萬 濤 姚汝鋮 鄭 軍

(三峽大學 第一臨床醫(yī)學院[宜昌市中心人民醫(yī)院] 肝膽脾胰外科 & 三峽大學 肝膽胰外科研究所， 湖北 宜昌 443003)

肝癌是一種高度惡性的消化系統(tǒng)腫瘤，該腫瘤發(fā)病率較高，且中晚期肝癌預后普遍較差，而大多數肝癌患者又對傳統(tǒng)化療藥物敏感度低[1]。順鉑(cisplatin，CDDP)是一種肝癌臨床化療較為常見的基礎藥物，但該藥副作用大，耐藥性也較明顯。因此，有關CDDP與其他藥物聯(lián)合應用來降低肝癌患者對化療藥物的抵抗作用、減少CDDP用量以及降低不良反應已經成為目前肝癌研究中的熱點。Rho激酶(Rho kinase)是一種絲氨酸或蘇氨酸激酶，其主要調控細胞生物功能以及維持心肌細胞存活[2]。近年來有研究者發(fā)現該酶也參與了腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉移，當應用Rho激酶抑制劑Y-27632降低該酶的表達水平后，能夠有效阻斷Rho信號的傳導通路，降低細胞骨架中的蛋白收縮，從而有效抑制肝癌細胞的生長以及遷移[3]。然而Y-27632與常用化療藥物聯(lián)用是否增強肝癌細胞的化療敏感性尚未見報道。

本研究擬以肝癌HepG2細胞株為研究對象，分別觀察Y-27632、CDDP以及兩藥聯(lián)用對HepG2細胞增殖的影響，為Y-27632在肝癌治療中的應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

肝癌HepG2細胞株購買于中國上海生科院；ScienCell 1640細胞培養(yǎng)基、噻唑蘭(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)、二甲基亞砜(dimethyl sulphoxide，DMSO)購自北京裕恒豐科技有限公司；胎牛血清購買于深圳市瑞沃德生命科技有限公司；Y-27632購買于上海恒斐生物科技有限公司；CDDP購買于江蘇豪森有限公司；ZF-288全自動化凝膠成像分析系統(tǒng)購買于上海金鵬分析儀器有限公司；SpectraMax iD5多功能微孔板讀板機購買于美谷分子儀器(上海)有限公司；BD全系列分析、分選流式細胞儀購買于北京北嘉美儀生物科技有限公司；PI購于北京凱瑞基生物科技有限公司；Annexin V-FITC/PI細胞凋亡試劑盒購于上海銳賽生物技術有限公司；P53、Bcl-2、Bax、β-Actin引物由上海信帆生物科技有限公司合成。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

復蘇后的肝癌HepG2細胞采用包含10%胎牛血清ScienCell 1640細胞培養(yǎng)液于37℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，0.25%的胰酶消化并傳代，取對數生長期細胞進行該實驗。

1.2.2 細胞增殖抑制試驗

按照5×103個/孔接種96孔培養(yǎng)板(總體積100 μL)。分組如下：①Y-27632組，按50、25、12.5、6.25、3.125 μmol/L濃度梯度給藥；②CDDP組，分別按2、1、0.5、0.25、0.125 μg/mL濃度給藥；③聯(lián)合用藥組，取對細胞生長影響最小的Y-27632濃度與CDDP濃度為2、1、0.25、0.5和0.125 μg/mL進行組合。每組均設置3個復孔，同時設置調零孔(只含培養(yǎng)液，不包含細胞)和對照組(含細胞及培養(yǎng)液)，當藥物單用與聯(lián)合用藥作用24 h后，每孔再加入110 μL無血清培養(yǎng)液及MTT 25 μL，持續(xù)培養(yǎng)5 h，去除上清液，每孔加入200 μL的DMSO，搖床振蕩使晶體充分溶解。采用酶聯(lián)免疫檢測儀測定波長490 nm處的吸光度值(optical density，OD)，每組實驗重復3次后取其平均值。細胞增殖抑制率計算公式：增殖抑制率(%)=(1-實驗組孔OD/對照組孔OD)×100%。

藥物協(xié)同效應使用金正均的Q值計算法[4]：Q=E(A+B)/[EA+EB-EA×EB]，當計算的Q值>1.15時表明兩藥具有協(xié)同效應；當計算的Q值<0.85時代表兩藥互為拮抗；當計算的Q值位于0.85～1.15時，則表明兩藥為疊加作用。本公式中E(A+B)代表的是兩藥聯(lián)用對細胞的抑制率，EA及EB則代表的是兩種藥物單獨應用對細胞的抑制率。

