張 楊 范崇盛 郭 潔 趙 丹 魏珍星

喉癌在呼吸道惡性腫瘤中的發(fā)生率居第2位，是最常見的頭頸惡性腫瘤之一[1]。目前，喉癌發(fā)生率在多數(shù)國家均呈上升趨勢，吸煙、空氣污染、酒精等可能是喉癌的致病因素[2]。盡管外科手術(shù)方式、化療藥物和放射治療手段均得到很大的發(fā)展，喉癌患者的總體生存率仍然較低[3]。喉癌在分子水平的發(fā)病機制尚未明確，尋找新的分子治療靶點對提高喉癌患者生存率顯得尤為迫切。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類長度>200nt的內(nèi)源性RNA分子，不能編碼蛋白，主要通過調(diào)控基因組印記、核內(nèi)運輸、轉(zhuǎn)錄激活等方式影響基因的表達(dá)[4]。lncRNA在鼻咽癌、食管癌、甲狀腺癌等多種腫瘤中的表達(dá)呈異常改變，其作用類似于抑癌基因或癌基因，參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，在腫瘤的早期診斷、治療和預(yù)后等方面可能具有潛在的臨床價值[5, 6]。FAM27L全長682nt，已被證實在卵巢癌組織中呈低表達(dá)，F(xiàn)AM27L表達(dá)水平較高的患者總體生存時間較長，F(xiàn)AM27L可作為卵巢癌患者的獨立預(yù)后因素[7]。FAM27L在喉癌中作用的研究尚未見報道，本研究通過對喉癌組織和細(xì)胞系的研究，探討FAM27L對喉癌細(xì)胞增殖和侵襲的影響及其分子機制。

材料與方法

1.組織標(biāo)本：收集2018年2月～2020年10月在筆者醫(yī)院行喉癌手術(shù)的35例患者的癌組織和癌旁組織標(biāo)本，所有組織均在離體后立即置于液氮保存，所有癌組織均經(jīng)病理學(xué)檢查為喉癌組織，癌旁組織未見癌細(xì)胞?；颊吣挲g51～68歲，平均年齡為57.14±7.72歲。低分化5例，中高分化30例。Ⅰ～Ⅱ期共15例，Ⅲ～Ⅳ期共25例。聲門型23例，聲門上型+聲門下型12例。所有患者術(shù)前均未行放療、化療等輔助治療。該研究通過筆者醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會的批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書。

2.細(xì)胞系與主要試劑：喉癌細(xì)胞系(AMC-NH-8、TU177、Hep-2、TU212、TU686)和人支氣管上皮細(xì)胞(16HBE)購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心。陰性對照質(zhì)粒和FAM27L過表達(dá)質(zhì)粒購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。qPCR試劑盒購自瑞士Roche公司。四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)試劑盒購自美國Sigma公司。DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Gibco公司。Transwell小室購自美國Corning公司。LipofectamineTM2000和Trizol試劑購自美國Invitrogen公司。RPL41、GAPDH、p-JNK、p-ERK、p-mTOR蛋白抗體購自美國CST公司。Matrigel基質(zhì)膠購自美國BD公司。

3.細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染：喉癌細(xì)胞系(AMC-NH-8、TU177、Hep-2、TU212、TU686)和人支氣管上皮細(xì)胞(16HBE)采用DMEM(含10%胎牛血清)培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。調(diào)整對數(shù)生長期的TU212細(xì)胞密度，接種于6孔板，過夜培養(yǎng)后，根據(jù)LipofectamineTM2000說明書分別將陰性對照質(zhì)粒和FAM27L過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至細(xì)胞，將細(xì)胞分為陰性對照組和FAM27L組。

