聶 勇 王 超 吳江鋒 張德華 黃品信 楊興國 曹 君 張 宇 石文仲

(1. 宜昌市夷陵醫(yī)院 泌尿外科， 湖北 宜昌 443100； 2. 三峽大學 醫(yī)學院， 湖北 宜昌 443002)

隨著我國人均壽命的不斷增長與生活水平的逐步提高，男性前列腺癌的發(fā)病率出現快速上升。目前前列腺癌的診斷主要依據病史、直腸指診、前列腺特異性抗原(prostate specific antigen，PSA)檢測、經直腸超聲檢查、磁共振檢查等，確診主要依靠前列腺穿刺活檢或病理學檢查。隨著研究的深入，臨床單一檢測PSA常發(fā)生不必要的誤診及漏診，檢測結果容易受到其他疾病或檢查的影響，特別是對PSA值在4～10 ng/mL的灰區(qū)患者，診斷結果缺乏特異性[1]。前列腺穿刺活檢為創(chuàng)傷性檢查，可能并發(fā)感染、出血、腫瘤種植及迷走神經反射等并發(fā)癥[2]。隨著分子生物學、基因技術的發(fā)展，前列腺癌診斷的新型標志物不斷涌現，多種標志物聯(lián)合應用可以有效提高前列腺癌早期診斷的特異度和敏感度。早期前列腺癌抗原-2(early prostate cancer antigen-2，EPCA-2)是一種與前列腺癌相關的核基質蛋白，有研究表明它能較病理切片提前5年或更早時間準確地診斷出前列腺癌，提示其可作為前列腺癌篩查的腫瘤標記物[3]。而前列腺癌抗原3(prostate cancer atigen 3，PCA3)，是前列腺癌特異性基因，在前列腺癌組織中呈高表達，在正常前列腺中表達水平較低，在其他正常組織、血液或其他腫瘤標本中不表達[4]。為提高PSA灰區(qū)前列腺癌患者的早期診斷率，本研究擬探討聯(lián)合檢測血清EPCA-2與尿液中PCA3對早期診斷PSA灰區(qū)前列腺癌的應用價值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

收集我院2016年2月～2020年10月收治的PSA灰區(qū)男性患者180例，包括前列腺癌組46例和前列腺良性增生組134例。納入標準：依據中國前列腺癌診療指南，診斷金標準為前列腺穿刺活檢[2]，所有患者均經直腸穿刺活檢病理確診。排除標準：①檢測前1周內行導尿、前列腺按摩、直腸指診、經尿道器械檢查操作；②1個月內有前列腺穿刺、3個月內有急慢性前列腺炎病史者；③有尿潴留、前列腺手術史及口服5α-還原酶抑制劑等藥物；④有其他腫瘤患者；⑤血清PSA不在4～10 ng/mL者。同時選取健康體檢者120例作為正常對照組。本研究經我院倫理委員會批準，患者均簽署書面知情同意書。倫理批準號：KY2016-01-2802。

1.2 主要儀器和試劑

1.2.1 主要儀器

美國Biorad公司生產酶標儀(型號為BR550)、杭州安譽科技有限公司生產AGS實時熒光PCR儀、廣州景頤光電科技有限公司產微量分光光度計721、瑞士羅氏公司生產電化學發(fā)光分析儀。

1.2.2 主要試劑

EPCA-2酶聯(lián)免疫試劑盒由上海研吉生物科技有限公司生產；PCA3檢測試劑盒購自蘇州為真生物醫(yī)藥科技有限公司。

1.3 血清PSA的檢測

采集患者外周靜脈血5 mL，分離出血清，冷凍保存?zhèn)溆?。采用化學發(fā)光免疫染色法，按照PSA檢測試劑盒(瑞士羅氏公司生產)說明書檢測患者血清PSA含量。

