馬萍蘋，鄢 莉，張佳蘭*

（1.長江大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025；2.長江大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025）

米曲霉（Aspergillus oryzae）屬于曲霉屬[1-2]，主要存在于發(fā)酵食品、糧食、土壤以及腐敗的有機物中，是美國食品與藥品管理局和美國飼料公司協(xié)會發(fā)布的安全菌種之一[3-4]。米曲霉是一類可以產(chǎn)復(fù)合酶的菌種[5-7]，菌絲一般由多細(xì)胞組成，能夠產(chǎn)生豐富的蛋白酶系，包括堿性蛋白酶，中性蛋白酶和酸性蛋白酶，中性蛋白酶能耐受較高的溫度[8]。由于液態(tài)深層發(fā)酵具有生長周期短、成本低、傳質(zhì)傳熱性良好、各種生化反應(yīng)更為均勻的特點[9-10]，而且霉菌在液態(tài)培養(yǎng)基中一般長勢良好，產(chǎn)酶的效率較高[11-13]，明顯高于固態(tài)發(fā)酵[14-16]。因此，霉菌生產(chǎn)蛋白酶主要采用液態(tài)深層發(fā)酵的方法[17-18]。

香菇（Lentinula edodes）既富含蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂肪酸、維生素、膳食纖維以及礦物質(zhì)等營養(yǎng)成分又含有多糖等多種活性成分，屬于食藥兩用菌[19-21]。目前，我國由香菇資源開發(fā)的產(chǎn)品還不是很多，其中大部分被作為食材，在歐洲地區(qū)及日本等發(fā)達(dá)國家，香菇除作食材外，主要用于肽類藥物以及功能食品和食品添加劑[22]。香菇殘次品和加工中的下腳料作為發(fā)酵原料制作酒精[23]、葡萄酒[24]、飲料[25-26]和調(diào)味品[27]等，但是，其利用率還不高，產(chǎn)品的種類偏少且附加值高的產(chǎn)品不多[28]。對香菇殘次品進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵，提高蛋白酶酶活以提高其利用率[29-30]，但蛋白酶活受菌種以及發(fā)酵條件的影響[30-32]。

本研究以香菇殘次品及其加工中的下腳料為主要原料，以米曲霉（Aspergillus oryzae）為菌種，采用液態(tài)發(fā)酵，以蛋白酶活為響應(yīng)值，通過單因素試驗及響應(yīng)面試驗優(yōu)化米曲霉產(chǎn)蛋白酶的發(fā)酵條件，以期利用香菇殘次品生產(chǎn)蛋白酶提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料與菌株

香菇殘次品及其加工中的下腳料：荊州市欣愷生物科技有限公司；米曲霉（Aspergillus oryzae）：長江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院保藏。

1.1.2 試劑

葡萄糖、蔗糖、硝酸鉀、硫酸銨、氯化鈉、硫酸鎂、磷酸氫二鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、鹽酸、干酪素、氫氧化鈉、茚三酮、醋酸、醋酸鈉、三氯乙酸（均為分析純）：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；L-酪氨酸、L-丙氨酸（純度均為99%）：上海麥克林生化科技有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

酪蛋白培養(yǎng)基[33]：干酪素4 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，KH2PO40.3 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.001 g/L，NaCl 1 g，ZnCl20.015 g/L，CaCl2·2H2O 0.005 g/L，瓊脂20 g，蒸餾水溶解定容1 000 mL，pH 6.5～7.0。121 ℃滅菌25 min。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potatodextroseagar，PDA）培養(yǎng)基[34]：馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂20 g/L，蒸餾水1 000 mL。121 ℃滅菌25 min。

