之一，給社會及患者家庭帶來沉重的經(jīng)濟負擔[4,5]。UC病因和發(fā)病機制尚不明確，但飲食因素在其發(fā)生、發(fā)展及治療過程中具有重要作用。近年來低FODMAP飲食在UC轉(zhuǎn)歸中的作用逐漸受到關注。但尚缺乏相關研究證據(jù)，本研究旨在探討低FODMAP飲食聯(lián)合美沙拉嗪對UC大鼠腸道黏膜炎性因子及通透性的作用。

材料與方法

1.實驗動物:雄性Wistar大鼠40只購自浙江大學醫(yī)學院動物實驗中心，SPF級，體質(zhì)量210±10g，溫度22±2℃，自由攝取食物及飲水。

2.主要試劑:白介素-8(interleukin-8,IL-8)抗體、白介素-33 (interleukin-33, IL-33)抗體、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)抗體、E-鈣黏蛋白(E-cadherin)抗體、閉合蛋白(occludin)抗體，均購自英國Abcam公司；閉合小帶蛋白-1(zonula occludens-1, ZO-1)抗體購自美國Proteintech公司；蘇木精、伊紅購自德國BASO公司。

3.造模：從40只雄性大鼠中隨機選取10只作為A組，其余30只利用TNBS灌腸法(5%TNBS與35%乙醇1∶1配成灌腸液)制作UC模型。造模前禁食36h，用灌胃針輕輕從肛門插入，推入灌腸液(100mg/kg TNBS)，提尾倒立1min后放回籠中自然蘇醒，并常規(guī)飼養(yǎng)，建模第3天判斷造模是否成功，并開始給予相應干預措施。

4.干預及標本采集:造模成功后將UC大鼠隨機分為3組，即B、C、D組，并給予相應干預措施。A組、B組、C組飼料同前，均為SPF級鼠糧，包括小麥、玉米、麩皮、豆柏和酵母粉等；D組給予制備的低FODMAP鼠糧，包括大米、南瓜、小米、燕麥、土豆、白菜和葡萄糖等[6]。C組、D組均予以美沙拉嗪灌胃，劑量為0.5g/(kg·d)。干預治療周期12天，末次給藥后24h處死，取出每只大鼠結(jié)腸黏膜組織，挑取潰瘍最明顯處腸段，若無潰瘍則選取紅腫糜爛較明顯處腸段，沿縱軸切開，分為5份，進行相應處理，并保存待測。

5.DAI評價:記錄并統(tǒng)計造模后第3、4、7、10、15天各組大鼠的DAI，參照Murano等所列標準進行評分，DAI=(體質(zhì)量下降分數(shù)+便性狀分數(shù)+便血分數(shù))/3[7],詳見表1。

表1 DAI評分標準

6.病理組織學評分：制作大鼠結(jié)腸組織切片，光鏡下觀察病理改變并評分，在視野下隨機選8處評分并取均值，參照以下標準：正常腸黏膜計0分；少1/3隱窩計1分；少2/3隱窩計2分；固有層被單層上皮細胞覆蓋和較少的炎性細胞浸潤計3分；炎性細胞數(shù)量增多并有炎性細胞明顯浸潤計4分[8]。

7.大體標本評分：參照以下標準：無損傷為0分；黏膜充血為1分；潰瘍面積<受損面積的25%為2分；潰瘍面積=受損面積的25%～50%為3分；潰瘍面積>受損面積的50%為4分。

8.腸道黏膜炎性因子水平及通透性測定：提取大鼠結(jié)腸組織蛋白，-80℃保存待測。利用ELISA測定腸黏膜組織中IL-8、IL-33、TNF-α水平，采用Western blot法檢測E-cadherin、ZO-1、occludin的表達水平。

結(jié) 果

1.動物模型評價：建模前大鼠反應靈活，毛色光潤，活動、飲食及大小便均正常，建模后相繼出現(xiàn)稀爛便、黏液便、血便，伴倦怠懶動、反應遲鈍、毛發(fā)凌亂、拱背、飲食飲水減少、體重下降等現(xiàn)象。隨機選取2只大鼠，處死后取出結(jié)腸組織(肛門上段2～10cm)可見結(jié)腸明顯水腫、充血、潰瘍，病理切片提示結(jié)腸炎。

2.DAI結(jié)果比較：建模成功后(建模第3天)，除A組外，其余各組大鼠DAI均顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，B、C、D組之間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。經(jīng)治療后，A組和B組大鼠DAI均未發(fā)生明顯變化，治療組大鼠DAI均呈現(xiàn)下降趨勢，且D組下降趨勢更明顯。其中，造模第4天，治療組大鼠DAI略低于模型組大鼠，3組之間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；造模第7、10、13、15天，治療組大鼠DAI均顯著低于B組，且D組均顯著低于C組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖1)。

圖1 大鼠DAI評分

3.HS和GS結(jié)果比較：B組大鼠結(jié)腸黏膜HS和GS較A組顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；治療后，治療組大鼠結(jié)腸黏膜HS和GS較模型組均顯著下降，且D組顯著低于C組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，表2)。

