李雅，魏佳明，李玉瑩，郭志華

隨著社會(huì)節(jié)奏加快和人口老齡化的加劇，心力衰竭在世界范圍造成的威脅日趨嚴(yán)重［1］。擴(kuò)張型心肌?。╠ilated cardiomyopathy，DCM）是心力衰竭形成的主要原因之一［2］。研究顯示，鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶（calcineurin，CaN）與擴(kuò)張型心肌病心力衰竭形成機(jī)制密切相關(guān)［3-4］。CaN受心肌細(xì)胞［Ca2+］i濃度調(diào)節(jié)，而肌漿網(wǎng)鈣泵（sarcoplasmic reticulum Ca2+ATPase 2a，SERCA2a） 作為鈣轉(zhuǎn)運(yùn)的關(guān)鍵酶，可以影響心肌細(xì)胞［Ca2+］i濃度。益心泰為臨床科研方，由黃芪、紅花、丹參、澤瀉、豬苓等藥伍用而成，功在益氣活血利水。前期研究表明，益心泰具有較好的抗心力衰竭作用［5-6］，其能改善氣促、疲倦、乏力、納呆等臨床癥狀，提高生活質(zhì)量，且安全、有效，但其機(jī)制尚待進(jìn)一步明確。中藥復(fù)方有效組分效應(yīng)機(jī)制研究是當(dāng)前一大熱點(diǎn)，有助于揭開復(fù)方有效的神秘面紗，更好地發(fā)揮中醫(yī)藥治療慢性疾病的優(yōu)勢(shì)作用［7］。本研究擬采用兔擴(kuò)張型心肌病心力衰竭模型為研究對(duì)象，觀察益心泰有效組分（effective components of Yixintai，ECYXT）干預(yù)后的兔心肌組織形態(tài)學(xué)，血清心鈉肽（ANP）、腦鈉肽（BNP）水平，左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）、左心室短軸縮短率（LVFS）和E峰與A峰的比值（E/A比值）等心功能情況，心肌細(xì)胞［Ca2+］i濃度，以及心肌組織CaN、SERCA2a mRNA及蛋白表達(dá)水平等的變化，深入研究ECYXT對(duì)兔擴(kuò)張型心肌病心力衰竭模型的作用機(jī)制，為中醫(yī)藥防治擴(kuò)張型心肌病心力衰竭提供思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 2018年1月，選取120只健康新西蘭兔，普通級(jí)，重1.5～2.0 kg。于湖南太平生物科技有限公司購入，動(dòng)物許可證編號(hào)：SCXK（湘）2015-0004，合格證號(hào)：NO.43608300000615，不限制食水，通風(fēng)，室溫約23 ℃，濕度50%～60%，正常光/暗周期，分籠飼養(yǎng)。本研究經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)：LL2018010801）。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 ECYXT：黃芪、丹參、紅花、豬苓、澤瀉等購于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，按照3.0∶1.0∶1.5∶1.0∶1.0進(jìn)行配比，采用系統(tǒng)溶劑法與大孔樹脂吸附法相結(jié)合，對(duì)益心泰復(fù)方中四個(gè)不同極性部位的藥效組分進(jìn)行分離，根據(jù)最佳工藝條件，分離得到ECYXT提取液，冷凍干燥后獲得提取物（含總皂苷372.4 mg/g、總黃酮98.3 mg/g、總多糖445.8 mg/g）；氯沙坦鉀：50 mg/片（杭州默沙東制藥有限公司，H20000371）；丙基硫氧嘧啶：50 mg/片（蘇州東瑞制藥有限公司，H32020795）；烏拉坦（Sigma，94300）；0.9%氯化鈉溶液：500 ml/瓶（四川科倫藥業(yè)股份有限公司，H51021158）。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器 多聚甲醛（Sigma，16005）；蘇木精（Sigma，H9627）；伊紅（Sigma，E4009）；石蠟（河南天孚化工有限公司）；ANP ELISA檢測(cè)試劑盒（江萊生物，貨號(hào)：JL22215）；BNP ELISA檢測(cè)試劑盒（eBioscience，貨號(hào)：XY-1900）；CaN抗體（Abcam，貨 號(hào)：ab3673）；SERCA2a抗 體（Abcam， 貨 號(hào)：ab2861）；GAPDH抗體（Abcam，貨號(hào)：ab181602）；RIPA裂解液（北京索萊寶生物科技有限公司）；甲基磺 酰 氟（Phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）（ 北京索萊寶生物科技有限公司）；BSA蛋白定量試劑盒（北京索萊寶生物科技有限公司）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara，貨號(hào)：RR047A）；Trizol（Invitrogen，貨號(hào)：15596-026）；SYBR Premix EX Taq TM Ⅱ（Takara，貨號(hào)：DRR820A）；超聲心動(dòng)圖機(jī)（西門子公司，貨號(hào)：Sequoia 512）；FV3000激光掃描共聚焦顯微鏡（OLYMPUS公司）；鈣熒光探針Fluo3/AM（碧云天， 貨 號(hào)：S1056）；Pluronic-F127（Sigma， 貨 號(hào)：P2443）；DYY-7C型電泳儀（北京市六一儀器廠）；SYSTEM GelDoc XR+凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司）；iQ5實(shí)時(shí)熒光定量 PCR儀（Bio-Rad公司）。