4.qPCR檢測組織和細(xì)胞中FAM27L、miR-744-3p和RPL41 mRNA的表達(dá)：采用Trizol法提取組織勻漿及細(xì)胞總RNA并反轉(zhuǎn)錄，根據(jù)SYBR Premix Ex Taq試劑盒說明書制備qPCR反應(yīng)體系，反應(yīng)參數(shù)為96℃ 15 min、95℃ 10 s、62℃ 40s、72℃ 40s，35個循環(huán)。GAPDH作為內(nèi)參檢測FAM27L和RPL41 mRNA的表達(dá)，U6作為內(nèi)參檢測miR-744-3p的表達(dá)。相對表達(dá)量以2-ΔΔCt法進(jìn)行計算，qPCR引物詳見表1。

表1 檢測FAM27L、miR-744-3p和RPL41 mRNA表達(dá)的qPCR引物序列

5.MTT法檢測TU212細(xì)胞增殖能力：將兩組穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞按照每孔2×103個細(xì)胞鋪至96孔板，在培養(yǎng)箱內(nèi)連續(xù)培養(yǎng)5天，每天進(jìn)行MTT法測量，每孔加入MTT溶液10μl，在培養(yǎng)箱內(nèi)避光培養(yǎng)4h，棄掉孔內(nèi)培養(yǎng)基，每孔加入DMSO溶液100μl，于搖床快速振蕩10min，保證結(jié)晶物充分溶解，將96孔板置于酶標(biāo)儀檢測450nm波長處的吸光度(A)值，繪制TU212細(xì)胞生長曲線。

6.Transwell實驗檢測TU212細(xì)胞侵襲能力：將30μl Matrigel基質(zhì)膠均勻鋪于Transwell小室，在培養(yǎng)箱中凝固。實驗前12h更換兩組細(xì)胞培養(yǎng)基為無血清培養(yǎng)基。將600μl完全培養(yǎng)基加入24孔培養(yǎng)板。消化兩組細(xì)胞并清洗3遍，細(xì)胞重懸并計數(shù)，加入200μl細(xì)胞懸液至Transwell小室，消除氣泡。培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h，取出Transwell小室，甲醇固定，0.1%結(jié)晶紫染液進(jìn)行染色，流水清洗后采用棉簽擦拭Transwell小室內(nèi)部，在倒置顯微鏡下計數(shù)穿過膜的細(xì)胞數(shù)。

7.生物信息學(xué)網(wǎng)站預(yù)測FAM27L互補結(jié)合的基因和位點：按照LncBase Predicted V.2網(wǎng)站預(yù)測FAM27L可互補結(jié)合的miRNA，使用miRWalk2.0網(wǎng)站預(yù)測miRNA可互補結(jié)合的靶基因。

8.Western blot法檢測RPL41及MAPK信號通路蛋白的表達(dá)：將轉(zhuǎn)染后48h的兩組TU212細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液裂解35min，收集上清并檢測蛋白濃度。蛋白變性后，每組加30μg蛋白至聚丙烯酰氨凝膠(5%濃縮膠，10%分離膠)，電泳后轉(zhuǎn)膜，采用5%脫脂奶粉封閉，加入一抗GAPDH(1∶3000稀釋)、RPL41(1∶1000稀釋)、p-JNK(1∶500稀釋)、p-ERK(1∶1000稀釋)、p-mTOR(1∶500稀釋)4℃孵育過夜。TBST溶液洗膜后，加入二抗孵育2h，滴加ECL發(fā)光試劑，采用凝膠成像系統(tǒng)拍照。

結(jié) 果

1.FAM27L在喉癌組織和癌旁組織中的表達(dá)：qPCR檢測結(jié)果顯示，與癌旁組織比較，F(xiàn)AM27L在喉癌組織中表達(dá)下調(diào)(圖1，P<0.01)。

圖1 FAM27L在喉癌組織和癌旁組織中的表達(dá)

