郭雨曦, 宋天歌, 孫瑜珊, 喻 倩*, 竇海洋*

(1. 河北大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院, 河北 保定 071000; 2. 河北大學(xué)化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院, 河北 保定 071002)

淀粉是人類主要的能量來(lái)源之一,以其獨(dú)有的物理化學(xué)性質(zhì)和功能特性廣泛應(yīng)用在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域。在食品生產(chǎn)中,淀粉作為一種重要的食品配料,對(duì)于調(diào)整食品的質(zhì)地有重要作用[1,2]。淀粉成膜性和凍融穩(wěn)定性被應(yīng)用于膠凝劑、增稠劑,穩(wěn)定劑和涂層劑等工業(yè)[3,4]。淀粉顆粒大小是影響其功能特性的重要因素之一[5]。目前,表征淀粉顆粒大小常用的方法有動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)(dynamic light scattering, DLS)和顯微鏡技術(shù)[6]。DLS分析樣品時(shí)間短、操作簡(jiǎn)單、成本低,但對(duì)于粒徑分布較寬的樣品,不同粒徑顆粒的散射光之間會(huì)產(chǎn)生干涉,降低樣品粒徑表征結(jié)果的準(zhǔn)確性[7]。光學(xué)顯微鏡(optical microscopy, OM)操作簡(jiǎn)單、分析成本低,可以同時(shí)提供淀粉顆粒形貌及粒徑分布信息,但OM檢測(cè)的樣本數(shù)量有限,分析時(shí)間長(zhǎng)。

20世紀(jì)60年代Giddings博士[8]首次提出場(chǎng)流分離(field-flow fractionation, FFF)概念,其中非對(duì)稱場(chǎng)流分離(asymmetrical flow field-flow fractionation, AF4)是一種應(yīng)用最廣的FFF子技術(shù),無(wú)固定相和填充材料,適用于剪切力敏感的樣品的分離,檢測(cè)范圍廣(1 nm～50 μm)[9]。該技術(shù)已應(yīng)用于蛋白質(zhì)及其復(fù)合物、納米粒子、亞細(xì)胞單元和聚合物的分離表征[10]。AF4可與多角度激光光散射檢測(cè)器(MALS)和示差折光檢測(cè)器(dRI)聯(lián)用(AF4-MALS-dRI),表征淀粉分子的粒徑分布[11]。目前,商品化的AF4系統(tǒng)檢測(cè)上限為10 μm,對(duì)于淀粉顆粒粒徑表征具有一定局限性。本研究構(gòu)建了AF4系統(tǒng),結(jié)合商品化的AF4系統(tǒng),與紫外可見(jiàn)光檢測(cè)器(UV)、MALS和dRI聯(lián)用,考察了其在納米與微米尺度下對(duì)淀粉分離表征的性能。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

SQP電子天平(北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司,中國(guó)); MS-H550-Pro磁力攪拌器(北京大龍興創(chuàng)實(shí)業(yè)有限公司,中國(guó)); DHG-914385-Ⅲ電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司,中國(guó)); Eclipse Ci型顯微鏡(尼康公司,日本); ZEN 3700型動(dòng)態(tài)光散射粒度分析儀(馬爾文公司,英國(guó)); UPR-Ⅱ-10T超純水系統(tǒng)(西安優(yōu)普儀器設(shè)備有限公司,中國(guó)); LC-20AT液相泵和SPD-20A紫外可見(jiàn)光檢測(cè)器(島津公司,日本); DAWN EOS MALS型多角度激光光散射檢測(cè)器(懷雅特公司,美國(guó)); 1260 Infinity Ⅱ示差折光檢測(cè)器(安捷倫公司,德國(guó))。

大米、蓮子、紅薯購(gòu)自當(dāng)?shù)爻?馬脾鐵蛋白、溴酚藍(lán)(BPB)購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司;聚苯乙烯乳化球(PS)、FL-70購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司;NaOH、HCl、NaHSO3、SDS(sodium dodecyl sulfate)、NaNO3、Triton X-100(polyethylene glycol tert-octylphenyl ether)、NaN3、羥丙基甲基纖維素(HPMC)購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1淀粉顆粒及淀粉溶液的制備