1.4 動(dòng)物分組及模型制備 參考文獻(xiàn)［5，8］，以阿霉素耳緣靜脈注射+丙基硫氧嘧啶灌胃復(fù)制兔擴(kuò)張型心肌病心力衰竭模型。根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法，將20只實(shí)驗(yàn)兔作正常對(duì)照組，其余100只進(jìn)行造模處理。固定兔于手術(shù)臺(tái)，模型兔予以丙基硫氧嘧啶灌胃，劑量按兔每日進(jìn)食量的0.2%，1次/d；并分別于每周三、周日下午耳緣靜脈注射阿霉素溶液1 mg/kg，濃度為1 mg/ml。正常對(duì)照組予以等次等量的0.9%氯化鈉溶液灌胃及耳緣靜脈注射。連續(xù)造模8周。造模后第1天，行心臟超聲檢測(cè)顯示模型兔LVEF、LVFS、E/A比值較正常對(duì)照組顯著下降，伴有精神萎靡、水腫、抓起反抗下降、心率和呼吸頻率加快、耳溫降低及尿量減少等心力衰竭表現(xiàn)，提示造模成功。造模過程中，模型兔共死亡16只，均死于腹瀉。將造模成功的模型兔按完全隨機(jī)設(shè)計(jì)方法分為心力衰竭模型組（17只）、ECYXT低劑量組（17只）、ECYXT中劑量組（17只）、ECYXT高劑量組（17只）和氯沙坦鉀組（16只）。

1.5 干預(yù)方法 于造模后第1周開始灌胃，根據(jù)成人體表面積換算法，結(jié)合臨床用藥經(jīng)驗(yàn)和既往實(shí)驗(yàn)研究，確定ECYXT低、中、高劑量組濃度分別為2.1 g/kg、4.2 g/kg、8.4 g/kg（相當(dāng)于臨床劑量的2、4、8倍），給藥前予以蒸餾水稀釋后灌胃。氯沙坦鉀組（制成氯沙坦鉀懸液）2.75 mg/kg，正常對(duì)照組與心力衰竭模型組灌服同等容積的蒸餾水。6組灌胃量均為每次10 ml/kg，1次/d，連續(xù)4周。

1.6 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.6.1 一般情況 觀察兔毛色、精神狀態(tài)、心率、呼吸頻率、耳溫、尿量、水腫等一般情況。

1.6.2 血清ANP、BNP水平檢測(cè) 采用ELISA法檢測(cè)血清ANP、BNP水平。麻醉兔，心臟采血，靜置，離心，稀釋，過夜，洗滌。加入待測(cè)血清樣品，反復(fù)孵育，洗滌，最后每孔加入0.05 ml 2M H2SO4，終止反應(yīng)。使用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處的光密度（OD）值并記錄。

1.6.3 心臟超聲檢測(cè) 麻醉滿意后將兔平臥位固定，運(yùn)用西門子Sequoia 512超聲心動(dòng)圖機(jī)，探頭頻率3～8 MHz，取心前區(qū)左心室長軸最大直徑處，M型超聲標(biāo)記室間隔和左心室后壁收縮末與舒張末期心內(nèi)膜位置，隨機(jī)軟件自動(dòng)計(jì)算兔LVEF、LVFS及E/A比值等指標(biāo)，取5個(gè)心動(dòng)周期讀數(shù)平均值。