香菇液體培養(yǎng)基：將香菇殘次品加入6～12倍的蒸餾水，用高速勻漿機打成漿。121 ℃滅菌25 min。

1.2 儀器與設(shè)備

DL-5-C高速冷凍離心機：上海予皓科學(xué)儀器有限公司；ET-2010KA立式雙門回旋搖床：金壇市億通電子有限公司；UV-1800紫外分光光度計：日本島津（SHIMADIU）公司；HH-4恒溫水浴鍋：上海藍(lán)凱儀器儀表有限公司；BS-IE電熱恒溫振蕩培養(yǎng)箱：上海精宏實驗設(shè)備有限公司；HVE-50立體式高壓滅菌鍋：上海三申醫(yī)療器械有限公司；SPX-250B-Z生化恒溫培養(yǎng)箱：上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；FSH-2高速勻漿機：常州億通分析儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化

將米曲霉接種到酪蛋白培養(yǎng)基中，30 ℃恒溫靜置培養(yǎng)72 h，觀察透明圈直徑大小，挑出直徑較大的菌落，接種到PDA斜面上，30 ℃恒溫靜置培養(yǎng)72 h。轉(zhuǎn)接3次，得到蛋白酶活力較高的菌株，4 ℃條件保藏，備用。

1.3.2 孢子懸液的制備

吸取20 mL無菌水加入到米曲霉斜面試管上，用接種環(huán)將試管斜面上的孢子輕輕刮下，倒入帶有4層擦鏡紙的滅菌漏斗中過濾，然后將過濾的米曲霉菌液倒入盛有小玻璃珠50 mL的滅菌三角瓶中，重復(fù)3次，于30 ℃，150 r/min條件下振蕩15 min，將孢子充分打散，得到米曲霉單孢子懸液。

1.3.3 米曲霉產(chǎn)蛋白酶發(fā)酵條件優(yōu)化

單因素試驗：將單孢子懸液按1%（V/V）接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，30 ℃恒溫發(fā)酵，考察發(fā)酵時間（1 d、2 d、3 d、4 d、5 d）、料液比（1∶6、1∶8、1∶10、1∶12（g∶mL））、初始pH值（5.5、6.5、7.5、8.5、9.5）、轉(zhuǎn)速（135 r/min、155 r/min、175 r/min、195 r/min、215 r/min）對蛋白酶活力的影響。

響應(yīng)面試驗：在單因素試驗的基礎(chǔ)上，固定發(fā)酵時間3 d，以米曲霉蛋白酶活力（Y）為響應(yīng)值，選取對結(jié)果影響較大的初始pH值（A）、料液比（B）和轉(zhuǎn)速（C）作為影響因素，進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面試驗，因素與水平見表1。

表1 發(fā)酵條件優(yōu)化Box-Behnken試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments for fermentation conditions optimization

1.3.4 分析檢測

蛋白酶活力的測定采用商業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SB/T 10317—1999《蛋白酶活力測定法》中的福林法[36]；氨基酸含量測定采用茚三酮比色法[37]。蛋白酶活力定義：即每1 mL液體酶在40 ℃下，1 min水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸所需酶量，定義為1個蛋白酶活力單位（U/mL）。

1.3.5 統(tǒng)計分析

采用Design-Expert 8.0.6.1軟件進(jìn)行Plackett-Burman試驗和Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計，運用該軟件的數(shù)據(jù)分析功能進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，建立回歸模型，并對建立的模型進(jìn)行驗證，利用Origin 8.5和SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 米曲霉產(chǎn)蛋白酶發(fā)酵條件優(yōu)化單因素試驗

2.1.1 發(fā)酵時間對米曲霉產(chǎn)蛋白酶活力的影響

發(fā)酵時間對蛋白酶活力的影響見圖1。

圖1 發(fā)酵時間對蛋白酶活力的影響Fig.1 Effect of fermentation time on protease activity

由圖1可知，隨著發(fā)酵時間在1～3 d范圍內(nèi)的延長，蛋白酶活力曲線呈上升趨勢；當(dāng)發(fā)酵時間為3 d時，米曲霉蛋白酶活力最高，為541.9 U/mL；當(dāng)發(fā)酵時間＞3 d之后，蛋白酶活力有所下降。分析原因可能是，在發(fā)酵前期（發(fā)酵時間3 d前），隨發(fā)酵時間的延長，米曲霉處于生長旺盛期，產(chǎn)蛋白酶能力增強，因此米曲霉產(chǎn)蛋白酶活力提高。但發(fā)酵后期（發(fā)酵時間3 d后），米曲霉產(chǎn)生的蛋白酶用于降解香菇中蛋白質(zhì)而消耗蛋白酶，因此發(fā)酵后期蛋白酶活力降低。因此，選擇最佳發(fā)酵時間為3 d。

