周子皓， 楊 帆， 李 棟， 王建平， 徐建華*

1. 華東師范大學(xué)精密光譜科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗室， 上海 200241 2. 中國科學(xué)院化學(xué)研究所分子反應(yīng)動力學(xué)實(shí)驗室， 北京 100190 3. 北京分子科學(xué)國家研究中心， 北京 100190

引 言

大量研究表明， 生物體系所處環(huán)境的pH值， 對生物體許多生命活動具有十分重要的影響。 例如， 細(xì)胞內(nèi)酶活性的調(diào)節(jié)[1]、 細(xì)胞的生長與分化， 以及細(xì)胞凋亡等[2]， 生物體中某些疾病的發(fā)生也與生物系統(tǒng)內(nèi)pH值的異常變化有關(guān)[3]。 所以， 監(jiān)測生物體內(nèi)pH值的變化， 對了解生物體所處狀態(tài)具有重要意義。 目前， 較為常用的幾種測定生物體系pH值的方法有核磁共振影像法、 微電極法、 熒光光譜法等等[4]。 其中， 由于熒光光譜技術(shù)具有操作簡單、 重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)， 常被用做實(shí)驗中pH值的檢測[4]。

半導(dǎo)體量子點(diǎn)是眾多納米材料的一種， 其三維空間尺寸均在納米量級， 因此具有許多獨(dú)特的物理化學(xué)性質(zhì)。 比如， 量子點(diǎn)具有較大的比表面積， 其內(nèi)部包含原子較少， 幾乎所有原子都處于表面狀態(tài)[5]， 量子點(diǎn)的表面剩余價鍵增多[6]， 出現(xiàn)較多的活性中心， 導(dǎo)致其具有較強(qiáng)的表面與界面效應(yīng)， 使得量子點(diǎn)表面對周邊環(huán)境具有較大的靈敏性[7]。

研究發(fā)現(xiàn)， 量子點(diǎn)由于表面結(jié)構(gòu)對pH值具有較強(qiáng)的靈敏性[8]， 因而人們常利用其對pH值的響應(yīng)來研究生物體系pH值的變化[9]。 目前， 量子點(diǎn)對pH值的響應(yīng)在生物領(lǐng)域已有較多實(shí)例。 Deng等[10]通過制備pH敏感的CdTe量子點(diǎn)作為pH值熒光探針來實(shí)現(xiàn)對病毒的檢測； Li等[11]通過合成對巰基苯胺包覆的CdSe/ZnS量子點(diǎn)， 被用來作為檢測水相中pH值的熒光探針； 當(dāng)前有關(guān)量子點(diǎn)pH響應(yīng)方面的研究主要集中在含Cd類量子點(diǎn)， 且都是研究其穩(wěn)態(tài)熒光光譜對pH值的響應(yīng)。 然而， Cd類量子點(diǎn)對生物體系具有一定的毒性， 且穩(wěn)態(tài)熒光光譜法由于受濃度等因素的影響具有一定的不穩(wěn)定性， 因此應(yīng)用于生物體系中作為pH探針具有明顯的缺點(diǎn)。

研究證實(shí)[12]， ZnSe量子點(diǎn)具有生物毒性小， 生物相容性好等特點(diǎn)， 非常適合應(yīng)用于生物體系中。 本文通過水相合成法制備了以谷胱甘肽為配體的ZnSe量子點(diǎn)并研究了其熒光壽命對不同pH值的響應(yīng)規(guī)律。

1 實(shí)驗部分

1.1 試劑與儀器

研究所使用的主要化學(xué)試劑， 均來源于商業(yè)購買， 且使用時均未進(jìn)一步純化。 硒粉(Selenium, Se)， 分析純， 98%， 上海阿拉丁試劑公司； 二水合醋酸鋅(Zinc acetate dehydrate, ZnAc2·2H2O)， 分析純， 98%， 國藥試劑有限公司； 谷胱甘肽(L-glutathione， GSH)， 分析純， 98%， 阿拉丁試劑公司； 硼氫化鈉(Sodium borohydride， NaBH4)， 分析純， 98%， 阿拉丁試劑公司。

