段 錦 丁 軻,* 余祖華 李 旺 李元曉 何萬領(lǐng) 曹平華 趙龍妹 賈艷艷 王玉琴 劉 寧

(1.河南科技大學(xué)宏翔生物飼料實驗室，洛陽 471000；2.河南省動物疫病與公共衛(wèi)生重點實驗室，洛陽 471000；3.河南省肉羊繁育工程技術(shù)研究中心，洛陽 471000)

霉菌毒素種類繁多，已發(fā)現(xiàn)報道的有300多種，玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEN)作為其中污染范圍最廣、毒性作用最大的霉菌毒素之一，已成為當(dāng)下研究和監(jiān)管的重點[1]。ZEN廣泛存在于各類谷物飼料中，并且能夠在食物鏈中積累，對人和動物健康造成巨大危害。ZEN具有類雌激素作用，與機體內(nèi)源性雌激素雌二醇具有相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)，可以與雌激素競爭性結(jié)合雌激素受體，表現(xiàn)出一定的生殖毒性，引發(fā)人和動物機體的生殖系統(tǒng)障礙，例如高雌激素綜合征、假孕、流產(chǎn)以及子宮萎縮等[2-4]。此外ZEN的細(xì)胞毒性、免疫毒性以及致癌性也被廣泛證實并報道[5-8]。近幾年，我國的ZEN污染狀況十分嚴(yán)重。Shao等[9]利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)技術(shù)對我國商用干犬食品中的霉菌毒素進行了檢測，其中ZEN的污染率在87.5%以上。在黑龍江、廣西與重慶等地各類原料和飼料樣品中常見霉菌毒素含量的檢測統(tǒng)計中發(fā)現(xiàn)，ZEN的超標(biāo)率較往年呈明顯上升趨勢，其中在玉米副產(chǎn)品及寵物飼糧中ZEN的檢出率均達到100%[10]。由ZEN污染造成的動物生長緩慢、產(chǎn)品品質(zhì)不良等已經(jīng)成為飼料和食品安全中一個重大的農(nóng)業(yè)和醫(yī)療問題，解決ZEN污染迫在眉睫。

目前，清除ZEN的方法主要包括物理、化學(xué)和微生物降解法。物理降解法主要是利用吸附、輻射和高溫等原理對ZEN進行處理，化學(xué)降解法主要是通過堿處理和氧化處理來降解ZEN毒素[11-12]。以上2種方法雖然都可以去除樣品中一定水平的ZEN毒素，但往往存在耗費成本高、二次污染、改變飼料營養(yǎng)成分和感官質(zhì)量等弊端。生物降解法因其反應(yīng)條件溫和、降解效率高以及降解產(chǎn)物安全無毒等優(yōu)點，成為當(dāng)下人們研究的熱點。金博文等[13]以環(huán)戊酮作為唯一碳源，從動物糞便中篩選了具有高效ZEN降解能力的多食鞘氨醇桿菌(Sphingobacteriummultivorum)，該菌株能在48 h內(nèi)降解培養(yǎng)基中83%的ZEN。此外，酵母菌屬、鏈霉菌屬以及紅球菌屬的一些菌株均被證實具有ZEN降解能力[14-16]。目前，人們研究的熱點更多地集中于益生菌對ZEN的降解。大量研究表明，益生類芽孢桿菌種屬微生物具有高效的ZEN解毒能力，當(dāng)它們作為生物添加劑用于動物生產(chǎn)中時，能夠提升動物的生長效率，改善動物產(chǎn)品品質(zhì)[17]。Wang等[18]篩選了1株能在24 h內(nèi)將培養(yǎng)基中的ZEN(10 μg/mL)完全降解的蠟樣芽胞桿菌(Bacilluscereus)，并且該菌株可以顯著緩解ZEN中毒引起的小鼠生殖系統(tǒng)障礙和肝臟毒性，增加腸道中乳酸菌的豐富度，維護小鼠腸道菌群健康；Wang等[19]從土壤樣品中分離出1株貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)，37 ℃培養(yǎng)3 d后，能夠?qū)?.45 μg/mL的ZEN完全降解，此外該菌株對小鼠的腎臟損傷有一定的緩解作用；Wang等[20]從雞大腸內(nèi)容物中分離了1株賴氨酸芽孢桿菌(Bacilluslysine)，該菌株可在短時間內(nèi)將培養(yǎng)基中的ZEN(32 μg/mL)完全還原為無毒的次級代謝產(chǎn)物。

