鞏麗萍, 石 峰, 宿書芳, 謝強勝, 咸瑞卿, 杭寶建, 趙艷霞

(山東省食品藥品檢驗研究院, 國家藥品監(jiān)督管理局膠類產(chǎn)品質(zhì)量評價重點實驗室, 山東 濟南 250101)

阿膠是以馬科動物驢的干燥皮或鮮皮經(jīng)煎煮、濃縮制成的固體膠,其主要成分為驢皮膠原蛋白[1]。阿膠的檢測方法有差示掃描量熱法、凝膠電泳鑒別法、二維相關(guān)紅外光譜法等分析方法[2-4],可分別用于不同來源的阿膠的檢測。這些方法都是蛋白質(zhì)類成分的通用檢測方法,專屬性不強。

目前動物皮源成分的檢測方法主要為熒光定量聚合酶鏈式反應(PCR)法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等[5-11]。熒光定量PCR法能鑒定馬、牛、豬、駱駝、鹿等皮源材料,實現(xiàn)對動物皮源材料的快速檢測。阿膠是以驢皮熬制而成,經(jīng)過熬制過程的阿膠,其所含動物皮源的DNA大部分被破壞,無法獲取動物皮源中真實的DNA,因此利用PCR法難以實現(xiàn)阿膠的真?zhèn)舞b別。膠原蛋白為不同物種皮的主要成分,經(jīng)高溫熬制后成為不完全水解的肽段,再經(jīng)胰蛋白酶酶切后可形成物種特異性的多肽。質(zhì)譜法主要是通過獲取動物皮源特征肽段的相對分子質(zhì)量信息實現(xiàn)蛋白質(zhì)種類的鑒別[11-15],具有高靈敏度、高準確性、易操作性等優(yōu)點,可用于阿膠的鑒別。

本研究采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UHPLC-MS/MS)引入同位素內(nèi)標建立了阿膠中驢皮源成分的檢測方法,相比于現(xiàn)有檢測方法分析時間短,定量更準確,檢測效率提高,可用于阿膠中驢皮源成分的檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

AB SCIEX Triple Quad 5500超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(AB公司); KQ-300GDV型恒溫數(shù)控超聲器(昆山市超聲儀器有限公司); Vortex-6渦旋振蕩器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司); FW-80高速萬能粉碎機(天津市泰斯特儀器有限公司)。

甲醇、乙腈(色譜純,美國賽默飛公司),甲酸(色譜純,美國ACS恩科化學公司),胰蛋白酶(序列分析純,西格瑪公司),去離子水(18.2 MΩ·cm,由Millipore Mili-Q Advantage超純水系統(tǒng)制得),碳酸氫銨(分析純,國藥集團化學試劑有限公司)。

對照品:驢源多肽A1(C41H68N12O13),純度≥91.5%;驢源多肽A2(C51H82N18O18),純度≥94.2%,購于中國食品藥品檢定研究院。驢源多肽A1同位素內(nèi)標(C41H68N10O13-15N2),純度95.8%;驢源多肽A2同位素內(nèi)標(C51H82N16O18-15N2),純度94.6%,由上海強耀生物有限公司合成。

樣品:阿膠樣品為生產(chǎn)企業(yè)提供及市售樣品,共29批。

1.2 溶液配制

驢源多肽A1、A2標準儲備液(1.0 g/L):準確稱取驢源多肽A1、A2標準品各10 mg(精確至0.1 mg),分別置于10 mL容量瓶中,用1% (1 g/100 mL,下同)碳酸氫銨溶液溶解并定容至刻度,配制成質(zhì)量濃度為1.0 g/L的驢源多肽A1、A2標準儲備液。

驢源多肽A1、A2內(nèi)標標準儲備液(1.0 g/L):配制過程同驢源多肽A1、A2標準儲備液。

混合標準工作溶液(20 mg/L):分別準確吸取驢源多肽A1、A2標準儲備液各200 μL于10 mL容量瓶,用1%碳酸氫銨溶液稀釋至刻度,配制成質(zhì)量濃度為20 mg/L的混合標準工作溶液,臨用現(xiàn)配。