淀粉顆粒的制備:將大米、紅薯和蓮子洗凈晾干。根據(jù)Schoch等[12]描述的方法提取淀粉顆粒。具體方法如下:室溫下,將40 g大米在200 mL NaHSO3(1 g/L)中浸泡12 h后使用廚房料理機(jī)在250 W的條件下粉碎2 min,依次通過(guò)80和120目篩,將濾液轉(zhuǎn)入2 L燒杯中,靜置5 h后棄上清液,然后用去離子水重懸沉淀物,靜置3 h,重復(fù)3次,沉淀物在40 ℃的烘箱中干燥得到淀粉顆粒。

淀粉溶液的制備:室溫下,將15 mg淀粉顆粒和1.5 mL 1 mol/L NaOH添加到20 mL玻璃瓶中,200 r/min攪拌6 min。然后將裝有大米、蓮子淀粉的玻璃瓶放置在75 ℃的水浴中,裝有紅薯淀粉的玻璃瓶放置在78 ℃的水浴中,400 r/min攪拌4 min,加入4.5 mL去離子水,繼續(xù)攪拌2 h。最后加入1 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至7,得到淀粉溶液。

1.2.2光學(xué)顯微鏡對(duì)淀粉顆粒的表征

將10 μL淀粉懸浮液(3.0 g/L)滴到顯微鏡載玻片上,在400倍的放大倍率下觀察淀粉顆粒的形貌與大小(Nikon Digital Sight軟件)。由于淀粉顆粒形狀不規(guī)則,本實(shí)驗(yàn)所測(cè)長(zhǎng)度為平面下顆粒的最長(zhǎng)尺寸。每種淀粉每次統(tǒng)計(jì)500個(gè)顆粒,得到其平均直徑,所有檢測(cè)重復(fù)3次。

1.2.3Zeta電位的表征

樣品檢測(cè)質(zhì)量濃度為3.0 g/L,采用動(dòng)態(tài)光散射粒度分析儀對(duì)不同載液條件下的淀粉顆粒懸濁液的Zeta電位進(jìn)行分析,所有檢測(cè)重復(fù)3次。

1.2.4非對(duì)稱場(chǎng)流分離系統(tǒng)的構(gòu)建及對(duì)淀粉顆粒粒徑的表征

AF4系統(tǒng)構(gòu)建及對(duì)淀粉顆粒的分析:采用10 kDa再生纖維素(RC)膜和350 μm墊片組裝的AF4通道構(gòu)建了AF4系統(tǒng)(見(jiàn)圖1)。通道具有梯形的幾何形狀,長(zhǎng)度為17.4 cm,入口和出口的寬度分別為2.2 cm和0.15 cm。通過(guò)BPB確定聚集時(shí)間,通過(guò)鐵蛋白確定通道實(shí)際厚度為290 μm。載液為0.01%(w/v)表面活性劑和0.02%(w/v)NaN3的去離子水。將20 μL淀粉顆粒懸浮液以0.2 mL/min的速度注入通道。檢測(cè)器流速和交叉流流速分別為1.0和0.3 mL/min。通過(guò)SPD-20A紫外可見(jiàn)光檢測(cè)器在254 nm波長(zhǎng)下對(duì)淀粉顆粒進(jìn)行檢測(cè)。

圖 1 構(gòu)建的AF4系統(tǒng)示意圖Fig. 1 Schematic illustration of asymmetrical flow field-flow fractionation (AF4) system

AF4在空間位阻模式下的保留時(shí)間(tr)和樣品的水合直徑(d)有如下關(guān)系[13]:

logtr=-Sdlogd+logtr1

(1)

tr1為具有單位直徑的粒子的tr的外推值;Sd為樣品顆粒的分離度。

斜率(Sd)和y軸截距(tr1)由校準(zhǔn)曲線確定后,根據(jù)公式(1)可將AF4-UV洗脫圖譜(c(tr))轉(zhuǎn)換為粒徑質(zhì)均分布(m(d))[14]:

(2)

V為體積流速。粒徑數(shù)均分布(n(d))[15]:

(3)

淀粉溶液的分析:使用商品化的AF4系統(tǒng),載液為5 mmol NaNO3的去離子水溶液,樣品濃度為0.30 g/L,進(jìn)樣流速為0.20 mL/min,進(jìn)樣體積為50 μL,交叉流流速?gòu)?.20 mL/min指數(shù)下降到0.05 mL/min,半衰期(t1/2)為3.0 min。通過(guò)BPB確定聚集時(shí)間,通過(guò)鐵蛋白測(cè)得通道實(shí)際厚度為287 μm。

2 結(jié)果與討論

2.1 構(gòu)建的AF4系統(tǒng)的分離性能

采用微米尺寸的PS標(biāo)準(zhǔn)樣品對(duì)構(gòu)建的AF4系統(tǒng)分離性能進(jìn)行了評(píng)估。檢測(cè)器流速為1 mL/min,交叉流速為0.3 mL/min,選擇載液為0.02%(w/v)FL-70和0.02%(w/v)NaN3去離子水溶液,按體積比1∶1∶1∶1混合2、6、12和20 μm粒徑的PS標(biāo)準(zhǔn)樣品,進(jìn)行AF4分離性能檢驗(yàn)(見(jiàn)圖2a)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,構(gòu)建的AF4系統(tǒng)對(duì)混合的4種微米級(jí)PS標(biāo)準(zhǔn)樣品實(shí)現(xiàn)了基線分離,2和6 μm粒徑的PS分辨率為3.65, 6和12 μm粒徑的PS分辨率為1.40, 4種PS標(biāo)準(zhǔn)樣品的校準(zhǔn)曲線R2為0.999(見(jiàn)圖2b)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了構(gòu)建的AF4系統(tǒng)對(duì)微米級(jí)樣品具有良好的分辨率,同商品化AF4相比,其檢測(cè)上限更高,具有分離表征淀粉顆粒的潛力。

圖 2 聚苯乙烯(PS)標(biāo)準(zhǔn)樣品的(a)AF4洗脫譜圖和(b)校準(zhǔn)曲線Fig. 2 (a) AF4 fractogram and (b) calibration curve of polystyrene (PS) standard samplestr: retention time; d: hydrodynamic diameter.

2.2 構(gòu)建的AF4系統(tǒng)表征淀粉顆粒粒徑的分布

2.2.1載液組成對(duì)構(gòu)建的AF4分離表征淀粉顆粒粒徑的影響

載液組成是影響樣品與AF4超過(guò)濾膜交聯(lián)的主要因素之一,根據(jù)不同樣品表面性質(zhì)的差異,需采用不同的表面活性劑分散樣品顆粒。本文考察了3種表面活性劑對(duì)AF4分離表征淀粉顆粒的影響。載液為0.01%(w/v)表面活性劑和0.02%(w/v)NaN3(抑菌劑)的去離子水溶液。當(dāng)交叉流流速為0 mL/min,直接進(jìn)樣品得到的峰面積為A0;當(dāng)交叉流流速為0.3 mL/min,樣品峰面積為A1,淀粉顆粒的回收率為A1/A0。不同載液條件下,AF4分析3種淀粉顆粒的回收率列于表1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,3種淀粉顆粒在SDS載液中的回收率最高;其中大米淀粉顆粒的回收率為98.89%。根據(jù)Plocková等[15]報(bào)道,在AF4分析過(guò)程中,樣品在不同成分載液中的回收率差異可用靜電力解釋。

表 1 不同載液條件下AF4分析淀粉顆粒樣品的回收率(n=3)

中性條件下,AF4超過(guò)濾膜表面主要帶負(fù)電荷,增加樣品表面負(fù)電荷可提高樣品與AF4超過(guò)濾膜之間的靜電排斥力,減小樣品與超過(guò)濾膜的交聯(lián),進(jìn)而提高樣品的回收率[16]。Zeta電位表征結(jié)果顯示(見(jiàn)表2), 3種樣品在所有載液條件下帶負(fù)電,相同來(lái)源的淀粉顆粒樣品在SDS載液中的Zeta電位絕對(duì)值最大;在SDS載液中,蓮子淀粉表面電位絕對(duì)值(45.33±1.36)大于大米淀粉表面電位絕對(duì)值(25.9±0.53),但是蓮子淀粉顆粒的回收率小于大米淀粉顆粒,說(shuō)明Zeta電位不是影響樣品與超過(guò)濾膜表面交聯(lián)的唯一因素。載液黏度與樣品的結(jié)構(gòu)特性共同影響樣品與超過(guò)濾膜表面的交聯(lián)[17]。