2.1.2 料液比對蛋白酶活力的影響

料液比對蛋白酶活力的影響見圖2。

圖2 料液比對蛋白酶活力的影響Fig.2 Effect of solid and liquid ratio on protease activity

由圖2可知，料液比為1∶6、1∶8、1∶10（g∶mL）時，隨著液體占比的增加，發(fā)酵液中蛋白酶活力呈現(xiàn)增加的趨勢；料液比為1∶10（g∶mL）時，培養(yǎng)基質(zhì)中蛋白酶活力值最高；當(dāng)液體占比繼續(xù)增加，蛋白酶活力下降。水分是微生物生長和代謝很重要的影響因素，水分過低時，不能把香菇中的營養(yǎng)成分充分溶解，不利于米曲霉的生長和代謝產(chǎn)酶。水分過高時，溶液形成水層，不利于氧的傳遞，影響米曲霉的生長代謝，導(dǎo)致蛋白酶產(chǎn)量較少[38]。因此，選擇最佳料液比為1∶10（g∶mL）。

2.1.3 初始pH值對蛋白酶活力的影響

初始pH值對蛋白酶活力的影響見圖3。

圖3 初始pH值對蛋白酶活力的影響Fig.3 Effect of initial pH value on protease activity

由圖3可知，在不同的初始pH值下，米曲霉產(chǎn)蛋白酶的活力不同。隨著培養(yǎng)基初始pH值在5.0～6.5范圍內(nèi)的增加，蛋白酶活力增加；初始pH值為6.5時蛋白酶活力最高，初始pH值為6.5～11.0時，隨著初始pH值增加，蛋白酶活力逐漸降低。這說明米曲霉在偏堿性環(huán)境中對米曲霉產(chǎn)蛋白酶有一定的抑制作用[39]。因此，選擇最佳初始pH值為6.5。

2.1.4 轉(zhuǎn)速對蛋白酶活力的影響

轉(zhuǎn)速對蛋白酶活力的影響見圖4。

由圖4可知，隨著轉(zhuǎn)速在135～175 r/min范圍內(nèi)的增加，蛋白酶活力呈快速增加的趨勢；當(dāng)轉(zhuǎn)速為175 r/min時，蛋白酶活力值達(dá)到最大，為405.16 U/mL；當(dāng)轉(zhuǎn)速為175～215 r/min時，蛋白酶活力下降?？赡苁且驗檗D(zhuǎn)速在135～175 r/min，發(fā)酵液溶氧量增加，有利于米曲霉的生長[40]，導(dǎo)致米曲霉產(chǎn)蛋白酶酶活增加；而培養(yǎng)轉(zhuǎn)速過高，發(fā)酵液流動剪切力不斷增強，導(dǎo)致菌絲體結(jié)構(gòu)結(jié)實緊密，不利于米曲霉的生長和代謝[41]，導(dǎo)致米曲霉產(chǎn)蛋白酶酶活力降低。因此，選擇最佳轉(zhuǎn)速175 r/min。

圖4 轉(zhuǎn)速對蛋白酶活力的影響Fig.4 Effect of rotating speed on protease activity

2.2 米曲霉產(chǎn)蛋白酶發(fā)酵條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗

在單因素試驗基礎(chǔ)上，以初始pH值（A）、料液比（B）、轉(zhuǎn)速（C）為響應(yīng)因子，以蛋白酶活（Y）為響應(yīng)值進(jìn)行評價，采用3因素3水平響應(yīng)面試驗優(yōu)化米曲霉產(chǎn)蛋白酶發(fā)酵條件，Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果見表2，二次回歸模型方差分析見表3。

表2 發(fā)酵條件優(yōu)化Box-Behnken試驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 Design and results of Box-Behnken experiments for fermentation conditions optimization