表2 大鼠病理組織學評分和大體標本評分

4.大鼠腸黏膜的組織病理學特征：A組大鼠的結(jié)腸切片完整，腺體分泌大量黏蛋白。B組大鼠結(jié)腸顯示出黏膜嚴重壞死，巨噬細胞和中性粒細胞浸潤及黏膜下層水腫；經(jīng)治療后，C組大鼠腸黏膜糜爛顯著減少，黏膜下層輕微水腫，幾乎無炎性細胞浸潤；D組大鼠腸黏膜未顯示出明顯的病理學改變(圖2)。

圖2 大鼠結(jié)腸黏膜病理切片(HE，×200)A.健康對照組;B.模型組;C.普通飲食+美沙拉嗪組;D.低FODMAP飲食+美沙拉嗪組

5.炎性因子表達水平比較：B組大鼠IL-8、IL-33和TNF-α表達水平較A組顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；治療后，治療組大鼠IL-8、IL-33和TNF-α表達水平較B組顯著降低，且D組顯著低于C組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，表3)。

表3 大鼠結(jié)腸黏膜炎性因子水平

6.大鼠腸道黏膜通透性比較：B組大鼠腸黏膜E-cadherin、ZO-1和occludin的表達水平較A組顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；治療后，治療組大鼠腸黏膜中E-cadherin、ZO-1和occludin的表達水平較B組顯著上調(diào)，且D組與C組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖3)。

圖3 大鼠腸道黏膜通透性相關蛋白表達情況與A組比較，*P<0.01；與B組比較，#P<0.05；與C組比較，ΔP<0.05

討 論

近年來，飲食干預治療UC逐漸受到重視，尤其是低FODMAP飲食，已有研究證實低FODMAP飲食可以顯著改善腸易激綜合征患者臨床癥狀和體征，但低FODMAP飲食對UC的作用尚不清楚[9]。本研究結(jié)果表明低FODMAP飲食聯(lián)合美沙拉嗪治療UC可以有效促進腸道黏膜恢復，緩解其癥狀。這與相關人群研究結(jié)果一致，有研究顯示，利用低FODMAP飲食對胃腸道功能紊亂患者進行干預，可有效降低UC活動度，緩解其臨床癥狀[10～12]。

目前，普遍認為UC與免疫介導的炎性反應和腸道黏膜通透性增加相關。TNF-α是一類普遍存在的炎性細胞因子，作為UC發(fā)病過程中重要的啟動因子，在UC的發(fā)生、發(fā)展過程中具有重要作用，不僅可以引起局部組織的炎性反應，而且可以刺激機體相關細胞釋放多種促炎因子，其中，IL-8可通過趨化作用，并與TNF-α產(chǎn)生協(xié)同作用，導致結(jié)腸黏膜組織細胞浸潤增加，加重腸黏膜炎性損傷，大量研究顯示，TNF-α的表達水平與UC的嚴重程度具有明顯的線性關系[13,14]。IL-33可以通過作用于IL-33/ST2信號通路刺激機體產(chǎn)生多種炎性因子，促進腸道黏膜產(chǎn)生炎性反應，加重其損傷[15]。有研究表明，機體IL-33的表達水平與UC活動度呈正相關，可作為UC發(fā)病的預測因子[16]。而腸道黏膜通透性增加，可導致腸道菌群移位，破壞腸道穩(wěn)態(tài)，引起炎性反應。同時，炎性反應又導致腸道黏膜通透性增加，形成惡性循環(huán)[17]。FODMAP飲食是一類可發(fā)酵的短鏈碳水化合物，包括可發(fā)酵的低聚糖、雙糖、單糖和多元醇，該類食物攝入過多不僅可以增加腸道黏膜通透性，導致腸腔內(nèi)液體量增加和小腸體積擴張，引起腸道菌群移位，進而誘發(fā)或加重相關炎性反應；而且過多的低聚糖及乳糖，經(jīng)腸道微生物發(fā)酵可產(chǎn)生大量氣體及正丁酸，引起腸腔擴張和內(nèi)臟高敏感，導致炎性反應[18]。本研究建模后，B組大鼠腸道黏膜IL-8、IL-33和TNF-α表達水平較A組顯著上升，腸道黏膜通透性增加；經(jīng)治療后，D組大鼠腸道黏膜中IL-8、IL-33和TNF-α表達水平顯著降低，腸道黏膜通透性得到改善，且效果優(yōu)于C組。表明低FODMAP飲食聯(lián)合美沙拉嗪可以顯著降低UC大鼠結(jié)腸黏膜相關炎性因子的表達，改善腸道黏膜通透性。

綜上所述，低FODMAP飲食聯(lián)合美沙拉嗪治療UC大鼠可以提高其臨床療效，不僅可以改善其癥狀，促進結(jié)腸黏膜修復，而且可以顯著降低炎性因子表達水平，改善腸黏膜通透性，緩解其炎癥。其機制可能是：①低FODMAP飲食可通過促進腸黏膜上皮細胞VD受體及細胞間緊密連接蛋白表達，降低腸道黏膜通透性，減少菌群移位，減輕炎性反應[19]；②低FODMAP飲食可通過減少組胺及結(jié)腸內(nèi)氣體、液體的產(chǎn)生，降低內(nèi)臟高敏感度，緩解相關癥狀[20～22]；③低FODMAP飲食可以通過抑制NF-κB炎性信號轉(zhuǎn)導通路、增加T細胞生成而發(fā)揮其抗炎作用[23]。但目前關于其機制尚不明確，仍需要開展進一步研究予以證實。