表 2 不同載液條件下淀粉顆粒的Zeta電位(n=3)

2.2.2構(gòu)建的AF4系統(tǒng)表征淀粉顆粒粒徑的準(zhǔn)確性

采用OM檢驗(yàn)構(gòu)建的AF4系統(tǒng)表征淀粉顆粒粒徑的準(zhǔn)確性。OM測(cè)得的淀粉顆粒粒徑分布如圖3柱狀圖所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,紅薯、蓮子、大米淀粉顆粒的尺寸范圍分別為3～32 μm、2.1～23.5 μm、1.5～12 μm;平均粒徑分別為12.16±0.11 μm、16.04±0.79 μm、5.25±0.30 μm。根據(jù)公式(1)～(3),結(jié)合圖2的PS標(biāo)準(zhǔn)曲線,將不同載液條件下得到的淀粉顆粒的AF4洗脫圖譜轉(zhuǎn)換成粒徑數(shù)均分布(見(jiàn)圖3),平均粒徑列于表3。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,AF4測(cè)量淀粉顆粒平均粒徑整體小于OM測(cè)量值。這主要是因?yàn)锳F4測(cè)量的是樣品水合直徑,對(duì)于不規(guī)則樣品,OM采用顆粒的最長(zhǎng)尺寸為直徑。此外,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在純水條件下,AF4測(cè)量的蓮子淀粉顆粒平均粒徑(11.05±0.54 μm)小于OM測(cè)量值,這可能是由于在此條件下蓮子淀粉的回收率為14.98%(見(jiàn)表1),只有部分蓮子淀粉顆粒被檢測(cè)到,導(dǎo)致OM測(cè)量的粒徑分布代表性差。在SDS載液條件下,AF4測(cè)得的大米淀粉顆粒粒徑大于OM測(cè)量值。這可能是由于淀粉顆粒在AF4空間模式中的洗脫受重力、升力、外加力和靜電排斥力影響,升力與靜電排斥力之和大于外加力與重力之和,使淀粉顆粒更接近池道中心,洗脫速度更快,保留時(shí)間更短,進(jìn)而和圖2得到的PS標(biāo)準(zhǔn)曲線有偏差,所以大米淀粉在SDS載液條件下洗脫時(shí),AF4測(cè)量平均粒徑值比OM測(cè)量值大。Woo等[18]報(bào)道:載體黏度影響PS的保留率,當(dāng)載液黏度接近1時(shí),通道底部與顆粒之間具有相互排斥作用并隨載液黏度的增加保留率先下降后上升。已知載液中只含有0.01%SDS載液時(shí),黏度接近于1。為增加載液黏度,減小樣品所受的靜電排斥力,在0.01%SDS+0.02%NaN3載液中加入0.001%(w/v)HPMC,使樣品更接近AF4通道底部,相應(yīng)結(jié)果見(jiàn)圖4。在此條件下,AF4測(cè)量大米淀粉顆粒的數(shù)均分布與OM測(cè)得結(jié)果相似。

圖 3 不同載液條件下淀粉顆粒的粒徑數(shù)均分布Fig. 3 Number-based size distributions of starch granules obtained with different carrier liquids

表 3 不同載液條件下AF4表征淀粉顆粒平均粒徑結(jié)果(n=3)

圖 4 大米淀粉的(a)AF4洗脫譜圖及(b)粒徑數(shù)均分布Fig. 4 (a) AF4 fractograms and (b) number-based size distributions of rice starch granulesHPMC: hydroxy propyl methyl cellulose

