馬文鋒 廖家輝 陳曉晨 王占彬 吳秋玨* 焦國寶 陳曉宇

(1.河南科技大學(xué)動物科技學(xué)院，洛陽 471023；2.河南新仰韶生物科技有限公司，三門峽 472400)

益生菌作為一類安全、綠色的微生態(tài)制劑，在維持動物生長與腸道健康方面發(fā)揮重要作用[1-3]。尤其是2010年飼料端禁抗后，益生菌逐漸受到業(yè)界的關(guān)注，因其作為飼用抗生素的替代品之一，具有廣闊的應(yīng)用前景[3-5]。其中，枯草芽孢桿菌是農(nóng)業(yè)農(nóng)村部批準(zhǔn)添加的飼用芽孢桿菌之一，屬于典型的革蘭氏陽性菌，它的菌落形狀呈粗糙狀、無莢膜，最適生長的溫度約為37 ℃[6-7]。在不同的溫度、酸堿條件下，枯草芽孢桿菌的穩(wěn)定性較好，也不易對藥物產(chǎn)生耐藥性[8-10]?？莶菅挎邨U菌進入動物腸道后，可以增殖并消耗大量游離氧，使腸道形成一個利于厭氧有益菌增殖的內(nèi)環(huán)境，抑制好氧致病菌的生長，進而調(diào)節(jié)腸道的微生態(tài)菌群結(jié)構(gòu)[11-13]。枯草芽孢桿菌可以分泌多種生物活性因子，比如蛋白酶和纖維素酶等，從而改善對飼糧營養(yǎng)物質(zhì)的消化利用率[14-16]。產(chǎn)蛋后期蛋雞的產(chǎn)蛋率和蛋品質(zhì)逐漸下降，如何通過營養(yǎng)手段改善蛋雞生產(chǎn)性能已成為了研究熱點。因此，本研究在飼糧中添加一定比例的枯草芽孢桿菌，研究其對產(chǎn)蛋后期蛋雞生產(chǎn)性能、蛋品質(zhì)、腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)及盲腸微生物的影響，為枯草芽孢桿菌在蛋雞產(chǎn)蛋后期的應(yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計與飼養(yǎng)管理

試驗選取60周齡產(chǎn)蛋率相近的海蘭褐蛋雞240只，隨機分為2組(基礎(chǔ)產(chǎn)蛋率分別為89.63%和89.28%)，每組8個重復(fù)，每個重復(fù)15只雞。預(yù)試期10 d，正試期60 d。對照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，試驗組在基礎(chǔ)飼糧中添加0.03%的枯草芽孢桿菌(由河南某生物科技有限公司提供，活菌數(shù)2×106CFU/g)，試驗組枯草芽孢桿菌的添加水平參考本實驗室的前期試驗結(jié)果?；A(chǔ)飼糧為玉米-豆粕型飼糧，營養(yǎng)水平參考NRC(1994)，基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。在試驗期間，蛋雞自由采食、飲水，采用3層階梯式籠養(yǎng)方法，每籠飼養(yǎng)3只雞，通過人工補光和自然光照，設(shè)定每天的光照時間為16 h。每日定時飼喂3次(08:00、14:00、18:30)，確保料槽的飼料均勻，每日18:00人工收蛋。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) %

1.2 生產(chǎn)性能和蛋品質(zhì)測定

以重復(fù)為單位，試驗期間記錄每周采食量、每天產(chǎn)蛋數(shù)和產(chǎn)蛋重，計算總產(chǎn)蛋率、料蛋比、平均日產(chǎn)蛋重和平均日采食量。試驗第60天采集蛋樣，每個重復(fù)隨機抽取10枚，測定平均蛋重、蛋形指數(shù)、哈氏單位、蛋白高度、蛋殼強度和蛋殼厚度等指標(biāo)。所用儀器為游標(biāo)卡尺、蛋品質(zhì)分析儀(QCH，英國)、螺旋測微儀和強度測定儀(In-spec-2200，美國)。

1.3 腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)測定

試驗結(jié)束后，每組隨機選取6只雞，快速解剖后取十二指腸、空腸及回腸中段2 cm，使用4%多聚甲醛進行固定。設(shè)置不同乙醇濃度對腸道樣品脫水，之后使用二甲苯清洗，制作石蠟切片，觀察腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)。通過Case Viewer軟件測量腸絨毛高度(villus height，VH)、隱窩深度(crypt depth，CD)，計算絨毛高度/隱窩深度(VH/CD)。

1.4 盲腸微生物測定

試驗雞屠宰后，迅速收集試驗雞(每組6只)的盲腸食糜，先置于液氮中，后迅速轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱保存。使用D5625-02 DNA檢測試劑盒(Omega Bio-Tek Inc.，美國)提取盲腸食糜的微生物基因組DNA，進行DNA純度和濃度的質(zhì)檢，合格后置于-20 ℃環(huán)境下保存。將目的DNA送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司，測序平臺為Illumina MiSeq。將同源性基因序列聚類為操作分類單元(OTU)，使用QIIME 1.9.0計算微生物的α多樣性(Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)、Chao指數(shù)和Ace指數(shù))。