2.FAM27L在人支氣管上皮細(xì)胞和喉癌細(xì)胞系的表達(dá)：qPCR檢測結(jié)果(圖2)顯示，F(xiàn)AM27L在喉癌細(xì)胞系(AMC-NH-8、TU177、Hep-2、TU212、TU686)中的表達(dá)明顯低于人支氣管上皮16HBE細(xì)胞(P<0.05或P<0.01)，其中在TU212細(xì)胞中表達(dá)量最低(P<0.01)，故選擇TU212細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。

圖2 FAM27L在人支氣管上皮細(xì)胞和喉癌細(xì)胞系中的表達(dá)與16HBE細(xì)胞比較，*P<0.05，**P<0.01

3.轉(zhuǎn)染FAM27L過表達(dá)質(zhì)粒明顯促進(jìn)TU212細(xì)胞FAM27L的表達(dá)：qPCR檢測結(jié)果顯示，陰性對照組和FAM27L組TU212細(xì)胞中FAM27L表達(dá)量分別為1.03±0.13和12.55±1.39(P<0.01)，成功構(gòu)建FAM27L過表達(dá)細(xì)胞系。

4.過表達(dá)FAM27L可抑制TU212細(xì)胞的增殖能力：MTT實驗檢測結(jié)果顯示，與陰性對照組比較，過表達(dá)FAM27L后FAM27L組的TU212細(xì)胞增殖能力從第2天開始明顯降低(圖3，P<0.05或P<0.01)。

圖3 過表達(dá)FAM27L對喉癌細(xì)胞TU212增殖能力的影響與陰性對照組比較，*P<0.05，**P<0.01

5.過表達(dá)FAM27L可抑制TU212細(xì)胞的侵襲能力：Transwell實驗檢測結(jié)果(圖4)顯示，陰性對照組和FAM27L組TU212細(xì)胞穿過膜的細(xì)胞數(shù)分別為95.14±8.82個和44.12±8.92個(P<0.01)。

圖4 過表達(dá)FAM27L對喉癌細(xì)胞TU212侵襲能力的影響A.穿膜細(xì)胞結(jié)晶紫染色(×100)；B.穿膜細(xì)胞數(shù)統(tǒng)計分析

6.生物信息學(xué)預(yù)測：采用LncBase Predicted V.2預(yù)測結(jié)果顯示，F(xiàn)AM27L可與miR-744-3p互補結(jié)合，miRWalk2.0預(yù)測預(yù)測結(jié)果顯示，miR-744-3p與RPL41 mRNA存在靶向結(jié)合位點(圖5)。

圖5 生物信息學(xué)方法預(yù)測FAM27L互補結(jié)合的基因和位點A.FAM27L與miR-744-3p互補結(jié)合的位點;B.miR-744-3p與RPL41 mRNA互補結(jié)合的位點

7.過表達(dá)FAM27L可調(diào)控miR-744-3p、RPL41 mRNA的表達(dá)：陰性對照組和FAM27L組TU212細(xì)胞中miR-744-3p表達(dá)量分別為1.01±0.08和0.24±0.07(P<0.01)。與陰性對照組比較，F(xiàn)AM27L組細(xì)胞中miR-744-3p的表達(dá)降低。陰性對照組和FAM27L組TU212細(xì)胞中RPL41 mRNA表達(dá)量分別為1.02±0.07和7.38±1.01(P<0.01)。與陰性對照組比較，F(xiàn)AM27L組細(xì)胞中RPL41 mRNA的表達(dá)增加。

8.過表達(dá)FAM27L對RPL41蛋白及MAPK信號通路蛋白表達(dá)的影響：Western blot法檢測結(jié)果顯示，與陰性對照組比較，轉(zhuǎn)染FAM27L后，RPL41蛋白表達(dá)增加，MAPK信號通路蛋白p-JNK、p-ERK、p-mTOR表達(dá)降低(圖6)。