穩(wěn)態(tài)吸收光譜數(shù)據(jù)的采集是使用紫外-可見分光光度計(TU1901， 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)。 儀器可在190～900 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行探測， 波長準(zhǔn)確度±0.3 nm。

穩(wěn)態(tài)熒光光譜采用的是Horiba公司生產(chǎn)的FluoroMax4型熒光光譜儀， 穩(wěn)態(tài)熒光光譜激發(fā)波長為298 nm， 狹縫寬度設(shè)定為光譜分辨率1 nm/1 nm。 因為不同波長光源的發(fā)射功率不一樣， 且探測器在不同波長下的探測效率也不一樣， 所以我們在檢測樣品的穩(wěn)態(tài)熒光光譜時選用S1c/R1c。

時間分辨熒光光譜的采集使用的時間相關(guān)單光子計數(shù)(TCSPC)設(shè)備為我們課題組自行搭建[13]， 實(shí)驗中使用的激發(fā)光源為半導(dǎo)體脈沖激光器(PDL 800-B， PicoQuant)， 中心波長為298 nm， 功率為1 μW， 重復(fù)頻率為10 MHz, 系統(tǒng)儀器響應(yīng)時間分辨率為200 ps。

1.2 方法

(1)ZnSe量子點(diǎn)的合成及提純

ZnSe量子點(diǎn)的合成主要參照Zhang等[14]的研究工作， 通過水熱合成法合成出了以谷胱甘肽作為配體的水溶性ZnSe量子點(diǎn)， 合成所用Zn2+∶Se+∶GSH為1∶0.4∶1.3。 將22 mg硼氫化鈉和700 μL水加入5 mL的玻璃瓶中， 向其中加入15.8 mg硒粉， 使之充分反應(yīng)， 得到硒氫化鈉溶液。 再將109.75 mg醋酸鋅和200 mg谷胱甘肽溶于20 mL水中， 用1 mol·L-1的氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值到11.5， 將反應(yīng)制得的硒氫化鈉溶液加入其中， 混合溶液在100 ℃油浴下， 磁力攪拌加熱2 h， 制得ZnSe量子點(diǎn)原液。 將所合成的ZnSe量子點(diǎn)原液， 加入1.5倍體積的異丙醇， 以8 000 r·min-1離心3 min， 去除上層清液， 將所得白色固體真空干燥， 得到提純后的ZnSe量子點(diǎn)固體并保存于4 ℃冰箱中， 以備后續(xù)實(shí)驗使用。

(2)ZnSe量子點(diǎn)的表征

取上述制備的ZnSe量子點(diǎn)固體1 mg， 加入去離子水并稀釋至1 mmol·L-1(以Zn2+濃度計)， 得到ZnSe量子點(diǎn)溶液。 取1 mL所配制的ZnSe量子點(diǎn)溶液， 使用穩(wěn)態(tài)熒光光譜儀和紫外吸收可見分光光度計測量其熒光光譜和吸收光譜。

取200 μL所配制的ZnSe量子點(diǎn)溶液， 滴在超薄微型銅網(wǎng)上， 晾干后， 采用透射電子顯微鏡對其形貌特征進(jìn)行表征。

(3)ZnSe量子點(diǎn)在不同pH值中及與Na+相互作用的光譜表征

分別取所配制的不同pH值的0.2 mol·L-1的PBS緩沖液2 mL， 依次向其中加入配制的濃度1 mmol·L-1的ZnSe量子點(diǎn)溶液200 μL， 搖勻， 靜置2 min后， 采用穩(wěn)態(tài)熒光光譜儀和時間單光子計數(shù)分別采集其熒光光譜和時間分辨熒光光譜。 取兩份2 mL的pH值為7的PBS緩沖液， 并分別向其中加入200 μL量子點(diǎn)溶液， 然后， 向其中一份加入200 μL配制的1.8 mol·L-1的NaCl溶液， 另一份加入200 μL去離子水， 分別搖勻， 靜置2 min后， 分別測定其時間分辨熒光光譜。

