龍慎豪 張 煒 劉亞麗 胡 衛(wèi)

(1. 三峽大學(xué) 醫(yī)學(xué)院， 湖北 宜昌 443002； 2. 宜昌市中醫(yī)醫(yī)院 腫瘤科， 湖北 宜昌 443002)

骨癌痛是一種嚴重的癌癥并發(fā)癥，常出現(xiàn)在原發(fā)性骨腫瘤，或源于乳腺癌和前列腺癌等的繼發(fā)骨轉(zhuǎn)移。研究表明，約有1/3的骨轉(zhuǎn)移患者存在過骨癌痛，骨癌痛也被認為是最難治療的疼痛癥狀之一，嚴重影響著患者的生活質(zhì)量[1,2]。到目前為止，骨癌痛的治療效果仍不理想，如何有效控制骨癌痛已然成為亟需解決的臨床問題。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)控制骨癌痛的方法主要集中在抗腫瘤方面，輔助以三階梯止痛療法。但這種方案對中晚期癌癥患者的疼痛癥狀改善不明顯，且存在著嚴重的副作用，比如惡心、便秘、頭昏、呼吸抑制、嗜睡以及阿片類鎮(zhèn)痛藥引起的耐藥性和成癮性等[3,4]。中醫(yī)藥在治療骨癌痛方面與西醫(yī)藥有著獨特區(qū)別，一方面中藥療效持久且副作用小，另一方面中藥還能改善患者精神狀態(tài)，提高患者生存質(zhì)量[5]。中藥苦參是豆科槐屬植物苦參(sophoraflavescens)的干燥根，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，是我國歷史悠久的傳統(tǒng)中藥之一?？鄥⒃谥兴幹邪垂πХ诸悓儆谇鍩崴幹械那鍩嵩餄袼?，功效清熱燥濕、殺蟲、利尿等。常用于治療熱痢、黃疸、尿閉、濕疹、濕瘡、疼痛等疾病。對苦參的現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，苦參具有抗免疫抑制、抗腫瘤、抗炎、鎮(zhèn)痛等藥理作用[6]。研究表明，復(fù)方苦參注射液對骨癌痛療效確切，并能明顯緩解疼痛，提高患者的生活及生存質(zhì)量[7]。然而，關(guān)于復(fù)方苦參注射液的主要組成成分——苦參治療骨癌痛研究仍較少。因此，在本研究中，我們將運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和生物信息學(xué)方法來預(yù)測苦參治療骨癌痛的潛在藥理學(xué)機制。

1 材料與方法

1.1 苦參的活性成分收集與篩選

以“苦參”或“kushen”為關(guān)鍵詞，分別檢索中醫(yī)系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(TCMSP， http://tcmspw.com/tcmsp.php)和中藥分子機制的生物信息學(xué)分析工具(BATMAN，http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)。剔除重復(fù)結(jié)果后，初步獲取苦參成分。研究證明，當(dāng)化合物分子的口服生物利用度 (oral bioavailability，OB) ≥30%，類藥性 (drug likeness, DL) ≥0.18時能很好地被人體吸收，也具有更好的藥理特性[8,9]。因此，利用TCMSP數(shù)據(jù)庫中的藥代動力學(xué)工具，以O(shè)B≥30%同時DL≥0.18作為標準，篩選得到待研究的活性化合物。

1.2 活性成分的潛在靶點預(yù)測

以上述每個活性化合物的名稱作為關(guān)鍵詞，逐一對醫(yī)學(xué)文獻檢索服務(wù)系統(tǒng)PubMed (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫進行檢索，將每一個活性成分分子的3D結(jié)構(gòu)以結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)文件 (Structure Data File, SDF)格式保存。然后，將所有活性分子的SDF文件上傳到Swiss (http://www.swisstargetprediction.ch/)數(shù)據(jù)庫[10]，設(shè)置物種為“Homo sapiens”，只保留可能性大于0的靶點，作為活性成分的預(yù)測靶點集。