圖6 Western blot法檢測 FAM27L對RPL41蛋白表達(dá)的影響

討 論

長鏈非編碼RNA(lncRNA)參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞分化、增殖、凋亡、侵襲、遷移等生命活動，在腫瘤血管生長、化療敏感度、放療敏感度等方面扮演重要角色，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及患者的預(yù)后密切相關(guān)[8, 9]。研究顯示，部分lncRNA在喉癌中的表達(dá)異常改變，可能成為喉癌的生物學(xué)標(biāo)志物和分子治療靶標(biāo)[10]。Liu等[11]研究證實，喉癌組織中SNHG1的表達(dá)高于癌旁組織，SNHG1表達(dá)水平與病理分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，SNHG1表達(dá)水平高的患者的總生存期較差，敲除SNHG1可導(dǎo)致喉癌細(xì)胞的活力和增殖能力下降。Tang等[12]研究表明，沉默DGCR5表達(dá)可抑制喉癌細(xì)胞的腫瘤干性，增強其對放射治療的敏感度。研究表明，F(xiàn)AM27L的功能類似抑癌基因，與卵巢癌的預(yù)后顯著相關(guān)[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，在喉癌組織中FAM27L表達(dá)水平明顯低于癌旁組織，在喉癌細(xì)胞系中FAM27L表達(dá)水平明顯低于人支氣管上皮細(xì)胞，表明FAM27L可能在喉癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。通過進(jìn)一步構(gòu)建FAM27L過表達(dá)細(xì)胞系，MTT實驗和Transwell實驗結(jié)果顯示，過表達(dá)FAM27L后，TU212細(xì)胞的增殖和侵襲能力均明顯降低。

miRNA是lncRNA發(fā)揮作用的重要一環(huán)，lncRNA通過堿基不完全配對方式與miRNA互補結(jié)合，下調(diào)miRNA的表達(dá)[13]。本研究應(yīng)用LncBase Predicted V.2數(shù)據(jù)庫預(yù)測FAM27L可與miR-744-3p互補結(jié)合。Li等[14]研究發(fā)現(xiàn)，miR-744-3p在喉癌細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)，miR-744-3p表達(dá)水平與喉癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，沉默miR-744-3p表達(dá)可抑制喉癌細(xì)胞的遷移和侵襲，提示miR-744-3p作為癌基因促進(jìn)喉癌的進(jìn)展。本研究結(jié)果顯示，過表達(dá)FAM27L后TU212細(xì)胞中miR-744-3p表達(dá)下調(diào)，提示FAM27L抑制TU212細(xì)胞增殖和侵襲作用可能與下調(diào)miR-744-3p的表達(dá)有關(guān)。miRNA主要通過與靶基因mRNA互補結(jié)合，降解靶基因mRNA或直接抑制其翻譯為蛋白，從而靶基因的表達(dá)[15]。本研究應(yīng)用miRWalk2.0數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-744-3p可與核糖體蛋白L41(ribosomal protein L41，RPL41)mRNA互補結(jié)合。RPL41屬于核糖體蛋白家族，是由25個氨基酸組成的小分子多肽[16]。研究顯示，RPL41在多種腫瘤如肝癌、膽管癌、宮頸癌中表達(dá)缺失或降低，提示RPL41可能具有腫瘤抑制作用，RPL41是一種抑癌基因[17]。本研究顯示，miR-744-3p表達(dá)下調(diào)后，RPL41 mRNA的表達(dá)增加。MAPK信號通路對喉癌細(xì)胞增殖和侵襲起到明顯的促進(jìn)作用[18]。RPL41蛋白表達(dá)增加后，MAPK信號通路蛋白p-JNK、p-ERK、p-mTOR表達(dá)明顯降低，提示MAPK信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)被干擾。

綜上所述，F(xiàn)AM27L在喉癌組織和細(xì)胞系中低表達(dá)，高表達(dá)FAM27L可能通過下調(diào)miR-744-3p的表達(dá)，促進(jìn)RPL41基因的表達(dá)，干擾MAPK信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而抑制喉癌細(xì)胞的增殖和侵襲。本研究可能為以FAM27L為靶點的基因治療提供一定的理論和實驗基礎(chǔ)。