法國的成人教育有悠久的歷史。法國成人教育的創(chuàng)始人是法國著名哲學(xué)家、政治家和數(shù)學(xué)家孔多塞（Condorcet）。早在1792年4月法國大革命期間，孔多塞作為共和黨人，向憲法事務(wù)委員會(huì)提出永久教育意義上的公共教育。孔多塞認(rèn)為，所有人應(yīng)享有普及、平等和永久教育的權(quán)利，同時(shí)，永久教育也必須被視為每個(gè)公民對(duì)社會(huì)的責(zé)任［1］?？锥嗳慕逃枷氲於朔▏扇私逃幕纠砟钪弧ㄟ^傳遞全面的知識(shí)體系，使成人能夠獲得正規(guī)的教育資格，從而成為專業(yè)人士［2］。

1.6.4 心肌組織形態(tài)學(xué)檢查 4%多聚甲醛固定組織，脫水，透明，浸蠟，包埋，切片（厚4～5 μm），烤片，HE染色，光鏡觀察并采圖。

1.6.5 心肌細(xì)胞［Ca2+］i濃度 采用熒光負(fù)載法測(cè)定。酶解法分離心肌細(xì)胞，2 000 rmp/min離心10 min后，棄上清液，細(xì)胞沉淀重懸于Joklik培養(yǎng)基，并放入培養(yǎng)瓶中，清洗細(xì)胞3次以無菌D'-Hanks液，添加Fluo3/AM（終濃度4 μm）和Pluronic-F127（終濃度0.05%），輕微震蕩孵育45 min，37 ℃，去除負(fù)載液，啟動(dòng)共聚焦掃描顯微鏡，488 nm激光掃描，計(jì)算數(shù)據(jù)公式：［Ca2+］i=Kd〔（R-Rmin）/（Rmax-R）〕（Fmin/f=Fmax），其中Kd為解離常數(shù)，F(xiàn)為樣品的熒光強(qiáng)度值。

1.6.6 心肌組織CaN及SERCA2a蛋白檢測(cè) 采用Western blot法測(cè)定，液氮研磨心肌組織后，加入裂解液并置于冰上20 min使其充分裂解后，在4 ℃和12 000 rmp/min離心15 min后，保留上清液，用BCA法定量蛋白，制備SDS-PAGE濃縮膠與分離膠，上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，配一抗，上一抗（1∶500），上二抗（1∶2 000），顯影成像，利用Quantity-One圖像分析軟件分析各樣品目的條帶的灰度值，以看家基因GAPDH為內(nèi)對(duì)照，計(jì)算CaN及SERCA2a蛋白條帶與GAPDH條帶灰度值之比，并將基礎(chǔ)數(shù)值（正常對(duì)照組）設(shè)置為1進(jìn)行比較，從而得出各組最后結(jié)果。

1.6.7 心肌組織CaN及SERCA2a mRNA檢測(cè) RTPCR法測(cè)定心肌組織CaN及SERCA2a mRNA水平，用TRIzol法提取總RNA，測(cè)OD值，檢驗(yàn)RNA純度和濃度。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA：配置逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系（20 μl），用去離子水1∶3稀釋后貯存于-20 ℃冰箱備用。引物設(shè)計(jì)與合成：CaN：F：5'-ACGGCAGACCCTACAAAG-3'；R：5'-CCCTCAAAGCCTCCATCC-3。SERCA2a：F：5'-T T C C C A C A A G T C C A A G A T-3'；R：5'-TCCTCCACAGCAGCCACCAAT-3'。PCR反應(yīng)體系：配置逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系（20 μl），置于PCR儀中，95 ℃30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，步驟 2～4 循環(huán)40次，72 ℃，10 min。PCR產(chǎn)物長度分別為391 bp（CaN）和204 bp（SERCA2a）。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以（±s）表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.01為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ECYXT對(duì)擴(kuò)張型心肌病心力衰竭兔一般情況的影響 用藥后，觀察到ECYXT各劑量組和氯沙坦鉀組兔毛發(fā)枯槁和發(fā)黃、精神萎靡、水腫、少動(dòng)少氣等情況均有所改善，心率和呼吸頻率較前平穩(wěn)，耳溫、尿量情況好轉(zhuǎn)；且ECYXY中、高劑量組和氯沙坦鉀組改善程度更為明顯，強(qiáng)于ECYXT低劑量組；心力衰竭模型組無好轉(zhuǎn)，并且其中部分實(shí)驗(yàn)兔上述癥狀有所加重。整個(gè)用藥干預(yù)過程中，心力衰竭模型組和ECYXT低劑量組兔各死亡3只（均死于腹瀉），ECYXT中劑量組兔死亡2只（均死于腹瀉），ECYXT高劑量組、氯沙坦鉀組各死亡1只兔（均死于腹瀉），正常對(duì)照組無兔死亡。