Bacillus megaterium：巨大芽孢桿菌；Serratia marcescens：粘質(zhì)沙雷氏菌；Bacillus safensis：安全芽孢桿菌；Bacillus subtilis：枯草芽孢桿菌；Bacillus amyloliquefaciens：解淀粉芽孢桿菌；strain：菌株。

本試驗從霉菌毒素污染嚴(yán)重的養(yǎng)殖場中采集了青貯飼料、發(fā)霉玉米、發(fā)酵玉米漿、土壤和動物糞便等樣品，以ZEN為唯一碳源，以降解率為指標(biāo)篩選樣品中能有效降解ZEN的微生物，初步研究毒素降解機制，并優(yōu)化菌株降解條件，評價菌株安全性，期望為生物降解ZEN提供良好的選擇。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及材料

試驗動物為8周齡BALB/c小鼠，體重為27～30 g，購自河南科技大學(xué)試驗?zāi)翀?。樣品包括青貯飼料、發(fā)酵玉米漿、發(fā)霉玉米、羊糞便和土壤，均采自洛陽市周邊養(yǎng)殖場。

1.2 主要試劑

ZEN標(biāo)準(zhǔn)品，甲醇(分析純)，TIANGEN細(xì)菌基因組提取試劑盒，TIANGEN超薄瓊脂糖凝膠DNA膠回收試劑盒，ZEN酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測試劑盒(北京華安麥科生物技術(shù)有限公司)。

1.3 培養(yǎng)基

初篩培養(yǎng)基：KH2PO41.52 g，Na2HPO42.44 g，(NH4)2SO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，CaCl20.05 g，pH調(diào)至7.0，蒸餾水1 L，121 ℃滅菌30 min。

LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨1 g，酵母提取物0.5 g，氯化鈉1 g，蒸餾水100 mL，pH調(diào)至7.0，121 ℃滅菌30 min。

LB固體培養(yǎng)基：在上述LB液體培養(yǎng)基配方基礎(chǔ)上加入瓊脂粉2 g，pH調(diào)至7.0，121 ℃滅菌30 min。

1.4 儀器與設(shè)備

LDZX-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌鍋，Genesy 96T型PCR擴增儀，湘儀H1650-W高速離心機，DNP-9272BS型電熱恒溫培養(yǎng)箱，SULUN SKY-2102型恒溫培養(yǎng)搖床，Thermo Muultiskan-FC型酶標(biāo)儀，AOE UV1200型紫外可見分光光度計，BOXUN HHS-21-4型電熱恒溫水浴鍋，Tanon凝膠成像系統(tǒng)。

1.5 菌株篩選

1.5.1 ZEN降解菌株的初篩

對采集的樣品進行編號，分別稱取5 g處理后的樣品加入到含有100 mL無菌生理鹽水的錐形瓶中，于37 ℃、180 r/min恒溫?fù)u床中振蕩富集4 h。取稀釋液1 mL加入到含有ZEN(2 μg/mL)的4 mL液體初篩培養(yǎng)基中，于37 ℃、180 r/min恒溫?fù)u床中振蕩培養(yǎng)3 d，每個處理做3個重復(fù)，以此方法連續(xù)轉(zhuǎn)接5次。培養(yǎng)結(jié)束將上述處理各取1 mL培養(yǎng)液進行梯度稀釋涂布于LB固體培養(yǎng)基中，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h，挑取單菌落劃線接種于LB固體培養(yǎng)基上，以此方法純化3次，純化后的菌株于4 ℃保存。

1.5.2 ZEN降解菌株的復(fù)篩

將初篩得到的菌株在LB固體培養(yǎng)基中進行活化，挑取單菌落接種于4 mL LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃、180 r/min恒溫?fù)u床中振蕩培養(yǎng)16 h。取40 μL培養(yǎng)液接種于含有ZEN(10 μg/mL)的4 mL LB液體培養(yǎng)基中，以不接菌的含有ZEN(10 μg/mL)的LB液體培養(yǎng)基為空白對照，于37 ℃、180 r/min恒溫?fù)u床中振蕩培養(yǎng)48 h。根據(jù)玉米赤霉烯酮ELISA檢測試劑盒說明書，對菌株培養(yǎng)液進行處理，用酶標(biāo)儀檢測培養(yǎng)液中ZEN的殘留量，計算菌株降解效率。