2 結(jié)果與討論

2.1 ZnSe量子點(diǎn)的表征

圖1為ZnSe量子點(diǎn)吸收、 熒光光譜及TEM形貌表征。 從圖1(a)可以看出， 所制備的ZnSe量子點(diǎn)熒光發(fā)射峰在375 nm附近且半峰寬在20 nm左右， 第一激子吸收峰在360 nm處， 該結(jié)果與文獻(xiàn)報道吻合。 通過透射電子顯微鏡觀察[圖1(b)]， 合成的ZnSe量子點(diǎn)近球形， 分散性較好， 粒徑尺寸在3 nm左右且分布較集中。 以上結(jié)果證明制備出了較好的納米級ZnSe量子點(diǎn)。

圖1 ZnSe量子點(diǎn)的熒光及紫外-可見吸收光譜(a)和透射電鏡表征圖(b)

2.2 不同pH值下的ZnSe量子點(diǎn)穩(wěn)態(tài)熒光光譜

通過調(diào)節(jié)不同pH值的PBS緩沖液， 我們每間隔0.5， 分別測定了5～11范圍內(nèi)不同pH值下ZnSe量子點(diǎn)的穩(wěn)態(tài)熒光光譜， 在此pH值范圍ZnSe量子點(diǎn)能夠穩(wěn)定存在， 測量的結(jié)果如圖2所示。 圖2展示了ZnSe量子點(diǎn)不同pH值下的熒光峰， 從圖中可以看出， 在所考察的pH值范圍內(nèi)， ZnSe量子點(diǎn)熒光強(qiáng)度隨pH值的增加而增強(qiáng)， 變化趨勢呈正相關(guān)， 并且熒光峰伴隨pH值的增加產(chǎn)生稍微的紅移， 峰的位置由374 nm移動到377 nm處。 究其原因， 可能是由于在較低pH值下， 表面配體質(zhì)子化從配體表面脫落， 脫離表面時帶走表面原子， 使得量子點(diǎn)尺寸減小， 從而在較低pH值下， 量子點(diǎn)發(fā)光峰波長較短。 ZnSe量子點(diǎn)熒光特性隨pH值的變化說明pH值對量子點(diǎn)的發(fā)光態(tài)具有影響， 其機(jī)制是不同pH值下， 配體具有不同的狀態(tài)[8, 15]。 相關(guān)文獻(xiàn)報道， 由于谷胱甘肽分子在不同pH值下， 其分子內(nèi)羧基和氨基基團(tuán)的質(zhì)子化和去質(zhì)子化程度不同， 導(dǎo)致谷胱甘肽配體分子在不同pH值下與Zn2+的配位結(jié)構(gòu)不同[14]， 使得配體分子對量子點(diǎn)表面的包覆程度不同， 進(jìn)而使量子點(diǎn)的表面出現(xiàn)不同狀態(tài)。 當(dāng)pH值增加時, 谷胱甘肽配體分子更易去質(zhì)子化， 其與Zn2+配位程度將更加緊密， 導(dǎo)致ZnSe量子點(diǎn)表面缺陷態(tài)減少， 使得ZnSe量子點(diǎn)熒光強(qiáng)度增加。

圖2 不同PH值下ZnSe量子點(diǎn)的穩(wěn)態(tài)熒光光譜

2.3 不同pH值下的ZnSe量子點(diǎn)熒光動力學(xué)特性

從ZnSe量子點(diǎn)的穩(wěn)態(tài)熒光光譜可以看出， 其熒光強(qiáng)度隨pH值增大而增加。 為此， 我們從熒光動力學(xué)的角度考察了pH值對ZnSe量子點(diǎn)熒光特性的影響。 圖3是在不同pH值下， ZnSe量子點(diǎn)在發(fā)射波長為375 nm處的時間分辨熒光動力學(xué)曲線。 從圖中可以看出， ZnSe量子點(diǎn)的熒光壽命隨pH值的增加變小。 對不同pH值下得到的熒光動力學(xué)曲線我們通過雙指數(shù)函數(shù)可以得到很好的擬合