2.2 ECYXT對(duì)擴(kuò)張型心肌病心力衰竭兔血清ANP、BNP水平的影響 6組血清ANP、BNP水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。其中，ECYXT各劑量組、氯沙坦鉀組和正常對(duì)照組血清ANP、BNP水平均低于心力衰竭模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；ECYXT中劑量組、ECYXT高劑量組、氯沙坦鉀組、正常對(duì)照組血清ANP、BNP水平均低于ECYXT低劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；ECYXT中劑量組、ECYXT高劑量組、氯沙坦鉀組3組間血清ANP、BNP水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 ECYXT對(duì)擴(kuò)張型心肌病心力衰竭兔血清ANP、BNP水平的影響（±s，ng/ml）Table 1 Effects of effective components of Yixintai on serum ANP and BNP levels in the rabbit model of heart failure induced by dilated cardiomyopathy

表1 ECYXT對(duì)擴(kuò)張型心肌病心力衰竭兔血清ANP、BNP水平的影響（±s，ng/ml）Table 1 Effects of effective components of Yixintai on serum ANP and BNP levels in the rabbit model of heart failure induced by dilated cardiomyopathy

注：ECYXT=益心泰有效組分，ANP=心鈉肽，BNP=腦鈉肽；與心力衰竭模型組比較，aP＜0.01；與ECYXT低劑量組比較，bP＜0.01

組別 只數(shù) ANP BNP心力衰竭模型組 14 155.40±4.16 60.71±1.68 ECYXT低劑量組 14 138.68±3.18a 51.92±1.50a ECYXT中劑量組 15 126.98±3.09ab 49.30±1.93ab ECYXT高劑量組 16 125.03±3.54ab 48.37±1.33ab氯沙坦鉀組 15 124.69±3.26ab 48.25±1.43ab正常對(duì)照組 20 62.19±1.67ab 34.22±0.96ab F值 1 808.587 581.42 P 值 ＜0.001 ＜0.001

2.3 ECYXT對(duì)擴(kuò)張型心肌病心力衰竭兔心臟超聲指標(biāo)的影響 6組LVEF、LVFS和E/A比值比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。其中，ECYXT各劑量組、氯沙坦鉀組和正常對(duì)照組LVEF、LVFS和E/A比值均高于心力衰竭模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；ECYXT中劑量組、ECYXT高劑量組、氯沙坦鉀組、正常對(duì)照組LVEF、LVFS和E/A比值均高于ECYXT低劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；ECYXT中劑量組、ECYXT高劑量組、氯沙坦鉀組LVEF、LVFS和E/A比值比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

表2 ECYXT對(duì)擴(kuò)張型心肌病心力衰竭兔心臟超聲指標(biāo)的影響（±s）Table 2 Effects of effective components of Yixintai on echocardiographic indices in the rabbit model of heart failure induced by dilated cardiomyopathy

表2 ECYXT對(duì)擴(kuò)張型心肌病心力衰竭兔心臟超聲指標(biāo)的影響（±s）Table 2 Effects of effective components of Yixintai on echocardiographic indices in the rabbit model of heart failure induced by dilated cardiomyopathy

注：LVEF=左心室射血分?jǐn)?shù)，LVFS=左心室短軸縮短率，E/A比值=E峰與A峰比值；與心力衰竭模型組比較，aP＜0.01；與ECYXT低劑量組比較，bP＜0.01