1.3 骨癌痛的已知治療靶點

骨癌痛的已知治療靶點，通過檢索關(guān)鍵詞“cancer induced bone pain”、“bone cancer pain”和“cancer pain”，從治療靶點數(shù)據(jù)庫(therapeutic target database，TTD， http://db.idrblab.net/ttd/)及GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)中獲得[11]。同樣，設(shè)置物種為“Homo sapiens”，并剔除重復(fù)項后作為疾病已知治療靶點集。最后，將上述預(yù)測靶點集合疾病已知治療靶點集導(dǎo)入唯一蛋白靶點數(shù)據(jù)庫(unique protein, UniProt, https://www.uniprot.org/)中進行命名標準化，再取這兩個靶點集的交集部分，作為候選靶點[12]。

1.4 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

將上述候選靶點上傳至到蛋白質(zhì)相互作用在線分析平臺STRING(https://string-db.org/)數(shù)據(jù)庫，設(shè)置物種為“Homo sapiens”，獲取核心靶標之間的蛋白相互作用關(guān)系，并將篩選條件設(shè)置為最高可信度“highest confidence(≥0.7)”，其余參數(shù)默認。剔除掉游離于網(wǎng)絡(luò)的靶點后，剩下的即為網(wǎng)絡(luò)核心靶點。再采用Cytoscape (http://www.cytoscape.org/) 軟件來構(gòu)建“藥物-成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)，進行數(shù)據(jù)的可視化分析[13]。

1.5 靶點的GO-BP(基因生物學(xué)功能)和KEGG信號通路富集

為了更好地說明上述網(wǎng)絡(luò)核心靶點的生物學(xué)過程(biological process)及其所涉及的信號通路富集情況，我們利用CTD(http://ctdbase.org/)數(shù)據(jù)庫對這些核心靶點進行了基因本體論-生物學(xué)過程 (Gene Ontology-Biological Process，GO-BP)與京都基因與基因組百科全書 (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)信號通路富集分析，以錯誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)≤0.01為篩選條件，并根據(jù)FDR值由小到大排序[14,15]。

2 結(jié)果

2.1 活性成分信息

通過對TCMSP和BATMAN數(shù)據(jù)庫檢索共得到45個唯一化合物，其中符合TCMSP數(shù)據(jù)庫中藥代動力學(xué)篩選條件OB≥30%、 DL≥0.18的，且能以其化合物3D分子結(jié)構(gòu)反向預(yù)測靶點的活性成分共有34個?？鄥⒅谢钚猿煞衷敿毿畔⒁姳?。

表1 苦參活性化合物相關(guān)信息

2.2 核心靶點鑒定

通過分子反向預(yù)測，共得到預(yù)測靶點3 400個，剔除重復(fù)項后共775個唯一值。檢索TTD和GeneCards數(shù)據(jù)庫共得到129個骨癌痛的已知治療靶點。將靶點預(yù)測集與已知集取交集后導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫，得到靶蛋白之間的交互作用圖(圖1)。按照上述標準篩選，最后保留了32個網(wǎng)絡(luò)核心靶點作為后續(xù)研究對象。核心靶點的基本信息見表2。

表2 網(wǎng)絡(luò)核心靶點基本信息

圖1 核心靶點之間的蛋白互作關(guān)系網(wǎng)絡(luò)

2.3 “藥物-成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)與分析

由于中藥具有多成分、多靶點、多重藥理作用的特性，通過網(wǎng)絡(luò)分析探討中藥治療復(fù)雜疾病的潛在機制具有現(xiàn)實意義。為了說明苦參、活性成分、靶標和骨癌痛之間的關(guān)系，采用excel文件格式分別定義各節(jié)點及各連線的屬性和關(guān)系，通過Cytoscape軟件構(gòu)建了“苦參-活性成分-靶標-骨癌痛”的復(fù)合網(wǎng)絡(luò)。其中，各節(jié)點的大小按照其在網(wǎng)絡(luò)中的度 (degree)值由小到大漸變，各節(jié)點的顏色則依據(jù)其在網(wǎng)絡(luò)中的臨近中心性 (neighborhood connectivity)，由淺色向深色漸變，如圖2所示。