1.4 血清EPCA-2的檢測

所有患者入院第2 d清晨空腹采血，收集血清標本。所用的試管無熱原和內毒素等，避免任何實驗操作過程中對細胞的刺激。血液采集后，3 000 rpm/min離心分離血清，標本如果無法立即檢測可先于-20℃冰箱保存。采用 EPCA-2酶聯(lián)免疫試劑盒檢測三組患者血清EPCA-2水平，實驗操作嚴格按照說明書進行。利用酶標儀在450 nm波長下測定OD值，采用標準曲線計算樣品中EPCA-2的濃度，繪制ROC曲線獲得閾值、敏感度及特異度。

1.5 尿液PCA3的檢測

囑患者排出晨尿后，適量飲水，當有明顯尿意時，進行前列腺按摩并收集尿液標本。具體方法為傳統(tǒng)前列腺按摩法：患者取截石位，檢查者對其作直腸指診，當觸及前列腺后，分別從左、右兩側葉對稱性地向中央溝方向用力按摩 3～4次，再從前列腺底部向尖部按摩中央溝 3～4 次，然后囑患者排尿。采用高壓滅菌后的Rnase-free試管收集初始段尿液30 mL，3 000 rpm/min離心10 min，收集尿沉渣，加等量冷D-hanks液洗滌2次，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

RNA的抽提：根據試劑盒說明書提取總RNA，微量分光光度計測RNA的含量及A260/A280比值。根據逆轉錄試劑盒說明書合成cDNA，采用RT-PCR半定量法檢測尿液PCA3的表達。PCA3引物序列為：上游引物TGGGAAGGACCTGATG ATACA，下游引物CCCAGGGATCTCTGTGCTT。擴增產物經凝膠電泳鑒定，以PCA3陽性表達為判斷標準。

1.6 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 前列腺癌組、前列腺良性增生組和正常對照組基線資料

表1為三組的基本臨床資料。三組年齡差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。三組間血清PSA有統(tǒng)計學差異(P<0.05)，前列腺癌組PSA高于正常對照組(P<0.05)。

表1 前列腺癌組、前列腺良性增生組和正常對照組基線資料比較

2.2 EPCA-2單獨鑒別前列腺癌和前列腺增生的診斷價值

與正常對照組相比，前列腺癌組與前列腺良性增生組EPCA-2均增高，且均有統(tǒng)計學差異(均P<0.05)，見表1。繪制前列腺癌組與前列腺良性增生組血清EPCA-2的ROC曲線，以18.57 ng/mL為EPCA-2的閾值，其單獨鑒別前列腺癌和前列腺增生特異度為79.50%，敏感度為67.70%，見圖1。

圖1 前列腺癌組與前列腺增生組血清EPCA-2的ROC曲線

2.3 PCA3單獨鑒別前列腺癌和前列腺增生的診斷價值

PCA3在前列腺癌組中可見陽性表達29例，17例為陰性；前列腺良性增生組可見陽性表達8例，陰性126例；PCA3在前列腺癌組陽性表達較高，在前列腺良性增生組中有少量陽性表達，正常對照組均無陽性表達，三組間陽性表達差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。PCA3單獨鑒別前列腺癌和前列腺增生的敏感度和特異度分別為63.04%和94.03%，見表2。

表2 前列腺癌組、前列腺良性增生組PCA3表達情況

2.4 EPCA-2、PCA3對PSA灰區(qū)前列腺癌協(xié)同診斷的效能分析

EPCA-2并聯(lián)PCA3對PSA灰區(qū)前列腺癌協(xié)同診斷，其敏感度為76.08%，特異度為85.82%，見表3。提示聯(lián)合檢測可用于PSA灰區(qū)前列腺癌與良性前列腺增生的鑒別診斷。