1.2.3 流式細胞儀檢測細胞凋亡

選取協(xié)同作用最強，即Q值最大的一組Y-27632、順鉑進行細胞凋亡率檢測。首先制備密度為1×106/mL的懸浮細胞液，然后再接種于6孔板中培養(yǎng)24 h，每組離心后棄上清液，每孔加入195 μL的Annexin V-FITC結合液，重懸細胞后再加入PI 15 μL，混勻后立即檢測HepG2細胞的凋亡率。結果分析：早期發(fā)生凋亡的HepG2細胞位于右下象限；晚期才凋亡的HepG2細胞則位于右上象限；壞死細胞位于左上象限；正常的活HepG2細胞不被染色則位于左下象限。

1.2.4 Western Blot

提取各實驗組蛋白并定量后，取100 μg細胞蛋白樣品上樣，進行電泳及轉膜。5%脫脂牛奶的PBST室溫封閉1 h。一抗4℃孵育過夜。PBST反復清洗4次，每次5 min。二抗室溫孵育1 h。PBST洗4次，每次5 min。后加入ECL底物進行反應，5 min后暗室顯影，內參為β-Actin。

1.2.5 RT-PCR

培養(yǎng)48 h后收集HepG2細胞，采用Trizol法提取樣品中的總RNA，測定適量的樣品濃度、純度，并逆轉錄成cDNA，于-80℃冰箱中妥善保存。取cDNA反應的原液2 μL，焦磷酸二乙酯水39 μL，dNTP 1 μL，10×PCR buffer 5 μL，上下游引物各1 μL(具體引物序列見表1)，Taq聚合酶1 μL，總體積為50 μL。PCR的作用條件：94℃預變性4 min，58℃(P53)35 s、55℃(Bax)35 s、60℃(Bcl-2)35 s，總計30個循環(huán)，72℃延伸6 min。PCR擴增的產物使用電泳分離，以β-Actin作為內參，使用凝膠成像系統(tǒng)分析后得到目的基因以及β-Actin的灰度值，測得比值為目的基因的相對表達量。

表1 PCR擴增引物序列及退火溫度

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 MTT法測定肝癌細胞的增殖抑制率

不同濃度的Y-27632(3.125、6.25、12.5、25、50 μmol/L)和CDDP(0.125、0.25、0.5、1、2 μg/mL)作用于肝癌HepG2細胞，均產生較明顯的體外抑制作用，其抑制率呈劑量-時間依賴關系(P<0.05)(見圖1)。

圖1 Y-27632和CDDP對HepG2細胞的增殖抑制作用

2.2 Y-27632與CDDP聯(lián)用對肝癌細胞增殖的影響

選取對肝癌HepG2細胞影響較小的Y-27632藥物濃度3.125 μmol/L(抑制率<10%)，與CDDP聯(lián)用，對肝癌細胞的抑制率均明顯高于單獨用藥組(均P<0.05)。并且聯(lián)合兩種藥物時，Q值>1.15(見表2)。

表2 Y-27632與CDDP聯(lián)用對肝癌細胞的抑制率

2.3 Y-27632與CDDP聯(lián)用對肝癌細胞凋亡的影響

選取Q值最大的聯(lián)合用藥組，即Y-27632和CDDP濃度分別為3.125 μmol/L和0.5 μg/mL，采用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。單用Y-27632對肝癌HepG2細胞的凋亡影響不明顯(1.55±0.44)%，CDDP可明顯促進HepG2細胞凋亡(17.3±1.32)%；兩藥聯(lián)用時，凋亡更明顯(21.25±1.50)%，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)(見圖2)。

圖2 流式細胞儀檢測Y-27632與CDDP聯(lián)用對HepG2凋亡的影響

2.4 Y-27632與CDDP聯(lián)用對肝癌細胞Bax、P53、Bcl-2蛋白表達的影響

與對照組相比，Y-27632對Bcl-2的表達影響較小，但是能夠明顯增加P53和Bax的表達；CDDP能夠增加P53和Bax的表達，降低Bcl-2的表達；Y-27632與CDDP聯(lián)用后，P53和Bax上調、Bcl-2下調的效應更加明顯(見圖3)。

圖3 Y-27632和CDDP聯(lián)用對P53、Bax及Bcl-2蛋白表達的影響

2.5 Y-27632與CDDP聯(lián)用對肝癌細胞P53、Bax、Bcl-2 mRNA表達的影響

培養(yǎng)48 h后，各組肝癌HepG2細胞P53、Bax、Bcl-2 mRNA的相對表達量見表3。與對照組相比，其余三組P53和Bax mRNA均上調，Bcl-2 mRNA下調，聯(lián)合用藥組較單獨用藥組效應更明顯(均P<0.05)。