圖2 網(wǎng)絡(luò)核心靶點基本信息

2.4 富集分析結(jié)果

通過CTD數(shù)據(jù)庫對24個候選靶點進行GO富集分析(FDR≤0.01)，得到GO (biological process)條目895條，其中核心靶基因主要參與調(diào)節(jié)神經(jīng)再生、炎癥反應(yīng)、神經(jīng)分化、化學(xué)突觸傳遞、疼痛感受、神經(jīng)炎癥反應(yīng)等生物學(xué)過程，見圖3。

圖3 靶點的生物學(xué)過程富集分析

此外，根據(jù)通路注釋富集 (FDR≤0.01)結(jié)果，共得到信號通路196條。通過分析發(fā)現(xiàn)，核心靶點主要富集在破骨細胞分化、神經(jīng)生長因子的跨膜轉(zhuǎn)運、PI3K-Akt信號通路、軸突導(dǎo)向、癌癥中的膽堿代謝、與配體-受體接觸、鈣離子轉(zhuǎn)運、神經(jīng)遞質(zhì)綁定及轉(zhuǎn)運等多種生物信號途徑，見圖4。

圖4 核心靶點的信號通路富集分析

3 討論

骨癌痛作為轉(zhuǎn)移性腫瘤的常見并發(fā)癥，不僅難以有效控制，而且還嚴重影響患者的生活及生存質(zhì)量[16]。本研究采用了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法來探究苦參治療骨癌痛的潛在作用機制。通過檢索相關(guān)數(shù)據(jù)庫和應(yīng)用藥代動力學(xué)篩選，共鑒定出苦參中的34種活性成分，包括薯蕷皂素、苦參堿、去甲苦參醇、毛地黃黃酮、多種氧化性苦參堿(如7,11-dehydromatrine、(+)-7,11-dehydromatrine、5α,9α-dihydroxymatrine)、苦參素、谷甾醇、槲皮素等。一項關(guān)于氧化苦參堿的研究表明，氧化苦參堿可能通過調(diào)控TLR4/NF-κB信號通路，抑制背根神經(jīng)節(jié)中星形膠質(zhì)細胞的活化，從而抑制炎癥因子釋放，緩解乳腺癌轉(zhuǎn)移大鼠模型的骨癌痛[17]。另外一項關(guān)于谷甾醇的報道也證明苦參能減輕癌癥相關(guān)性疼痛[18,19]。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素可通過調(diào)節(jié)核因子-κB受體活化因子配體 (receptor activator of NF-κB ligand, RANKL)/ 核因子-κB受體活化因子 (receptor activator of NF-κB，RANK)/ 骨保護素(osteoprotegerin，OPG)信號通路和炎癥反應(yīng)，抑制骨癌疼痛模型中的破骨細胞活化，減少骨破壞。還通過調(diào)節(jié)瞬時受體電位香草酸受體1 (transient receptor potential vanilloid subfamily member1, TRPV1)信號通路抑制骨癌疼痛的外周敏化和中樞敏化[20]。除了直接止痛作用外，還有一些成分，比如薯蕷皂素、大豆抗毒素、柚皮素等，均被報道具有直接的抗腫瘤或抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用[21-23]?；谏鲜鍪聦?，我們推斷苦參可能通過其含有的多種活性成分協(xié)同作用治療骨癌痛，這也與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)中的“多成分”共同作用機制的內(nèi)涵相吻合。