菌株降解效率(%)=100×(對照組
ZEN含量-試驗組ZEN含量)/
對照組ZEN含量。

1.6 ZEN降解菌株的鑒定

1.6.1 菌落及細(xì)菌形態(tài)學(xué)鑒定

將篩選的ZEN降解菌劃線接種于LB固體培養(yǎng)基上，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)，挑取單菌落，對菌體進行革蘭氏染色，光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)。

1.6.2 菌株16S rRNA鑒定

1.7 菌株對ZEN吸附降解情況研究

將活化后的ZEN降解菌接種于LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min過夜培養(yǎng)，培養(yǎng)后的菌液等體積分成2份。其中一份置于4 ℃冰箱中保存待用，另一份在高壓蒸汽滅菌鍋中121 ℃滅菌處理20 min。將上述各組菌液于6 000 r/min條件下離心10 min，棄掉上清，用無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗菌體沉淀2次，再用含有ZEN(10 μg/mL)的等量無菌PBS重新懸浮菌體，以含有ZEN(10 μg/mL)的等量無菌PBS為空白對照，于37 ℃、180 r/min恒溫?fù)u床中振蕩培養(yǎng)48 h，每個樣品設(shè)置3個重復(fù)。培養(yǎng)結(jié)束后，取5 mL培養(yǎng)液于12 000 r/min條件下離心10 min，保留上清待用，甲醇浸提菌體沉淀30 min，用ELISA檢測試劑盒分別檢測上清和沉淀中ZEN含量。

1.8 菌株降解ZEN的活性成分定位

將ZEN降解菌接種于LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，菌株培養(yǎng)液于4 ℃、6 000 r/min條件下離心20 min，上清液過0.22 μm水系濾膜，4 ℃保存?zhèn)溆?。菌體沉淀用無菌PBS清洗2次，再用無菌PBS重懸沉淀，利用手持超聲細(xì)胞破碎儀破碎菌體，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，上清液過0.22 μm水系濾膜，獲得細(xì)胞內(nèi)容物。經(jīng)上述處理后，向無細(xì)胞上清液和細(xì)胞內(nèi)容物中加入一定量的ZEN(10 μg/mL)，以含有相同濃度ZEN(10 μg/mL)的無菌PBS作為空白對照，于37 ℃、180 r/min恒溫?fù)u床中振蕩培養(yǎng)48 h，用ELISA檢測試劑盒檢測各組中ZEN的殘留量。

在上述試驗基礎(chǔ)上，將發(fā)揮主要降解作用的部分做如下處理：1)加蛋白酶K(65 ℃，水浴2 h)；2)加蛋白酶K和1%十二烷基硫酸鈉(SDS)(65 ℃，水浴2 h)；3)熱處理(100 ℃水浴2 h)。將上述各組與ZEN(10 μg/mL)共培養(yǎng)，每個樣品做3個重復(fù)，于37 ℃、180 r/min恒溫?fù)u床中振蕩培養(yǎng)48 h，ELISA試劑盒檢測各組中ZEN殘留量。

1.9 培養(yǎng)條件對菌株ZEN降解效率的影響

研究不同培養(yǎng)條件對菌株ZEN降解效率的影響，分別設(shè)置如下培養(yǎng)條件：接種量(2%、4%、6%、8%、10%)；溫度(22、27、32、37、42 ℃)；初始pH(4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0)；培養(yǎng)時間(0、2、4、6、8、10、12、14、16 h)。每個樣品設(shè)置3個重復(fù)，ELISA試劑盒檢測ZEN含量變化。

1.10 動物試驗

將60只雌性BALB/c小鼠進行分籠飼養(yǎng)，保持室溫22～25 ℃，相對濕度45%～60%條件下適應(yīng)7 d，晝夜明暗交替。將小鼠隨機分為6組，每組10只，對6組小鼠進行不同處理，試驗分組見表1。每天按表中分組處理方式定時灌胃，連續(xù)灌胃15 d。第15天灌胃結(jié)束后，小鼠禁食12 h。第16天對小鼠進行處理，通過眼球采血法收集小鼠血液，4 ℃、5 000 r/min條件下離心10 min，收集血清保存于-20 ℃。斷頸處死所有小鼠，解剖收集小鼠臟器，包括肝臟、腎臟、胸腺、脾臟和子宮卵巢，稱重。計算臟器指數(shù)：