2.3 AF4對(duì)淀粉分子尺寸分布的表征

淀粉顆粒的溶解程度影響淀粉分子尺寸分布和摩爾質(zhì)量表征的準(zhǔn)確性[19]。本實(shí)驗(yàn)采用堿溶法溶解淀粉顆粒,考察了溫度對(duì)淀粉顆粒溶解的影響(見(jiàn)圖5)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,溶解溫度為75 ℃時(shí),紅薯淀粉回轉(zhuǎn)半徑(Rg)分布和重均摩爾質(zhì)量(Mw)分布在tr=7～13 min處出現(xiàn)凸起,這可能是由于紅薯淀粉未全溶解,發(fā)生了共洗脫現(xiàn)象,粒徑大的顆粒與粒徑小的顆粒同時(shí)洗脫出來(lái)[20,21]。當(dāng)溶解溫度為78 ℃時(shí),共洗脫現(xiàn)象消失,紅薯淀粉溶解較好。由圖5a可見(jiàn),在tr=5.4 min和tr=12 min出現(xiàn)兩個(gè)洗脫峰,前者是直鏈淀粉洗脫峰,后者為支鏈淀粉洗脫峰。當(dāng)溶解溫度升高至80 ℃時(shí),AF4-dRI信號(hào)的第一個(gè)洗脫峰信號(hào)增強(qiáng),第二個(gè)洗脫峰信號(hào)降低,表明大米淀粉溶解過(guò)程中支鏈淀粉發(fā)生降解。綜上,選擇78 ℃為紅薯淀粉的溶解溫度。蓮子淀粉和大米淀粉的最佳溶解溫度為75 ℃。在最佳溶解溫度下得到的大米淀粉、紅薯淀粉和蓮子淀粉的Rg分布范圍分別為20～200 nm、20～240 nm、40～200 nm,Mw的分布范圍分別為1.80×105～3.13×108g/mol、1×106～5×108g/mol、5×105～5×108g/mol。

圖 5 不同淀粉溶解溫度下的AF4-MALS-dRI洗脫譜圖、Rg和Mw分布圖Fig. 5 AF4-MALS-dRI fractograms, Rg and Mw distributions of starches dissolved under different temperaturesMALS: multiangle light scattering; dRI: differential refractive index.

在圖5條件下,對(duì)3種淀粉的Rg/Rh和表觀密度進(jìn)行表征(見(jiàn)圖6)。Rg/Rh比值在1.0～1.5范圍表現(xiàn)為多分支結(jié)構(gòu)[22]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在摩爾質(zhì)量106～108范圍內(nèi),大米淀粉的Rg/Rh的比值在1.2～1.4之間,紅薯和蓮子淀粉的Rg/Rh的比值在0.9～1.1之間。另外,3種淀粉隨著摩爾質(zhì)量的增加,表觀密度均呈下降趨勢(shì),說(shuō)明3種淀粉分子隨著摩爾質(zhì)量的增加,結(jié)構(gòu)變得疏松。在相同的摩爾質(zhì)量下,大米淀粉的表觀密度最大,表明其結(jié)構(gòu)更為緊密。

3 結(jié)論

本研究構(gòu)建了AF4系統(tǒng),并對(duì)于大米、紅薯和蓮子3種植物來(lái)源不同的淀粉顆粒進(jìn)行了分離及粒徑表征。PS標(biāo)準(zhǔn)樣品證明了構(gòu)建的AF4系統(tǒng)具有良好的分辨率;OM粒徑表征結(jié)果驗(yàn)證了構(gòu)建的AF4在微米級(jí)淀粉顆粒粒徑表征中的準(zhǔn)確性。結(jié)果顯示,載液組成(例如表面活性劑和黏度)影響淀粉顆粒的AF4分離表征結(jié)果。商品化的AF4和MALS、dRI聯(lián)用可表征淀粉分子尺寸及結(jié)構(gòu)。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),不同來(lái)源的淀粉溶解溫度不同,結(jié)構(gòu)有所差異。實(shí)驗(yàn)證明了構(gòu)建的AF4結(jié)合商品化的AF4系統(tǒng),可在納米至微米范圍對(duì)淀粉進(jìn)行分離及粒徑表征。