I(t)=α1e-t/τ1+α2e-t/τ2

(1)

擬合得到兩個熒光壽命組分， 分別為一個大約為24 ns的長壽命組分τ1和一個大約為4 ns的短壽命組分τ2，α1和α2分別為熒光壽命組分的振幅， 并通過式(2)

(2)

計算得到了整體的平均壽命[16]。 圖4(a)為平均壽命隨pH值的變化曲線， 可以看出， ZnSe量子點(diǎn)的平均壽命隨pH值的增加而呈減小趨勢， 且pH值在6～8的范圍內(nèi)， 其平均壽命隨pH值的改變最為明顯， 出現(xiàn)一個較大幅度的衰減。 從

圖3 ZnSe量子點(diǎn)在不同pH值下的熒光衰減曲線

圖4 ZnSe量子點(diǎn)平均壽命(a)和兩種熒光壽命組分(b)隨pH值的變化曲線

圖4(b)中可以看出， 長壽命τ1隨pH值的變化曲線和平均壽命變化曲線一致， 而短壽命τ2隨pH值的變化不明顯， 但總體有上升的趨勢。 另外， 從表1中可以看出，τ1組分占比下降，τ2組分則占比上升， 且同樣在6～8的pH值范圍內(nèi)出現(xiàn)一個較顯著的變化。 以上實(shí)驗結(jié)果表明， pH值的改變主要影響ZnSe量子點(diǎn)τ1所對應(yīng)的熒光衰減組分， 且在6～8的pH值的范圍內(nèi)， ZnSe量子點(diǎn)的熒光壽命對pH值的響應(yīng)較為靈敏。

表1 擬合得到的各組分的熒光壽命及其振幅

為了確認(rèn)擬合得到的兩個不同的壽命的來源， 我們進(jìn)一步考察了pH值分別為6， 7和8的環(huán)境下， 不同探測波長的熒光動力學(xué)并進(jìn)行擬合得到熒光壽命， 其結(jié)果展示于圖5。 在三種pH值下， ZnSe量子點(diǎn)的τ1均隨探測波長的增加而增大， 而τ2與波長的相關(guān)性不大。 Zhao等[17]的研究結(jié)果證實(shí)， 量子點(diǎn)的長壽命會隨波長的變化而變化， 而短壽命則不依賴于波長的改變而改變。τ1的來源為表面態(tài)的局域載流子的復(fù)合， 而τ2則來源于核內(nèi)非局域載流子的復(fù)合[16-17]。 以上分析進(jìn)一步說明， pH值對量子點(diǎn)表面態(tài)產(chǎn)生了顯著影響進(jìn)而導(dǎo)致量子點(diǎn)的熒光特性的改變。 對于ZnSe量子點(diǎn)來說， 由于表面谷胱甘肽配體對pH值敏感， pH值的改變會導(dǎo)致谷胱甘肽配體的質(zhì)子化程度的變化， 從而影響與量子點(diǎn)表面的配位方式， 導(dǎo)致其表面狀態(tài)的改變[6]。 當(dāng)pH值減小時， 谷胱甘肽配體質(zhì)子化， 導(dǎo)致其與ZnSe量子點(diǎn)表面Zn2+配位緊密程度下降， 從而導(dǎo)致其表面態(tài)的增加， 載流子將更多的遷移到表面， 使得τ1組份增加。 另外， 由于實(shí)驗所測量的熒光衰減曲線包含輻射弛豫和無輻射弛豫， 是兩種弛豫方式綜合疊加的結(jié)果， 所以熒光衰減壽命由輻射躍遷速率Γr和無輻射躍遷速率Fnr來表示

(3)

輻射和非輻射躍遷速率的改變都會影響整體熒光壽命的改變。 通過穩(wěn)態(tài)熒光實(shí)驗得到， 當(dāng)pH值增加時, ZnSe量子點(diǎn)熒光強(qiáng)度上升， 說明其輻射躍遷速率Γr上升， 且無輻射躍遷速率Γnr下降[18]。 根據(jù)式(3)并結(jié)合時間分辨熒光光譜實(shí)驗結(jié)果分析得出， pH值的增加使ZnSe量子點(diǎn)表面態(tài)輻射躍遷速率的增加量要大于無輻射躍遷速率的減小量， 從而ZnSe量子點(diǎn)表面態(tài)熒光壽命隨pH值的增加而減小。