表1 試驗分組Table 1 Groups of experiment

臟器指數(shù)(%)=100×臟器重量/小鼠活重。

保存的血清用于小鼠血液生化指標(biāo)的檢測，包括血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)活性及總蛋白(TP)和尿酸(UA)含量等，檢測方法參照各指標(biāo)對應(yīng)的試劑盒說明書。

1.11 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”形式表示，采用SPSS 17.0軟件進行單因素方差分析，P<0.05表示差異顯著。部分?jǐn)?shù)據(jù)使用Origin 2019軟件進行處理與圖形繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米赤霉烯酮降解菌株的篩選

從采集的飼料、土壤和動物糞便等樣品中分離得到了156株菌株用于ZEN降解菌的初篩。以含有ZEN(2 μg/mL)的初篩培養(yǎng)基對156株菌株進行分離培養(yǎng)，得到生長穩(wěn)定、狀況良好的菌株9株，其中1株來源于土壤樣品編號為MRS-T6，2株來源于糞便樣品編號分別為YPD-F1和YPD-F4，2株來源于青貯飼料編號分別為MLS-H1和MLS-H32，4株來源于發(fā)酵玉米漿樣品編號分別為NA-J6、NA-J21、MLS-J8、MLS-J11。將初篩得到的9個菌株與含有ZEN(10 μg/mL)的培養(yǎng)基共培養(yǎng)48 h后，檢測菌株ZEN降解效率，由圖1可知，菌株NA-J21和菌株MLS-H32的ZEN降解效率相對較高，分別為71.3%和61.5%，因此選取這2株菌進一步研究。

其中：Δe13為微分算子，由微分旋轉(zhuǎn)矩陣減去單位陣得來；δθ13x、δθ13y、δθ13z分別表示定位器1的z方向主動移動副與理想x，y，z軸的角度誤差。δP表示托架中心點相對于基坐標(biāo)系的位置誤差，δP=(δxp,δyp,δzp)T；δl13表示定位器1的z方向位置度誤差，δl21、δl23、δl33、δl43定義類似；表示定位器i對應(yīng)的球鉸中心相對于托架坐標(biāo)系原點的位置誤差，表示托架坐標(biāo)系相對于基坐標(biāo)系旋轉(zhuǎn)矩陣的微分,

圖1 不同菌株ZEN降解效率Fig.1 ZEN degradation rate of different strains

2.2 ZEN降解菌株的鑒定

2.2.1 菌落和細(xì)菌形態(tài)學(xué)鑒定

由圖2可知，菌株NA-J21菌落為圓形，邊緣不規(guī)則，有隆起，呈乳白色，光學(xué)顯微鏡下革蘭染色陽性，菌體呈短桿狀，有芽孢；菌株MLS-H32菌落呈鋸齒狀，表面粗糙不透明，邊緣不整齊，呈乳白色，干燥皺褶，光學(xué)顯微鏡下革蘭氏染色陽性，菌體呈桿狀，有芽孢。

圖2 菌株NA-J21和MLS-H32菌落形態(tài)(a、c)及革蘭氏染色(b、d)Fig.2 Colony morphology(a，c)and Gram stain(b，d)of NA-J21 and MLS-H32 strains(1 000×)

2.2.2 菌株的16S rRNA鑒定

PCR擴增菌株基因序列，瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果可見清晰目的條帶，2株菌的基因序列長度均約為1 450 bp。將測序結(jié)果在NCBI中經(jīng)BLAST對比，利用MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖3所示，菌株NA-J21與解淀粉芽孢桿菌的16S rRNA序列相似度達到99%以上，因此鑒定為解淀粉芽孢桿菌；菌株MLS-H32與枯草芽孢桿菌的16S rRNA序列的相似性最高，達到99%以上，因此鑒定為枯草芽孢桿菌。

2.3 菌株降解特性的研究

由圖4可知，菌株NA-J21和MLS-H32活細(xì)胞反應(yīng)體系的ZEN降解效率均明顯高于滅活細(xì)胞體系，說明菌株NA-J21與MLS-H32對ZEN的解毒能力主要是由于菌株的降解作用，同時細(xì)菌細(xì)胞壁對ZEN有一定吸附作用。此外，滅活細(xì)胞菌體對ZEN的清除率均高于活細(xì)胞菌體，分析原因可能是由于加熱過程中，熱處理使菌體細(xì)胞壁的肽聚糖和多聚糖的肽鍵或者糖苷鍵斷裂，細(xì)胞壁的肽聚糖結(jié)構(gòu)變薄、孔徑增大，導(dǎo)致菌體的ZEN吸附效率增加。

