李思佳 熊曉琦 李海濤 胡 勇 宋新宇

(1. 三峽大學(xué) 第一臨床醫(yī)學(xué)院[宜昌市中心人民醫(yī)院] 呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科， 湖北 宜昌 443003; 2. 三峽大學(xué) 第一臨床醫(yī)學(xué)院[宜昌市中心人民醫(yī)院] 介入放射科， 湖北 宜昌 443003)

據(jù)2019年中國腫瘤數(shù)據(jù)顯示，肺癌是中國居民死亡的主要原因。楊家鈺等[1]調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，肺癌已成為湖北省居民惡性腫瘤的首要死因。其中，小細(xì)胞肺癌(small cell lung cancer，SCLC)約占肺癌的15%，非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)約占肺癌的85%。雖然臨床上診斷出SCLC的占比較少，但其分化程度極低，且與NSCLC相比，發(fā)生血行轉(zhuǎn)移更早，預(yù)后更差[2]。雖然SCLC對化療敏感，但常發(fā)生多藥耐藥而導(dǎo)致化療失敗[3]。因此，開發(fā)療效好、副作用小的SCLC治療藥物具有重要意義。最早由豬肺組織中提取的小分子化合物2-(1’H-吲哚-3-羰基)噻唑-4-羧酸甲[2-(l'H-indole-3'-carbonyl-thiazole-4-carboxvlio acid methylester，ITE]是色氨酸的代謝產(chǎn)物，具有很強(qiáng)的抗腫瘤活性[4]。同時，ITE是人體內(nèi)源性小分子化合物，用于人體治療的相對安全性高。

腫瘤是由一小部分異型性腫瘤細(xì)胞不斷增殖、自我更新和分化發(fā)展而來，無限增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是腫瘤惡性演變的關(guān)鍵。八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子4(octamer-binding transcription factor 4，Oct4)是干細(xì)胞的重要轉(zhuǎn)錄因子，可以調(diào)控多種腫瘤的干細(xì)胞特性，增加腫瘤的耐藥性以及增殖和遷移能力[5]。Oct4 由POU5F1基因編碼，通過結(jié)合八堿基的保守序列“ATGCAAAT”來激活或者抑制靶基因的表達(dá)[6]。一直以來，Oct4被認(rèn)為是干細(xì)胞所特異性表達(dá)。近年來研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤細(xì)胞和組織中亦可檢測到Oct4基因的表達(dá)[6]。相對于在自我更新中的關(guān)鍵作用，Oct4在腫瘤干細(xì)胞凋亡調(diào)控中的研究較少，具體機(jī)制尚不明確。本研究擬觀察小分子化合物ITE對人H446干細(xì)胞增殖的作用，并探討其分子機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)及處理

NCI-H446細(xì)胞購自于ATCC細(xì)胞庫，采用含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)基在37℃，5% CO2，相對濕度95%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)3～5 d，待細(xì)胞融合度達(dá)50%～60%，用含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化，離心收集細(xì)胞。①腫瘤Sphere細(xì)胞培養(yǎng)：無血清RPMI 1640重懸1×106個H446細(xì)胞后采用無血清干細(xì)胞培養(yǎng)液(EGF 20 ng/mL；bFGF 20 ng/mL；LIF 10 ng/mL；B27 1∶50；PS 1∶100)培養(yǎng)。培養(yǎng)5～7 d可看到細(xì)胞球體形成，即Sphere細(xì)胞。②ITE處理：DMSO溶解ITE粉末配置母液，無血清干細(xì)胞培養(yǎng)液將母液配置為不同濃度工作液(1～80 μM)，不同濃度ITE處理H446細(xì)胞24 h。DMSO組采用無血清干細(xì)胞培養(yǎng)液+DMSO處理24 h，Control組采用無血清干細(xì)胞培養(yǎng)液處理24 h。

1.2 主要試劑及培養(yǎng)液

ITE(HY-19317，Med Chen Express公司)；1640培養(yǎng)液(12633012，Gibco公司)，胎牛血清(16140063，Gibco公司)；MTT 試劑盒(M6494，Roche 公司)；抗Oct4抗體(PA5-27194，Santa Cruz公司)；抗Bcl-2抗體(15071S，Cell Signaling Technology公司)；抗GAPDH抗體(PA1-988，碧云天公司)；抗鼠 IgG HRP-linked二抗和抗兔 IgG HRP-linked 二抗(7076和7074，Cell Signaling Technology公司)；EGF(E5036，Sigma-Aldric公司)，B27添加劑(12587-010，Gibco公司)，bFGF(PHG0266，Gibco公司)，LIF(L5283，Sigma-Aldric公司)，NuPAGE?MOPS SDS緩沖液(NP0001，Invitrogen公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 MTT法檢測細(xì)胞增殖

將H466細(xì)胞以3×104個/孔接種至96孔板，每孔100 μL培養(yǎng)液，處理后每孔中再加入10 μL的MTT A液，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h，加入MTT B液，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育過夜。測定每孔在595 nm波長下的吸光度值(optical density，OD)。實驗重復(fù)3次，每次3個復(fù)孔。