組別 只數(shù) LVEF（%） LVFS（%） E/A比值心力衰竭模型組 14 37.26±1.06 24.87±0.71 0.60±0.02 ECYXT 低劑量組 14 49.08±1.36a 29.47±0.82a 0.68±0.02a ECYXT 中劑量組 15 59.93±1.98ab 33.99±0.97ab 1.22±0.03ab ECYXT 高劑量組 16 60.96±1.65ab 34.10±0.97ab 1.23±0.04ab氯沙坦鉀組 15 61.14±1.60ab 34.68±1.26ab 1.24±0.03ab正常對(duì)照組 20 70.08±1.99ab 40.36±0.94ab 1.49±0.04ab F值 744.73 483.21 1 940.07 P 值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.4 ECYXT對(duì)擴(kuò)張型心肌病心力衰竭兔心臟組織形態(tài)學(xué)的影響 心力衰竭模型組心肌細(xì)胞損傷出現(xiàn)水腫、壞死，胞核皺縮，間質(zhì)變寬，少許炎性細(xì)胞浸潤，心肌纖維排列紊亂，部分?jǐn)嗔?。ECYXT各劑量組和氯沙坦鉀組心肌細(xì)胞損傷程度均較心力衰竭模型組有所減輕。ECYXT低劑量組心肌細(xì)胞分布紊亂，間質(zhì)增寬，伴纖維斷裂，少許炎性細(xì)胞浸潤。ECYXT中劑量組心肌纖維排列大致正常，伴少量纖維斷裂，心肌細(xì)胞輕度水腫，間質(zhì)變寬，少許炎性細(xì)胞浸潤。ECYXT高劑量組和氯沙坦鉀組心肌纖維排列正常，未見斷裂及水腫，少許炎性細(xì)胞浸潤。正常對(duì)照組心肌纖維排列正常，無斷裂、水腫，且間質(zhì)無炎性細(xì)胞浸潤，見圖1。

圖1 ECYXT對(duì)擴(kuò)張型心肌病心力衰竭兔心肌組織形態(tài)學(xué)的影響（HE×400）Figure 1 Effect of effective components of Yixintai on pathological changes of the myocardial tissue in the rabbit model of heart failure induced by dilated cardiomyopathy

2.5 ECYXT對(duì)擴(kuò)張型心肌病心力衰竭兔心肌細(xì)胞［Ca2+］i濃度的影響 6組心肌細(xì)胞［Ca2+］i濃度比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。其中，ECYXT各劑量組、氯沙坦鉀組和正常對(duì)照組心肌細(xì)胞［Ca2+］i濃度均低于心力衰竭模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；ECYXT中劑量組、ECYXT高劑量組、氯沙坦鉀組、正常對(duì)照組心肌細(xì)胞［Ca2+］i濃度均低于ECYXT低劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；ECYXT中劑量組、ECYXT高劑量組、氯沙坦鉀組3組間心肌細(xì)胞［Ca2+］i濃度比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表3。

表3 ECYXT對(duì)擴(kuò)張型心肌病心力衰竭兔心肌細(xì)胞［Ca2+］i濃度的影響（±s，nm）Table 3 Effect of effective components of Yixintai on the concentration of［Ca2+］i in myocardial cells of the rabbit model of heart failure induced by dilated cardiomyopathy

表3 ECYXT對(duì)擴(kuò)張型心肌病心力衰竭兔心肌細(xì)胞［Ca2+］i濃度的影響（±s，nm）Table 3 Effect of effective components of Yixintai on the concentration of［Ca2+］i in myocardial cells of the rabbit model of heart failure induced by dilated cardiomyopathy

注：與心力衰竭模型組比較，aP＜0.01；與ECYXT低劑量組比較，bP＜0.01

組別 只數(shù) ［Ca2+］i心力衰竭模型組 14 219.77±6.38 ECYXT低劑量組 14 182.94±5.08a ECYXT中劑量組 15 157.88±3.17ab ECYXT高劑量組 16 156.57±3.61ab氯沙坦鉀組 15 155.08±4.29ab正常對(duì)照組 20 94.94±2.23ab F值 605.78 P值 ＜0.001

2.6 ECYXT對(duì)擴(kuò)張型心肌病心力衰竭兔心肌組織CaN及SERCA2a蛋白表達(dá)水平的影響 6組心肌組織CaN及SERCA2a蛋白表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。其中，ECYXT各劑量組、氯沙坦鉀組和正常對(duì)照組心肌組織CaN蛋白表達(dá)水平低于心力衰竭模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；ECYXT中劑量組、ECYXT高劑量組、氯沙坦鉀組、正常對(duì)照組心肌組織CaN蛋白表達(dá)水平低于ECYXT低劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；ECYXT中劑量組、ECYXT高劑量組、氯沙坦鉀組心肌組織CaN蛋白表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.01）；ECYXT各劑量組、氯沙坦鉀組和正常對(duì)照組心肌組織SERCA2a蛋白表達(dá)水平高于心力衰竭模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；ECYXT中劑量組、ECYXT高劑量組、氯沙坦鉀組、正常對(duì)照組心肌組織SERCA2a蛋白表達(dá)水平均高于ECYXT低劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；ECYXT高劑量組、氯沙坦鉀組、正常對(duì)照組心肌組織SERCA2a蛋白表達(dá)水平均高于ECYXT中劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；ECYXT高劑量組心肌組織SERCA2a蛋白表達(dá)水平與氯沙坦鉀組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖2、表4。