進一步研究菌株不同活性成分的ZEN降解情況，由圖5可知，菌株NA-J21和MLS-H32無細(xì)胞上清液對ZEN降解效率均明顯高于細(xì)胞內(nèi)容物，說明2種微生物發(fā)揮ZEN降解能力的活性物質(zhì)主要存在于胞外。對菌株無細(xì)胞上清液進行不同處理，37 ℃培養(yǎng)48 h后，菌株NA-J21和MLS-H32無細(xì)胞上清液的ZEN降解效率分別為68.2%和60.3%；經(jīng)蛋白酶K處理后，菌株ZEN降解效率有明顯下降；加蛋白酶K和SDS共同處理后，菌株ZEN降解效率分別下降至5.5%和2.6%；100 ℃水浴2 h處理后，菌株降解效率有明顯降低。以上結(jié)果說明，2株菌發(fā)揮主要ZEN降解作用的胞外活性物質(zhì)是細(xì)胞分泌的胞外酶。此外，菌株NA-J21可能對高溫具有一定的耐受性。

活細(xì)胞：viable cell；滅活細(xì)胞：inactivated cell；活細(xì)胞菌體：viable cell bacteria；滅活細(xì)胞菌體：inactivated cell bacteria。

2.4 培養(yǎng)條件對菌株ZEN降解效率的影響

2.4.1 接種量對菌株ZEN降解效率的影響

由圖6可知，37 ℃培養(yǎng)48 h，接種量在1.0%～2.0%時，菌株NA-J21的ZEN降解效率隨著接種量增加逐漸增大，最大達到71.7%，接種量大于2.0%時，ZEN降解效率有所降低。當(dāng)菌株接種量在1.0%～2.5%時，菌株MLS-H32的ZEN降解效率與接種量呈正相關(guān)，降解效率最大達到62.1%，之后隨著接種量增大，降解效率有所下降。當(dāng)菌株達到最佳接種量后，隨著接種量增大，細(xì)菌無法充分利用培養(yǎng)基中的能量來滿足自身生長，導(dǎo)致菌株ZEN降解效率有所降低。因此，菌株NA-J21和MLS-H32最佳接種量分別為2.0%和2.5%。

圖6 接種量對ZEN降解效率的影響Fig.6 Effects of inoculation amount on ZEN degradation rate

無細(xì)胞上清：acellular supernatant；細(xì)胞內(nèi)容物：cellular contents。

2.4.2 初始pH對菌株ZEN降解效率的影響

由圖7可知，在最佳接種量下，37 ℃培養(yǎng)48 h，培養(yǎng)基不同初始pH對菌株的ZEN降解效率影響較大。在pH為4.0～7.0，隨著pH的增大，菌株降解效率隨之增大。當(dāng)pH為7.0時，菌株NA-J21和MLS-H32對的ZEN降解效率達到最大，其中菌株NA-J21為69.1%，菌株MLS-H32為61.2%，pH大于7.0時，菌株降解效率也有所下降。因此，培養(yǎng)基初始pH為7.0時，菌株NA-J21和MLS-H32能夠發(fā)揮最大ZEN降解效率。

圖7 pH對ZEN降解效率的影響Fig.7 Effects of pH on ZEN degradation rate

2.4.3 溫度對菌株ZEN降解效率的影響

由圖8可知，在最佳接種量和初始pH 7.0條件下培養(yǎng)48 h，溫度對于菌株ZEN降解效率的影響較大。菌株NA-J21在37 ℃培養(yǎng)條件，能夠發(fā)揮最大ZEN降解效率，為71.6%；

圖8 溫度對ZEN降解效率的影響Fig.8 Effects of temperature on ZEN degradation rate

菌株MLS-H32在32 ℃的培養(yǎng)條件下能夠發(fā)揮最大降解效率，為62.7%；隨著最適培養(yǎng)溫度的改變，菌株的ZEN降解效率有所下降，分析原因可能是由于不同培養(yǎng)溫度一定程度上抑制了細(xì)菌的生長，使得細(xì)菌產(chǎn)酶能力下降，降解ZEN的酶活性降低。