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

通過Design Expert 8.0.6軟件對表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項回歸擬合，獲得蛋白酶酶活力與初始pH值、料液比和轉(zhuǎn)速的二次多項式回歸方程：

Y=1 183.03+5.31A+56.21B-14.14C-22.55AB+31.87AC-109.80BC-123.36A2-172.55B2-190.36C2

由表3可知，模型P＜0.000 1，表明該模型高度顯著；失擬項P=0.454 6＞0.05，表明失擬項不顯著，該模型的擬合度良好。除一次項A對米曲霉產(chǎn)蛋白酶活力的影響不顯著（P＞0.05）外，一次項C和交互項AB對米曲霉產(chǎn)蛋白酶活力的影響顯著（P＜0.05），一次項B、交互項AC、BC以及二次項A2、B2、C2對米曲霉產(chǎn)蛋白酶活力影響極顯著（P＜0.01）?；貧w方程決定系數(shù)R2=0.965 6，調(diào)整決定系數(shù)=0.990 2，表明此回歸模型能夠解釋96.56%的響應(yīng)變化。說明該模型擬合程度良好，試驗誤差小，可信度較高，可用此模型對米曲霉產(chǎn)蛋白酶活發(fā)酵條件進(jìn)行預(yù)測。同時，確定影響米曲霉產(chǎn)蛋白酶活3因素順序為B＞C＞A，即料液比＞轉(zhuǎn)速＞初始pH值。

2.3 響應(yīng)面各因素交互作用分析

各因素交互作用對米曲霉產(chǎn)蛋白酶活影響的響應(yīng)面及等高線見圖5。

圖5 各因素交互作用對米曲霉產(chǎn)蛋白酶酶活影響的響應(yīng)面及等高線Fig.5 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factor on activity of protease produced by Aspergillus oryzae

若響應(yīng)面較陡峭，說明該因素對蛋白酶酶活的影響較大；若響應(yīng)面相對平緩，說明該因素對蛋白酶酶活的影響較小。由圖5可知，料液比與初始pH值之間交互作用的響應(yīng)面陡峭，對響應(yīng)值影響顯著；轉(zhuǎn)速與初始pH值之間交互作用的響應(yīng)面陡峭，對響應(yīng)值影響極顯著；料液比與轉(zhuǎn)速之間交互作用的響應(yīng)面最陡峭，對響應(yīng)值影響極顯著。這與回歸模型方差分析結(jié)果一致。

2.4 驗證試驗

采用Design Expert 8.0.6.1軟件對回歸方程進(jìn)行求解，最終確定米曲霉產(chǎn)蛋白酶活的最優(yōu)發(fā)酵條件為初始pH值6.5，料液比1∶10（g∶mL），轉(zhuǎn)速175 r/min，該條件下蛋白酶酶活力預(yù)測值為1 183.04 U/mL。為了驗證模擬模型的準(zhǔn)確性，采用優(yōu)化后的最佳發(fā)酵條件進(jìn)行3次驗證試驗，檢測的蛋白酶活力的實際平均值為1 182.48 U/mL，與預(yù)測值相近，說明該工藝可行。

3 結(jié)論

本研究以米曲霉（Aspergillus oryzae）為菌種，對香菇殘次品進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵，在單因素試驗基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken試驗方法優(yōu)化米曲霉產(chǎn)蛋白酶活發(fā)酵條件。結(jié)果表明，米曲霉液態(tài)發(fā)酵香菇殘次品產(chǎn)蛋白酶活最優(yōu)條件為發(fā)酵時間3 d，發(fā)酵初始pH值6.5，料液比1∶10（g∶mL），轉(zhuǎn)速175 r/min。在此優(yōu)化條件下，蛋白酶活力實際值為1 182.48 U/mL。采用該方法優(yōu)化米曲霉產(chǎn)蛋白酶活的發(fā)酵條件，能夠提高其產(chǎn)蛋白酶的酶活力，為香菇殘次品的綜合利用提供了一定的理論依據(jù)。