圖2 ECYXT對(duì)擴(kuò)張型心肌病心力衰竭兔心肌組織CaN及SERCA2a蛋白表達(dá)水平的影響Figure 2 Effects of effective components of Yixintai on CaN and SERCA2a protein expression levels of myocardial tissue in the rabbit model of heart failure induced by dilated cardiomyopathy

表4 ECYXT對(duì)擴(kuò)張型心肌病心力衰竭兔心肌組織CaN及SERCA2a蛋白表達(dá)水平的影響（±s）Table 4 Effects of effective components of Yixintai on CaN and SERCA2a protein expression levels in myocardial tissue in the rabbit model of heart failure induced by dilated cardiomyopathy

表4 ECYXT對(duì)擴(kuò)張型心肌病心力衰竭兔心肌組織CaN及SERCA2a蛋白表達(dá)水平的影響（±s）Table 4 Effects of effective components of Yixintai on CaN and SERCA2a protein expression levels in myocardial tissue in the rabbit model of heart failure induced by dilated cardiomyopathy

注：CaN=鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶，SERCA2a=肌漿網(wǎng)鈣泵；與心力衰竭模型組比較，aP＜0.01；與ECYXT低劑量組比較，bP＜0.01；與ECYXT中劑量組比較，cP＜0.01

組別 只數(shù) C a N蛋白 S E R C A 2 a蛋白心力衰竭模型組 1 4 4.2 6±0.2 1 0.1 7±0.0 2 E C Y X T低劑量組 1 4 2.8 8±0.1 8 a 0.2 8±0.0 3 a E C Y X T中劑量組 1 5 2.2 4±0.1 6 ab 0.3 4±0.0 3 ab E C Y X T高劑量組 1 6 2.2 1±0.1 4 ab 0.5 3±0.0 4 abc氯沙坦鉀組 1 5 2.2 0±0.1 0 ab 0.5 4±0.0 5 abc正常對(duì)照組 2 0 1.0 0±0.0 7 ab 1.0 0±0.0 6 abc F值 8 6 3.9 0 8 5 4.1 0 P值 ＜0.0 0 1 ＜0.0 0 1

2.7 ECYXT對(duì)心力衰竭兔心肌組織CaN及SERCA2a mRNA表達(dá)水平的影響 6組心肌組織CaN及SERCA2a mRNA表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。其中，ECYXT各劑量組、氯沙坦鉀組和正常對(duì)照組心肌組織CaN mRNA表達(dá)水平低于心力衰竭模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；ECYXT中劑量組、ECYXT高劑量組、氯沙坦鉀組、正常對(duì)照組心肌組織CaN mRNA表達(dá)水平低于ECYXT低劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；ECYXT中劑量組、ECYXT高劑量組、氯沙坦鉀組心肌組織CaN mRNA表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.01）；ECYXT各劑量組、氯沙坦鉀組和正常對(duì)照組心肌組織SERCA2a mRNA表達(dá)水平高于心力衰竭模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；ECYXT中劑量組、ECYXT高劑量組、氯沙坦鉀組、正常對(duì)照組心肌組織SERCA2a mRNA表達(dá)水平均高于ECYXT低劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；ECYXT高劑量組、氯沙坦鉀組、正常對(duì)照組心肌組織SERCA2a mRNA表達(dá)水平均高于ECYXT中劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；ECYXT高劑量組心肌組織SERCA2a mRNA表達(dá)水平與氯沙坦鉀組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.01），見表5。

表5 ECYXT對(duì)心力衰竭兔心肌組織CaN及SERCA2a mRNA表達(dá)水平的影響（±s）Table 5 Effects of effective components of Yixintai on CaN and SERCA2a mRNA expression levels of myocardial tissue in the rabbit model of heart failure induced by dilated cardiomyopathy