結(jié)合Cytoscape軟件生成的關(guān)于“苦參-成分-靶點-骨癌痛”網(wǎng)絡(luò)(見圖2)的拓撲性質(zhì)數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，該網(wǎng)絡(luò)中靶點的度雄激素受體 (androgen receptor, AR)(度值17)、雌激素受體1 (estrogen receptor 1, ESR1)(度值16)、基質(zhì)金屬蛋白酶2 (matrix metallopeptidase 2, MMP2)(度值13)、速激肽受體1 (tachykinin receptor 1, TACR1)(度值13)和肝細胞生長因子受體 (mesenchymal-epithelial transition, MET)(度值12)，而網(wǎng)絡(luò)中靶點的臨近中心性 (neighborhood connectivity) top5則分別是瞬時感受器電位辣椒素通道(transient receptor potential vanilloid channel type 1，TRPV1)(臨近中心性17)、血小板衍生生長因子受體β (platelet-derived growth factor receptor β, PDGFRB)(臨近中心性16.8)、血小板衍生生長因子受體α (platelet-derived growth factor receptor α, PDGFRA)(臨近中心性16)、酪氨酸激酶受體2 (receptor tyrosine kinase 2, ERBB2)(臨近中心性14.6)和哺乳動物雷帕霉素靶蛋白 (mammalian target of rapamycin, mTOR)(臨近中心性14.5)。這表明僅就該復(fù)合網(wǎng)絡(luò)本身的拓撲性質(zhì)而言，這些靶點處于樞紐地位，因此也將作為后續(xù)的重點討論對象。在這些靶點之中，TRPV1被眾多研究報道參與調(diào)控骨癌痛的發(fā)生與發(fā)展。有報道證實，腫瘤組織的內(nèi)源性甲醛能夠通過TRPV1激活并誘導(dǎo)骨癌痛[24]。此外，有研究報道通過下調(diào)Janus激酶/磷脂酰肌醇3-激酶 (Janus kinase/Phosphatidylinositol 3-kinase，JAK/PI3K)信號通路來抑制背根神經(jīng)節(jié)中神經(jīng)元TRPV1的功能，可降低骨癌大鼠背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的高興奮性和痛覺過敏狀態(tài)[25]。還有研究發(fā)現(xiàn)，通過抑制骨癌痛大鼠模型體內(nèi)胰島素樣生長因子1 (insulin-like growth factor 1，IGF-1)受體的表達，可以逆轉(zhuǎn)骨癌痛大鼠的機械觸痛和熱痛覺過敏狀態(tài)[26]。除了TRPV1之外，ERBB2分子也被報道能阻斷蛋白激酶α、絲裂原活化蛋白激酶 (mitogen-activated protein kinase，MAPK)介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)從而實現(xiàn)對骨癌痛的抑制作用[27]。其他靶分子如ESR1、MMP2、TARC1、MET、mTOR等也被證明具有抗炎、抑制腫瘤細胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡及抑制腫瘤細胞轉(zhuǎn)移等多方面作用[28-31]。

為了更好地理解核心靶點與骨癌痛之間的聯(lián)系，我們采用CTD數(shù)據(jù)庫進行基因功能的生物學(xué)過程GOBP及信號通路富集情況分析?；蚬δ芨患Y(jié)果表明，這些靶基因主要參與調(diào)控神經(jīng)再生、神經(jīng)膠質(zhì)細胞分化、炎癥反應(yīng)、神經(jīng)炎癥反應(yīng)、感受疼痛刺激、外界物理(溫度、壓力等)刺激反應(yīng)等。此外，信號通路分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這些核心靶點主要富集于PI3K-Akt信號通路、mTOR信號通路、鈣離子信號通路、趨化因子信號通路等，并協(xié)調(diào)參與了包括癌癥中膽堿代謝、細胞因子受體相互結(jié)合、炎癥介質(zhì)調(diào)控瞬時受體電位(transient receptor potential，TRP)通路、神經(jīng)受體-配體互作、破骨細胞分化等在內(nèi)的多種生物學(xué)過程。目前關(guān)于骨癌痛的發(fā)病機制研究中，多傾向于認為骨癌痛的發(fā)生發(fā)展與神經(jīng)敏化、腫瘤微環(huán)境衍生物刺激、炎癥細胞分泌物刺激和成骨-破骨動態(tài)平衡打破等相關(guān)[32-35]，這與我們的GOBP和KEGG富集結(jié)果一致。

綜上所述，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法，揭示了苦參通過其多種活性成分靶向多基因治療骨癌痛的潛在分子機制，為骨癌痛的臨床治療提供了理論基礎(chǔ)。當(dāng)然，由于數(shù)據(jù)庫的更新情況限制，本研究中所涉及的成分和靶點數(shù)據(jù)均缺乏一定的完整性，相關(guān)機制也有待后續(xù)進一步的驗證。