2.4.4 培養(yǎng)時間與菌株ZEN降解效率的關(guān)系

設(shè)置培養(yǎng)基初始pH為7.0，由圖9可知，37 ℃條件下，隨著培養(yǎng)時間增長，菌株NA-J21活菌數(shù)逐漸增大，ZEN降解效率隨之升高，在12 h時達到71.5%，12 h之后趨于穩(wěn)定，此時菌株NA-J21活菌數(shù)為7.6×109CFU/mL；32 ℃條件下，隨著培養(yǎng)時間增長，菌株MLS-H32活菌數(shù)逐漸增大，ZEN降解效率隨之升高，在14 h時達到62.5%，14 h之后趨于穩(wěn)定，此時菌株MLS-H32活菌數(shù)為9.2×109CFU/mL。

圖9 培養(yǎng)時間對ZEN降解效率的影響Fig.9 Effects of culture time on ZEN degradation rate

2.5 動物試驗結(jié)果

由表2可知，菌株NA-J21和MLS-H32培養(yǎng)液灌胃小鼠15 d后，對照組和試驗組相比，各臟器指數(shù)無顯著差異(P>0.05)，表明菌株NA-J21和MLS-H32不會對小鼠臟器造成損傷。試驗組與對照組相比，肝臟、腎臟和子宮卵巢指數(shù)顯著增大(P<0.05)，脾臟和胸腺指數(shù)顯著下降(P<0.05)，小鼠主要表現(xiàn)胸腺萎縮和子宮腫大，表明ZEN能夠?qū)π∈笈K器造成一定的損傷。對小鼠同時灌胃ZEN和ZEN降解菌，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與ZEN灌胃組相比，小鼠的肝臟、腎臟和子宮卵巢指數(shù)均顯著降低(P<0.05)，脾臟和胸腺指數(shù)均顯著增大(P<0.05)。結(jié)果表明菌株NA-J21和MLS-H32能夠緩解ZEN引起的小鼠臟器損傷，具有一定安全性。

表2 菌株NA-J21和MLS-H32對小鼠臟器指數(shù)的影響Table 2 Effects of NA-J21 and MLS-H32 strains on organ indexes in mince %

由表3可知，與對照組相比，試驗組小鼠血清GPT、GOT活性及尿素(Urea)、UA含量顯著增加(P<0.05)，TP和白蛋白(ALB)含量顯著下降(P<0.05)，表明ZEN處理對小鼠的肝臟、腎臟等功能造成了一定損傷。與對照組相比，試驗組1和3之間差異不顯著(P>0.05)。此外，同時灌胃ZEN和ZEN降解菌的試驗組2、4與試驗組1、3之間顯示出較小的差異。以上結(jié)果表明，菌株NA-J21和MLS-H32能夠緩解ZEN引起的小鼠血清生化指標(biāo)變化，對小鼠受到的ZEN損傷起到一定的保護作用。

表3 菌株NA-J21和MLS-H32對小鼠血清生化指標(biāo)的影響Table 3 Effects of NA-J21 and MLS-H32 strains on serum biochemical indexes in mice

3 討 論

ZEN廣泛存在于各種飼料原料中，主要由鐮刀菌屬菌株產(chǎn)生，是動物飼用產(chǎn)品中毒性作用最大的霉菌毒素之一，能夠引起動物機體的生殖機能障礙和免疫系統(tǒng)損傷等臨床癥狀，使得動物生產(chǎn)效率低下、品質(zhì)不良，對畜牧業(yè)造成了巨大經(jīng)濟損失。近年來，微生物降解ZEN受到廣泛關(guān)注，其中多種益生類芽孢桿菌被證實具有高效的ZEN降解能力。Hsu等[21]研究了1株地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)CK1菌株的ZEN降解能力，發(fā)現(xiàn)該菌株在高溫和酸性條件下對ZEN均能保持65%以上的降解效率，對常見致病菌有一定的抑制效果，并且具有良好的耐酸和耐膽鹽等益生菌活性。本試驗以ZEN為唯一碳源，從ZEN污染嚴(yán)重的發(fā)霉飼料以及發(fā)酵玉米漿中分離篩選了2株ZEN降解菌，分別為解淀粉芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌，37 ℃培養(yǎng)48 h后，菌株對培養(yǎng)基中ZEN的清除率分別達到71.3%和61.5%。