表5 ECYXT對(duì)心力衰竭兔心肌組織CaN及SERCA2a mRNA表達(dá)水平的影響（±s）Table 5 Effects of effective components of Yixintai on CaN and SERCA2a mRNA expression levels of myocardial tissue in the rabbit model of heart failure induced by dilated cardiomyopathy

注：與心力衰竭模型組比較，aP＜0.01；與ECYXT低劑量組比較，bP＜0.01；與ECYXT中劑量組比較，cP＜0.01

組別 只數(shù) CaN mRNA SERCA2a mRNA心力衰竭模型組 14 2.67±0.09 0.27±0.01 ECYXT低劑量組 14 2.58±0.09a 0.36±0.02a ECYXT中劑量組 15 1.68±0.07ab 0.57±0.03ab ECYXT高劑量組 16 1.67±0.08ab 0.69±0.03abc氯沙坦鉀組 15 1.65±0.07ab 0.71±0.03abc正常對(duì)照組 20 1.10±0.06ab 1.06±0.08abc F值 899.65 714.33 P 值 ＜0.001 ＜0.001

3 討論

擴(kuò)張型心肌病是一種病因不明的異質(zhì)性心臟病，目前對(duì)其機(jī)理尚不清楚，是心力衰竭常見的三大原發(fā)病之一。中醫(yī)藥通過整體辨證，治療該類患者療效得到肯定［9-10］，值得深入挖掘。

本研究采用阿霉素耳緣靜脈注射+丙基硫氧嘧啶灌胃制作兔擴(kuò)張型心肌病心力衰竭模型，具備操作簡(jiǎn)便、易于表現(xiàn)疾病特點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)，但實(shí)驗(yàn)過程中兔因腹瀉致死比例較高，對(duì)實(shí)驗(yàn)過程中所有死亡兔進(jìn)行解剖，發(fā)現(xiàn)存在不同程度的胸腔、腹腔積液及肝脾腫大，考慮與阿霉素導(dǎo)致腸炎的不良反應(yīng)相關(guān)。本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，心力衰竭模型組血清ANP、BNP水平升高（P＜0.01），LVEF、LVFS和E/A比值降低（P＜0.01），提示擴(kuò)張型心肌病心力衰竭兔的心功能下降。與心力衰竭模型組比較，ECYXT各劑量組和氯沙坦鉀組血清ANP、BNP水平降低（P＜0.01），LVEF、LVFS和E/A比值升高（P＜0.01），心肌細(xì)胞［Ca2+］i濃度及心肌組織CaN mRNA及蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.01），心肌組織SERCA2a mRNA及蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.01），說明ECYXT能提高心功能，下調(diào)Ca2+濃度，提高心肌組織SERCA2a mRNA及蛋白表達(dá)水平，降低心肌組織CaN mRNA及蛋白表達(dá)水平。且心肌組織形態(tài)學(xué)比較發(fā)現(xiàn)ECYXT各劑量組和氯沙坦鉀組均能不同程度改善心肌細(xì)胞損傷。與ECYXT低劑量組比較，ECYXT中劑量組、ECYXT高劑量組和氯沙坦鉀組血清ANP、BNP水平降低（P＜0.01），LVEF、LVFS和E/A比值升高（P＜0.01），心肌細(xì)胞［Ca2+］i濃度及心肌組織CaN mRNA及蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.01），心肌組織SERCA2a mRNA及蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.01）。表明ECYXT中劑量組和ECYXT高劑量組的療效優(yōu)于ECYXT低劑量組。與ECYXT中劑量組比較，ECYXT高劑量組和氯沙坦鉀組心肌組織SERCA2a mRNA及蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.01），其余指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），說明ECYXT高劑量組調(diào)節(jié)心肌組織SERCA2a mRNA及蛋白的表達(dá)能力優(yōu)于ECYXT低劑量組。ECYXT高劑量組與氯沙坦鉀組比較，各項(xiàng)指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），提示ECYXT高劑量組在對(duì)以上各項(xiàng)指標(biāo)的調(diào)節(jié)上與氯沙坦鉀組具備同等效果。