1.3.2 免疫熒光檢測

①取0.3 mL的4%多聚甲醛于室溫下固定細(xì)胞20 min，0.5 mL的 PBS 洗滌細(xì)胞5 min。②0.25%的TritonX-100于室溫下破膜30 min，0.5 mL的 PBS洗滌5 min。③0.5 mL的2.5%BSA封閉1 h。④取0.3 mL的一抗工作液4℃孵育過夜，0.5 mL的PBS 洗滌 5 min。⑤取0.3 mL的二抗工作液避光孵育1 h，0.5 mL的PBS 洗滌 10 min。⑥加入0.3 mL的PBS，于熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.3 免疫蛋白印跡檢測

①蛋白樣品以20 μL/孔上樣后， 60 V電泳80 min。②以轉(zhuǎn)膜海綿-濾紙-PVDF膜-膠-濾紙-轉(zhuǎn)膜海綿的順序?qū)⑷髦谓Y(jié)構(gòu)置于轉(zhuǎn)膜槽中，170 mA轉(zhuǎn)膜2 h。③取5%脫脂奶粉室溫下封閉膜 1 h。④TBST清洗3次，每次5 min，一抗4℃孵育過夜。⑤TBST清洗3次，每次5 min，二抗室溫孵育1 h。 ⑥TBST清洗3次，每次5 min，ELC曝光顯影并保存結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20.0 軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用t檢驗，以P<0.01為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人小細(xì)胞肺癌H446干細(xì)胞的富集

無血清干細(xì)胞液培養(yǎng)5～7 d，可收集到人小細(xì)胞肺癌H446富集干細(xì)胞(見圖1)。

圖1 人小細(xì)胞肺癌H446干細(xì)胞的富集(×40)

2.2 MTT法檢測細(xì)胞活力

不同濃度ITE處理H446富集干細(xì)胞24 h后，采用MTT法檢測各組細(xì)胞活力。如圖2所示，與DMSO組相比，ITE處理H446富集干細(xì)胞后可以顯著抑制細(xì)胞活力，其效應(yīng)呈濃度依賴性。結(jié)果提示，20 μM的ITE處理24 h可降低富集干細(xì)胞活力至0.46±0.03，后續(xù)實驗中均使用20 μM的ITE處理富集干細(xì)胞。

注：與DMSO組相比，**P<0.01圖2 MTT法檢測不同濃度ITE對H446富集干細(xì)胞活力的影響

2.3 人小細(xì)胞肺癌H446富集干細(xì)胞中Oct4蛋白的表達(dá)

收集H446親本細(xì)胞與富集干細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光檢測。如圖3所示，富集干細(xì)胞中Oct4的表達(dá)較親本細(xì)胞明顯增加。

圖3 人小細(xì)胞肺癌H446富集干細(xì)胞中Oct4的表達(dá)(×100)

2.4 H446親本細(xì)胞及富集干細(xì)胞中Oct4和Bcl-2的蛋白表達(dá)

收集H446親本細(xì)胞與富集干細(xì)胞進(jìn)行Western Blot檢測。如圖4所示，與親本細(xì)胞相比，富集干細(xì)胞中Oct4和Bcl-2的蛋白表達(dá)量均顯著增高(均P<0.01)。

注：與親本細(xì)胞組相比，**P<0.01圖4 H446親本細(xì)胞及富集干細(xì)胞中Oct4及Bcl-2的蛋白表達(dá)

2.5 小分子化合物ITE對H446富集干細(xì)胞中Oct4及Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

使用20 μM ITE處理H446富集干細(xì)胞24 h后，Western Blot檢測發(fā)現(xiàn)，與Control組相比，ITE顯著下調(diào)了富集干細(xì)胞中Oct4及Bcl-2蛋白表達(dá)，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.01，圖5)。

注：與Control組相比，**P<0.01圖5 ITE對H446富集干細(xì)胞中Oct4及Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

3 討論

通過靶向腫瘤干細(xì)胞中富集或細(xì)胞表面特異性表達(dá)腫瘤標(biāo)志物的熒光抗體，結(jié)合熒光激活細(xì)胞分選系統(tǒng)技術(shù)，可從各種腫瘤中分離并鑒定出腫瘤干細(xì)胞[7]。目前肺癌干細(xì)胞研究的一個重要難題是缺乏富集肺癌干細(xì)胞的有效手段[8]。探索可有效鑒定出肺癌干細(xì)胞的生物標(biāo)志物，可能為肺癌患者的干細(xì)胞相關(guān)治療提供潛在干預(yù)靶點。本研究發(fā)現(xiàn)，富集的人小細(xì)胞肺癌H446干細(xì)胞中Oct4的表達(dá)增加，提示Oct4可能是分離或鑒定肺癌干細(xì)胞的潛在標(biāo)志物。

腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生凋亡抵抗是降低化療療效和產(chǎn)生化療耐藥性的決定性因素[9]。因此，抑制腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生凋亡抵抗是改善化療效果和解決化療耐藥性的有效策略。細(xì)胞凋亡的發(fā)生受外源性刺激、促凋亡基因和抑凋亡基因共同調(diào)控。由于腫瘤可改善微環(huán)境以適應(yīng)并減弱外源性配體所誘導(dǎo)的凋亡，因此腫瘤細(xì)胞中促凋亡基因和抗凋亡基因之間的失衡決定了細(xì)胞凋亡的發(fā)生[10]?；熕幬锿ㄟ^調(diào)控某一個靶點或信號通路以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，若某種或多種凋亡抑制基因過表達(dá)或促凋亡基因受到抑制，細(xì)胞凋亡將被阻斷并可能誘導(dǎo)產(chǎn)生化療耐藥性[11]。在眾多凋亡相關(guān)基因中，已發(fā)現(xiàn)與腫瘤化療耐藥性有關(guān)的包括Bcl-2、P53、Bcl-XL等[12-14]。其中，Bcl-2被認(rèn)為是與小細(xì)胞肺癌產(chǎn)生化療耐藥性密切相關(guān)的凋亡抑制基因。Bcl-2家族可分為三個亞組，一組具有抗凋亡功能，另外兩組具有促凋亡功能。其中抗凋亡基因主要包括Bcl-2、Bcl-XL、Bcl-W、Mcl-1、A1和Bcl-B等，而促凋亡基因包括Bax、Bak和Bok等[15]。研究發(fā)現(xiàn)，Bcl-2在小細(xì)胞肺癌中表達(dá)異常增高，臨床上小細(xì)胞肺癌標(biāo)本中Bcl-2陽性率也明顯高于其他類型的肺癌，如鱗狀細(xì)胞癌、腺癌等[16,17]。體外細(xì)胞培養(yǎng)研究證實，Bcl-2是抑制小細(xì)胞肺癌凋亡的主要基因，Bcl-2的表達(dá)水平影響小細(xì)胞肺癌對化療的敏感性[17]。但也有研究發(fā)現(xiàn)，反義Bcl-2寡核苷酸或轉(zhuǎn)染的Bcl-2僅能部分影響化療耐藥性的產(chǎn)生[12]。盡管如此，Bcl-2仍是解決小細(xì)胞肺癌化療耐藥性的突破點。近年來聯(lián)合反義Bcl-2寡核苷酸(G3139)和化療藥物，如紫杉醇、依托泊苷進(jìn)行臨床研究，取得了一定的臨床效果[18]。既往研究認(rèn)為，腫瘤干細(xì)胞是介導(dǎo)腫瘤親本細(xì)胞產(chǎn)生多藥耐藥性及影響腫瘤細(xì)胞增殖的重要因素[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，與H446親本細(xì)胞相比，富集干細(xì)胞中Oct4和Bcl-2表達(dá)均顯著升高，該結(jié)果提示腫瘤干細(xì)胞可能通過上調(diào)Oct4和Bcl-2蛋白表達(dá)，從而介導(dǎo)腫瘤耐藥性及細(xì)胞增殖。因此，下調(diào)肺癌細(xì)胞中Oct4及Bcl-2的蛋白表達(dá)可能有助于降低肺癌的耐藥性，促進(jìn)肺癌細(xì)胞的凋亡以提高肺癌患者的生存率。

ITE是色氨酸的代謝產(chǎn)物，為芳香烴受體(aryl hydrocarbon receptor, AhR)內(nèi)源性的高親和力激動劑[4,20]。ITE最早從豬的肺組織中提取，具有很強(qiáng)的抗腫瘤活性[2]。研究發(fā)現(xiàn)，小分子藥物ITE結(jié)合細(xì)胞質(zhì)中AhR并促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄，AhR在細(xì)胞核中可結(jié)合Oct4基因的啟動子區(qū)，進(jìn)而抑制Oct4轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)腫瘤干細(xì)胞發(fā)生分化，并降低其致瘤能力[21]。研究證明，ITE可以顯著抑制肝癌細(xì)胞HCCLM3和SMMC7721的增殖和遷移能力，并且可明顯誘導(dǎo)索拉非尼耐藥細(xì)胞系HCCML3R發(fā)生細(xì)胞凋亡[22]。該研究證明，ITE對肝癌細(xì)胞及其耐藥細(xì)胞均具有較強(qiáng)的抗腫瘤作用，然而目前尚未有研究報道關(guān)于ITE對小細(xì)胞肺癌的相關(guān)研究。本研究發(fā)現(xiàn)，ITE可顯著抑制H446富集干細(xì)胞的增殖能力，并下調(diào)富集干細(xì)胞中干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子Oct4和凋亡抑制基因Bcl-2的蛋白表達(dá)。

綜上所述，Oct4或可成為分離或鑒定肺癌干細(xì)胞的重要腫瘤標(biāo)志物，Oct4及凋亡抑制基因Bcl-2或成為肺癌新的治療靶點。ITE作為人內(nèi)源性小分子物質(zhì)，可顯著抑制H446富集干細(xì)胞活力，并下調(diào)Oct4和Bcl-2的蛋白表達(dá)，有望成為肺癌治療的新型靶向藥物。