圖5 pH值為6， 7， 8時ZnSe量子點(diǎn)穩(wěn)態(tài)熒光光譜及熒光壽命隨發(fā)射波長的變化曲線

2.4 ZnSe量子點(diǎn)作為pH值探針

由于ZnSe量子點(diǎn)熒光壽命對pH值的變化具有響應(yīng)， 我們對擬合得到的兩種不同的壽命組分進(jìn)行比值τ1/τ2計算， 發(fā)現(xiàn)其比值在不同的pH值范圍內(nèi)隨pH值的變化具有一定的線性相關(guān)性， 結(jié)果展示于圖6。 從圖中可以看出， 在不同pH值范圍內(nèi)，τ1與τ2的比值所呈的線性斜率不同， 在pH為6～8的范圍內(nèi)， 其隨pH值變化的線性斜率最大(k=-0.63,R2=0.993)， 說明在此范圍內(nèi)ZnSe量子點(diǎn)的壽命對pH值的變化最為靈敏， 可作為pH值探針應(yīng)用于生物體系中。

圖6 ZnSe量子點(diǎn)熒光壽命τ1與τ2的比值隨pH值的變化

另外， 生物體系中由于存在多種金屬離子， 需要考察這些金屬離子是否會對量子點(diǎn)熒光壽命產(chǎn)生影響。 為此我們研究了生物體系中存在最多的金屬鈉離子Na+對ZnSe量子點(diǎn)熒光壽命的影響。 由于生物體系pH值一般在7附近， 為了與生物體系相符合， 我們在pH值為7的環(huán)境下， 測定了有無NaCl時， ZnSe量子點(diǎn)溶液的熒光動力學(xué)， 擬合得到平均壽命分別為24.7和24.9ns， 兩者壽命差別不大， 表明Na+對ZnSe量子點(diǎn)的熒光壽命影響較小。 另據(jù)文獻(xiàn)報道， 其他金屬離子對ZnSe量子點(diǎn)會產(chǎn)生猝滅效應(yīng)， 但其猝滅方式為靜態(tài)猝滅[19-20]， 因此說明金屬離子對ZnSe量子點(diǎn)的熒光壽命影響不大。 綜上分析， ZnSe量子點(diǎn)熒光壽命對pH值的響應(yīng)作為一種pH值的檢測方法應(yīng)用在生物體系中具有一定的潛力。

3 結(jié) 論

通過測定ZnSe量子點(diǎn)在不同pH值下的熒光衰減曲線， 我們發(fā)現(xiàn)其在不同pH范圍內(nèi)對pH具有不同的響應(yīng)靈敏性。 通過擬合熒光動力學(xué)曲線， 得到兩個一快一慢的壽命組分τ1和τ2。 分析兩壽命組分各自隨pH值變化規(guī)律， 發(fā)現(xiàn)長壽命組分對pH值的變化響應(yīng)較大， 并確定長壽命組分來源于量子點(diǎn)表面態(tài)發(fā)光， 說明ZnSe量子點(diǎn)熒光壽命對pH值的響應(yīng)主要因其表面狀態(tài)的改變。 另外，τ1和τ2的比值在不同pH值范圍內(nèi)具有一定的線性相關(guān)性， 且在不同pH值范圍內(nèi)線性斜率不同， 在pH值為6～8的范圍內(nèi)具有最大的線性斜率， 表明在此范圍內(nèi)其熒光壽命對pH值的變化最為靈敏。 由于熒光壽命相較于穩(wěn)態(tài)熒光強(qiáng)度不受溶液濃度及強(qiáng)度等影響， 所以ZnSe量子點(diǎn)熒光壽命對pH值的響應(yīng)特性在生物體系pH值檢測中具有良好的應(yīng)用前景。