1.5 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用Excel 2010初步整理后，使用SAS 9.1.3軟件進行t檢驗分析，數(shù)據(jù)以平均值和均值標(biāo)準(zhǔn)誤(SEM)表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 枯草芽孢桿菌對產(chǎn)蛋后期蛋雞生產(chǎn)性能的影響

由表2可知，飼糧添加枯草芽孢桿菌對產(chǎn)蛋后期蛋雞產(chǎn)蛋率、平均日產(chǎn)蛋重、料蛋比和平均日采食量均無顯著影響(P>0.05)。

表2 枯草芽孢桿菌對產(chǎn)蛋后期蛋雞生產(chǎn)性能的影響Table 2 Effects of Bacillus subtilis on performance of laying hens during late laying stage

2.2 枯草芽孢桿菌對產(chǎn)蛋后期蛋雞蛋品質(zhì)的影響

由表3可知，與對照組相比，飼糧添加枯草芽孢桿菌顯著提高產(chǎn)蛋后期蛋雞蛋白高度和哈氏單位(P<0.05)。飼糧添加枯草芽孢桿菌對產(chǎn)蛋后期蛋雞平均蛋重、蛋形指數(shù)、蛋殼強度、蛋殼相對重和蛋黃相對重均無顯著影響(P>0.05)。

表3 枯草芽孢桿菌對產(chǎn)蛋后期蛋雞蛋品質(zhì)的影響Table 3 Effects of Bacillus subtilis on egg quality of laying hens during late laying stage

2.3 枯草芽孢桿菌對產(chǎn)蛋后期蛋雞腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

由表4可知，與對照組相比，飼糧添加枯草芽孢桿菌顯著提高了產(chǎn)蛋后期蛋雞空腸和回腸的絨毛高度(P<0.05)。飼糧添加枯草芽孢桿菌對產(chǎn)蛋后期蛋雞十二指腸、空腸和回腸的隱窩深度和VH/CD均無顯著影響(P>0.05)。

表4 枯草芽孢桿菌對產(chǎn)蛋后期蛋雞腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響Table 4 Effects of Bacillus subtilis on intestinal morphology of laying hens during late laying stage

2.4 枯草芽孢桿菌對產(chǎn)蛋后期蛋雞盲腸微生物多樣性的影響

由表5可知，與對照組相比，飼糧添加枯草芽孢桿菌顯著提高了產(chǎn)蛋后期蛋雞盲腸微生物Chao指數(shù)(P<0.05)。飼糧添加枯草芽孢桿菌對產(chǎn)蛋后期蛋雞微生物Shannon指數(shù)、Simpson和Ace指數(shù)均無顯著影響(P>0.05)。

表5 枯草芽孢桿菌對產(chǎn)蛋后期蛋雞盲腸微生物多樣性的影響蛋雞盲腸內(nèi)容物菌群多樣性Table 5 Effects of Bacillus subtilis on cecal microbial diversity of laying hens during late laying stage

2.5 枯草芽孢桿菌對蛋雞盲腸微生物結(jié)構(gòu)的影響

如圖1所示，通過主坐標(biāo)軸分析(PCoA)，發(fā)現(xiàn)試驗組與對照組微生物結(jié)構(gòu)存在顯著差異(P<0.05)。

圖1 基于OTU水平的PCoAFig.1 PCoA based on OTU level

由圖2可知，在門水平上，主要菌門為厚壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌門(Bacteroidetes)，2組之間無顯著差異(P>0.05)。與對照組相比，試驗組軟壁菌門(Tenericutes)和迷蹤菌門(Elusimicrobia)的相對豐度顯著降低(P<0.05)。

由圖3可知，在屬水平上，主要菌屬為理研菌科RC9腸道群(Rikenellaceae_RC9_gut_group)、未分類毛螺菌科(unclassified Lachnospiraceae)、乳酸桿菌屬(Lactobacillus)及擬桿菌屬(Bacteroides)。與對照組相比，試驗組乳酸桿菌屬的相對豐度顯著降低(P<0.05)，未分類的擬桿菌科(unclassified Bacteroidales)的相對豐度顯著提高(P<0.05)。

3 討 論

關(guān)于枯草芽孢桿菌對蛋雞生產(chǎn)性能和蛋品質(zhì)的影響，不同試驗的結(jié)果并不完全一致。徐海燕等[17]研究結(jié)果表明，飼糧添加5×105CFU/g的枯草芽孢桿菌提高了產(chǎn)蛋后期蛋雞的產(chǎn)蛋率和蛋殼質(zhì)量，降低了料蛋比。Ribeiro等[18]研究結(jié)果表明，飼糧添加8×105CFU/g的枯草芽孢桿菌提高了蛋雞的蛋重和蛋品質(zhì)指標(biāo)，但對產(chǎn)蛋率和料蛋比無顯著影響。王翔宇[19]也研究了飼糧添加1×1010CFU/g枯草芽孢桿菌對60周齡蛋雞生產(chǎn)性能的影響，未發(fā)現(xiàn)生產(chǎn)性能的顯著變化。在本試驗中，基礎(chǔ)飼糧添加了0.03%的枯草芽孢桿菌(2×106CFU/g)時，沒有檢測到產(chǎn)蛋率的變化，但是提高了雞蛋的蛋白高度和哈氏單位，表明飼糧添加枯草芽孢桿菌改善了產(chǎn)蛋后期蛋雞的蛋品質(zhì)。造成以上試驗結(jié)果不同的原因，可能與試驗之間枯草芽孢桿菌的添加劑量或菌種來源不同有關(guān)。

腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)是衡量動物腸道發(fā)育狀態(tài)的重要指標(biāo)之一[20-21]。健康的腸道形態(tài)是營養(yǎng)物質(zhì)高效吸收的基礎(chǔ)，主要包括絨毛高度、隱窩深度和VH/CD等[22-23]。一般來說，絨毛高度反映了腸上皮細(xì)胞的成熟率，其數(shù)值與營養(yǎng)物質(zhì)的吸收效率呈正相關(guān)[24]。腸道隱窩的細(xì)胞則具有向絨毛頂端遷移的能力，隱窩變淺反映了細(xì)胞分化的速度加快，間接表明腸道細(xì)胞更新效率的提高[25]。對于家禽而言，由于消化系統(tǒng)的特殊性，它們的十二指腸較短，營養(yǎng)物質(zhì)的吸收主要集中在空腸和回腸[26]。在本試驗中，飼糧添加枯草芽孢桿菌提高了蛋雞空腸和回腸的絨毛高度，顯示枯草芽孢桿菌的添加有利于改善產(chǎn)蛋后期蛋雞的腸道形態(tài)。

Firmicutes：厚壁菌門；Bacteroidetes：擬桿菌門；Actinobacteria：放線菌門；Tenericutes：軟壁菌門；Proteobacteria：變形菌門；Spirochaetes：螺旋體菌門；Patescibacteria：芽孢桿菌門；Synergistetes：互養(yǎng)菌門；Cyanobacteria：藍藻菌門；Epsilonbacteraeota：ε-變形菌門；Deferribacteres：脫鐵桿菌門；Elusimicrobia：迷蹤菌門；Fusobacteria：梭桿菌門；Verrucomicrobia：疣微菌門；Kiritimatiellaeota：基里氏菌門。

Rikenellaceae_RC9_gut_group：理研菌科RC9腸道群；Lactobacillus：乳酸桿菌屬；unclassified Lachnospiraceae：未分類毛螺菌科；Bacteroides：擬桿菌屬；[Ruminococcus]_torques_group：瘤胃球菌屬扭鏈群；Romboutsia：羅姆布茨菌屬；Blautia：布勞特氏菌屬；Olsenella：奧爾森氏菌屬；Subdoligranulum：罕見小球菌屬；Norank Muribaculaceae：未知的Muribaculaceae；unclassified Bacteroidales：未分類的擬桿菌科；unclassified Rikenellaceae：未分類的瘤胃菌科；Christensenellaceae_R-7_group：克里斯滕森菌科R7群；Turicibacter：桿菌屬；Peptococcus：肽球菌屬。

腸道微生物菌群的多樣性可以發(fā)揮對腸道內(nèi)環(huán)境的調(diào)節(jié)作用[27]。本試驗中，PCoA的結(jié)果表明，飼糧添加枯草芽孢桿菌可以影響蛋雞盲腸的微生物區(qū)系，發(fā)現(xiàn)其優(yōu)勢菌門是厚壁菌門和擬桿菌門，占全部微生物群落的85%以上，這與之前的研究結(jié)果[28-29]一致。在檢測微生物屬水平上的差異時，發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌降低了乳酸桿菌屬的相對豐度，這與一些文獻報道結(jié)果[30-31]不一致。易中華等[30]研究表明，飼糧中添加枯草芽孢桿菌有助于促進肉雞盲腸乳酸菌的生長，競爭性的排斥大腸桿菌等病原菌的增長。乳酸菌屬是蛋雞的有益菌之一，其與腸道健康的關(guān)系密切，可以調(diào)節(jié)腸道的酸堿環(huán)境，同時抑制有害菌的增殖，促進動物的正常生長。Kridtayopas等[31]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧添加枯草芽孢桿菌和益生元可以緩解高密度肉雞腸道菌群失調(diào)的程度，增加腸道內(nèi)芽孢桿菌屬和乳酸菌屬等有益微生物的數(shù)量，同時抑制大腸桿菌的生長。然而，本試驗中，飼糧添加枯草芽孢桿菌抑制了乳酸菌屬微生物的數(shù)量，相關(guān)機制有待于進一步的研究。

4 結(jié) 論

飼糧添加0.03%的枯草芽孢桿菌提高了產(chǎn)蛋后期蛋雞空腸和回腸絨毛高度，改善了蛋品質(zhì)，影響了盲腸微生物組成，但對生產(chǎn)性能無顯著影響。