利用解淀粉芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌降解ZEN的研究已有報道，Lee等[22]研究的解淀粉芽孢桿菌LN菌株能在36 h內(nèi)降解培養(yǎng)基中92%的ZEN，安全性評價結(jié)果證實該菌株不產(chǎn)腸毒素，同時具有耐酸、耐膽鹽和抑制病原菌生長等益生菌活性，是作為飼料添加劑降解飼料中ZEN的良好選擇；張晨曦等[23]從糧食樣品中獲得1株解淀粉芽孢桿菌NS2菌株，能在72 h內(nèi)降解96.0%的ZEN(5 μg/mL)，同時可以產(chǎn)生具有抗菌作用的次級代謝產(chǎn)物，抑制大腸桿菌、鼠傷寒沙門菌(Salmonellatyphimurium)等常見致病菌的生長，具有良好的抑菌性；魏單平等[24]從兔糞便中篩選了1株解淀粉芽孢桿菌H6菌株，該菌株在72 h內(nèi)能夠降解95.6%的ZEN(1 μg/mL)；Ju等[25]研究的枯草芽孢桿菌培養(yǎng)48 h后，對ZEN降解效率達到87%。本試驗中篩選的菌株ZEN降解效率稍低于上述芽孢桿菌，可能是由于菌種間的差異造成的，另外培養(yǎng)條件不同也會影響菌株的產(chǎn)酶能力，從而使菌株的降解能力表現(xiàn)出一定差異。

本試驗通過對菌株不同活性部位降解ZEN的研究，初步探明了菌株的ZEN降解機制包括酶降解和細(xì)胞壁吸附2種，其中酶降解發(fā)揮主要降解作用，為提取細(xì)胞胞外酶，制作添加劑用于實際生產(chǎn)中提供了一定理論基礎(chǔ)。動物試驗表明菌株NA-J21和MLS-H32不會對小鼠機體造成危害，對于ZEN中毒引起的小鼠臟器損傷具有一定治療作用。益生菌作為飼料生物添加劑應(yīng)用于畜牧生產(chǎn)中，在降解霉菌毒素的同時還能夠達到改善動物生長水平，維護動物機體健康的目的[26-27]。芽孢桿菌因其來源廣泛、易于生存和篩選、有ZEN降解能力的菌株種類繁多、益生效果好、降解效率普遍較高等優(yōu)點，受到了越來越多的關(guān)注。Hanif等[28]從解淀粉芽孢桿菌FZB42中提取得到了一種脂肽化合物泛革素，該物質(zhì)可以改變細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和通透性，破壞真菌細(xì)胞壁，影響細(xì)胞器作用，抑制DNA的合成，從而有效限制ZEN毒素的產(chǎn)出。此外，枯草芽孢桿菌也常作為感受態(tài)細(xì)胞用于基因克隆中，對ZEN降解酶的重組質(zhì)粒進行表達。Azam等[29]將2種ZEN降解酶構(gòu)建成重組融合酶，該重組酶具有雙重霉菌毒素降解能力，為微生物酶降解在實際生產(chǎn)中的應(yīng)用提供了另一種選擇。解淀粉芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌都是經(jīng)認(rèn)定的安全益生菌[30]，能夠分泌多種蛋白質(zhì)和抗生素，具有良好的霉菌毒素降解能力和抑菌效果。它們還可以通過改善動物腸道健康，提升機體對飼料中營養(yǎng)物質(zhì)的吸收率，從而提高動物生長水平，在降解ZEN毒素酶制劑的開發(fā)和應(yīng)用方面具有良好的前景。

4 結(jié) 論

通過以ZEN為唯一碳源的分離篩選，得到了2株能有效降解ZEN的菌株NA-J21和MLS-H32，經(jīng)鑒定分別為解淀粉芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌。菌株NA-J21和MLS-H32主要通過分泌胞外酶發(fā)揮降解作用，對ZEN的降解效率分別為71.3%和61.5%。菌株NA-J21降解ZEN的最適條件為：接種量2.0%，初始pH 7.0，溫度37 ℃，培養(yǎng)時間為12 h；菌株MLS-H32的最佳ZEN降解條件為：接種量2.5%，初始pH 7.0，溫度32 ℃，培養(yǎng)時間為14 h。菌株NA-J21和MLS-H32對于ZEN引起的小鼠臟器損傷具有一定的保護作用。