Ca2+循環(huán)在心肌細(xì)胞的收縮和舒張過程中起著至關(guān)重要的作用，［Ca2+］i濃度升高會(huì)導(dǎo)致舒張期肌肉收縮受損和收縮期延長，與心力衰竭的病理生理密切相關(guān)。肌漿網(wǎng)作為儲(chǔ)存Ca2+的細(xì)胞器，肌漿網(wǎng)功能紊亂導(dǎo)致Ca2+循環(huán)和心肌細(xì)胞功能紊亂。SERCA2a是肌漿網(wǎng)鈣ATP酶（SERCA）在心臟中的主要表達(dá)形式，是心肌細(xì)胞［Ca2+］i濃度的主要決定因素。SERCA2a活性下降是心臟收縮不良、心肌細(xì)胞擴(kuò)大進(jìn)而造成心力衰竭的主要原因之一。正常情況下，興奮-收縮耦聯(lián)啟動(dòng)，當(dāng)心肌細(xì)胞［Ca2+］i處于高濃度時(shí)，SERCA2a被激活，胞質(zhì)內(nèi)Ca2+被泵回內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或通過細(xì)胞膜鈉鈣交換器泵出胞外，心肌細(xì)胞［Ca2+］i濃度下降，恢復(fù)靜息電位。心力衰竭時(shí)，SERCA2a含量下降，不能將胞質(zhì)內(nèi)Ca2+泵回內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或泵出胞外，導(dǎo)致心肌收縮功能下降［11］，心肌細(xì)胞［Ca2+］i濃度升高。因此，增加SERCA2a的活性成為治療多種慢性心臟病的潛在療法之一［12］。CaN作為一種絲/蘇氨酸磷酸酶，可以通過干涉心肌細(xì)胞重構(gòu)、功能重構(gòu)及心肌細(xì)胞凋亡等多途徑影響心力衰竭。CaN活性與心肌細(xì)胞［Ca2+］i濃度密切相關(guān)［13］，當(dāng)心肌細(xì)胞［Ca2+］i濃度增加時(shí)可激活CaN，上調(diào)其mRNA及蛋白表達(dá)［14］，經(jīng)過一系列反應(yīng)引起心肌重構(gòu)。通過抑制心肌細(xì)胞［Ca2+］i濃度進(jìn)而提高CaN活性及蛋白表達(dá)、改善心力衰竭的療效得到證實(shí)［15］。本研究結(jié)果顯示，ECYXT提高了兔擴(kuò)張型心肌病心力衰竭模型心肌組織SERCA2a mRNA及蛋白表達(dá)水平，降低了心肌細(xì)胞［Ca2+］i濃度及心肌組織CaN mRNA及蛋白表達(dá)水平，其機(jī)制可能為ECYXT通過提高心肌組織SERCA2a mRNA及蛋白表達(dá)水平，進(jìn)而降低心肌細(xì)胞［Ca2+］i濃度，并基于此，下調(diào)了心肌組織CaN mRNA及蛋白表達(dá)水平。但比較ECYXT中劑量組、ECYXT高劑量組和氯沙坦鉀組對(duì)心肌組織SERCA2a mRNA及蛋白表達(dá)水平的變化與心肌細(xì)胞［Ca2+］i濃度和心肌組織CaN mRNA及蛋白表達(dá)水平的變化出現(xiàn)不一致，說明SERCA2a與心肌細(xì)胞［Ca2+］i濃度之間的調(diào)節(jié)可能并非簡(jiǎn)單的對(duì)應(yīng)關(guān)系，或者與藥物劑量的變化有關(guān)，其機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究通過觀察ECYXT對(duì)兔擴(kuò)張型心肌病心力衰竭模型進(jìn)行干預(yù)，比較各組兔心肌組織形態(tài)學(xué)，血清ANP、BNP水平，LVEF、LVFS和E/A比值，心肌細(xì)胞［Ca2+］i濃度，心肌組織CaN、SERCA2a mRNA及蛋白表達(dá)水平等指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，ECYXT能提高心功能，其機(jī)制可能是通過提高心肌組織SERCA2a mRNA及蛋白表達(dá)水平，降低心肌細(xì)胞［Ca2+］i濃度，抑制心肌組織CaN mRNA及其蛋白表達(dá)，改善心肌重構(gòu)，進(jìn)而改善心力衰竭。

作者貢獻(xiàn)：李雅進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計(jì)，研究的實(shí)施與可行性分析，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理及結(jié)果的分析與解釋，撰寫論文；李玉瑩進(jìn)行數(shù)據(jù)收集；魏佳明進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，論文修訂；郭志華負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校，對(duì)文章整體負(fù)責(zé)，監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。