表3 各組肝癌細胞Bax、P53、Bcl-2 mRNA比較

3 討論

肝癌由于惡性程度高，早期易轉移，切除后易復發(fā)等因素，導致其死亡人數逐年遞增[5]。故抑制腫瘤的生長，防止腫瘤轉移，提升患者遠期預后成為亟需解決的臨床問題。從肝癌治療方面來看，由過去的手術+傳統(tǒng)化療藥物的治療方法轉變成手術+分子靶向藥物+傳統(tǒng)化療藥物的綜合治療策略[6]。惡性腫瘤的靶向治療已然成為近年來臨床治療方案中新的突破口。而選擇一個精準的分子靶點，成為諸多惡性腫瘤安全而有效治療的關鍵。

Rho激酶是近些年來廣泛認可的一種與腫瘤關系密切的分子靶點。研究表明，Rho激酶主要通過磷酸化作用于下游靶分子，從而引起細胞周期的改變，并且能夠明顯促進惡性腫瘤細胞粘附、遷移及浸潤[7]。Jeong等[8]發(fā)現，Rho激酶在卵巢癌細胞中高表達，當應用Rho激酶抑制劑Y-27632抑制該酶的表達后，腫瘤細胞凋亡率升高的同時卵巢癌細胞的遷移能力也明顯下降。本研究使用Y-27632處理肝癌HepG2細胞后發(fā)現，HepG2細胞的增殖明顯受到抑制，且呈劑量-時間依賴關系。該結果與Takeba等[9]使用Y-27632顯著抑制腫瘤細胞增殖、侵襲和轉移的結果相吻合。CDDP在臨床中常被用于惡性腫瘤的化療，但該化療藥具有嚴重的全身毒副作用，并且對于大部分惡性腫瘤不敏感。有文獻報道Rho激酶在肝癌中的表達明顯高于正常肝組織，當敲低Rho激酶的表達后，肝癌細胞的生長被顯著抑制，而凋亡的發(fā)生率卻明顯升高，同時還能增加肝癌對CDDP治療的敏感性[10，11]。本研究結果顯示，當使用Y-27632聯(lián)合CDDP處理肝癌HepG2細胞后，協(xié)同效應Q值均大于1.15，這表明兩藥聯(lián)用可產生協(xié)同效果。另外，還發(fā)現Y-27632單獨用藥效果并不明顯，但兩種藥物聯(lián)合處理誘導HepG2細胞凋亡的能力明顯增強。這表明Y-27632和CDDP聯(lián)用可通過促進腫瘤細胞凋亡和抑制其增殖發(fā)揮協(xié)同抗肝癌的作用。提示Rho激酶靶點抑制劑Y-27632和CDDP聯(lián)合使用時，能夠有效地提高肝癌對化療藥物的敏感性，降低化療抵抗，提升治療效果。

細胞凋亡是細胞的程序性死亡，而大多數惡性腫瘤對化療藥物耐藥的關鍵原因是其對凋亡的抵抗，調控凋亡信號通路是提高腫瘤治療水平的關鍵。P53和Bcl-2均是調控惡性腫瘤細胞凋亡過程中的關鍵蛋白。P53主要通過Bax/Bcl-2信號蛋白發(fā)揮腫瘤細胞凋亡的調控作用。P53除了促進細胞凋亡，也是細胞周期檢查點蛋白，與DNA損傷后修復密切相關。研究表明，Rho激酶抑制劑Y-27632通過促進P53和Bax蛋白的表達，抑制Bcl-2蛋白的表達來誘導乳腺癌MCF-7細胞凋亡，抑制其增殖，從而發(fā)揮體內抗乳腺癌作用[12]。Bax、Bcl-2則可通過線粒體上的相關離子通道，與細胞色素C(cytochrome C，Cyt C)相互作用，調控Cyt C從細胞內的釋放，從而調控細胞凋亡[13]。有研究發(fā)現，在腫瘤細胞中Rho激酶功能的發(fā)揮主要通過調控P53、Bax及Bcl-2表達而實現[9,14]。本研究結果顯示，Y-27632與CDDP聯(lián)用可誘導P53、Bax表達含量顯著增加，而Bcl-2的表達含量明顯降低。

綜上所述，Rho激酶抑制劑Y-27632能夠安全且高效的抑制肝癌HepG2細胞的增殖，當與CDDP聯(lián)合用藥時，不僅增殖抑制效果更加顯著，還能促進凋亡，且具有協(xié)同效應，該作用機理與P53上調Bax、下調Bcl-2有關。因此，Rho激酶抑制劑Y-27632能夠顯著提高肝癌HepG2細胞株對CDDP的化療敏感性。