表3 EPCA-2、PCA3對PSA灰區(qū)前列腺癌協(xié)同診斷的效能分析

3 討論

前列腺癌是男性泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤[5-7]，近年來在我國發(fā)病率亦呈現快速增長趨勢[8-10]。目前PSA仍是臨床上用于篩查前列腺癌的主要檢測指標。它是由前列腺腺泡和導管上皮細胞分泌的一種單鏈糖蛋白，具有組織特異性[1]。前列腺癌患者的血清PSA可有不同程度升高，但在各種前列腺炎、前列腺良性病變、急性尿潴留以及前列腺組織損傷性操作時也可出現PSA的反應性增高，使得PSA檢測的特異性受到影響[10-14]。特別是在4～10 ng/mL(灰區(qū))時，PSA缺乏足夠的特異度和靈敏度，即便采用PSA相關衍生指標如游離型PSA、結合型PSA、PSA速率、PSA密度等仍可能漏診，而此類患者前列腺穿刺活檢的陽性率僅20%左右，重復穿刺或者篩查可能造成過度醫(yī)療，加重患者痛苦及經濟負擔，也不能從根本上解決PSA本身特異性低等問題[1]。因此，尋找有效的腫瘤標志物一直是泌尿外科研究的熱點。

近幾年，多種新型前列腺癌的診斷標志物不斷涌現，采用多種標志物聯(lián)合檢測可能是腫瘤診斷和早期篩查的趨勢，能夠提高前列腺癌的早期診斷率。EPCA-2是EPCA的亞型，是與前列腺癌相關的核基質蛋白之一[15]。研究發(fā)現，EPCA-2具有組織細胞特異性及腫瘤相關性，可以用于早期診斷前列腺癌。若以EPCA-2>30 ng/mL為前列腺癌的判定標準，總體上約94%的前列腺癌患者可以通過EPCA-2檢測出來[16]。提示EPCA-2可以作為前列腺癌篩查的腫瘤標記物之一。

相較于血清PSA，PCA3為前列腺癌所特有，其水平不受前列腺疾病、前列腺或尿道侵入性操作等影響，可以作為比較可靠的前列腺癌的診斷標志物。PCA3在前列腺癌中表達明顯增高，并可在多種體液，如血液、尿液、精液和前列腺液中檢出[17-20]。Merola等[21]發(fā)現，與tPSA及f/t PSA相比，PCA3診斷前列腺癌的準確性更高，且PCA3評分與活檢陽性率呈正相關。有學者研究發(fā)現，對于判斷首次前列腺穿刺活檢陰性，但血清PSA仍升高者是否需再次活檢時，PCA3檢測能發(fā)揮一定的作用[22]。當PSA處于灰區(qū)時，尿PCA-3可幫助減少不必要的穿刺活檢，提高PSA灰區(qū)前列腺癌的診斷陽性率[23]。

目前聯(lián)合檢測EPCA-2與PCA3用于PSA灰區(qū)前列腺癌診斷的研究較少[24]。本研究發(fā)現，前列腺癌組EPCA-2的含量較高，而前列腺增生組及正常對照組均偏低；以18.57 ng/mL為EPCA-2的閾值，其單獨鑒別前列腺癌和前列腺增生特異度為79.50%，敏感度為67.70%；尿液PCA3在前列腺癌組中可見陽性表達29例，前列腺良性增生組8例，正常對照組均無陽性表達。說明尿液PCA3可鑒別出早期前列腺癌患者，但單一指標存在一定局限性，可能引起漏診[25]。據此我們推測，聯(lián)合檢測EPCA-2及PCA3可以發(fā)揮協(xié)同診斷作用，結果表明EPCA-2并聯(lián)PCA3對PSA灰區(qū)前列腺癌協(xié)同診斷，其敏感度為76.08%，特異度為85.82%。本研究說明EPCA-2和PCA3聯(lián)合檢測可用于PSA灰區(qū)前列腺癌與前列腺增生癥的早期篩查，提高診斷率，避免不必要的前列腺穿刺活檢。本研究由于受入組病例數的限制，研究結論仍有待于大樣本、多中心的研究進一步驗證。