混合內(nèi)標工作溶液(10 mg/L):分別準確吸取驢源多肽A1、A2內(nèi)標標準儲備液各100 μL于10 mL容量瓶中,用1%碳酸氫銨溶液稀釋至刻度,配制成質(zhì)量濃度為10 mg/L混合內(nèi)標工作溶液,臨用現(xiàn)配。

標準曲線工作溶液的配制:分別準確移取混合標準工作溶液適量,分別加入一定量混合內(nèi)標工作溶液,用1%碳酸氫銨溶液稀釋,配制成質(zhì)量濃度為50、100、250、500、1 000、1 250 μg/L的標準工作溶液(內(nèi)標質(zhì)量濃度均為200 μg/L),供UHPLC-MS/MS測定。

胰蛋白酶溶液: 取胰蛋白酶適量,加1%碳酸氫銨溶液溶解,制成每1 mL中含1 mg的溶液。

1.3 樣品前處理

取樣品約10 g,置于粉碎機中粉碎并通過試驗篩(孔徑0.25～0.45 mm),混勻。稱取粉碎好的樣品0.1 g(精確至0.000 1 g),置于50 mL容量瓶中,加1%碳酸氫銨溶液40 mL,超聲處理30 min至樣品完全溶解,加1%碳酸氫銨溶液稀釋至刻度,搖勻。準確吸取1.00 mL于5 mL容量瓶中,加胰蛋白酶溶液1.0 mL,再加入混合內(nèi)標工作溶液100 μL,用1%碳酸氫銨溶液稀釋至刻度,搖勻,置于恒溫箱中,于37 ℃恒溫酶解16 h,取出,冷卻至室溫,經(jīng)0.22 μm濾膜過濾,待上機測定。

1.4 色譜、質(zhì)譜條件

液相色譜條件:色譜柱為Waters XBridge BEH C18(100 mm×2.1 mm, 2.5 μm)。流動相A為0.1%甲酸水溶液,B為0.1%甲酸乙腈溶液,梯度洗脫程序:0～1 min, 10%B; 1～5 min, 10%B～30%B; 5～5.1 min, 30%B～70%B; 5.1～7 min, 70%B; 7～7.1 min, 70%B～10%B; 7.1～10 min, 10%B。流速為0.3 mL/min,柱溫30 ℃,進樣量2 μL。

質(zhì)譜條件:電噴霧離子源(ESI)正離子掃描模式,多反應監(jiān)測;離子源溫度:550 ℃。定性、定量離子對、錐孔電壓、碰撞能量見表1。

表 1 驢源多肽A1、A2的質(zhì)譜采集離子信息

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜柱的選擇

根據(jù)驢源多肽A1、A2的特性,本實驗比較了在不同色譜柱BEH Shiled RP C18(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm)、XBridge BEH C18(100 mm×2.1 mm, 2.5 μm)、BEH C18(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm)上驢源多肽A1、A2的色譜保留行為。結(jié)果表明不同色譜柱上驢源多肽A1、A2的保留時間不同,但均能通過調(diào)節(jié)流動相中有機相的比例,實現(xiàn)驢源多肽A1、A2與基質(zhì)中干擾組分的有效分離?？紤]方法的通用性,推薦使用壓力小的XBridge BEH C18(100 mm×2.1 mm, 2.5 μm)為分析色譜柱。

2.2 流動相的選擇及洗脫條件

選用乙腈-0.1%甲酸水溶液(流動相1)、0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水溶液(流動相2)兩種流動相體系進行試驗。結(jié)果表明,采用流動相2時得到的驢源多肽A1、A2的離子信號要優(yōu)于采用流動相1,這是由于有機相中酸的加入,保證了流動相在梯度變化過程中氫離子濃度的穩(wěn)定性,提高了被分析化合物的離子化效率。因此,本法最終選擇0.1%甲酸乙腈溶液-0.1%甲酸水溶液作為流動相。

通過優(yōu)化流動相的初始比例,使驢源多肽A1、A2的保留時間適中且峰形對稱。驢源多肽A1、A2及其同位素內(nèi)標溶液(50 mg/L)的MRM色譜圖見圖1。

圖 1 特征肽及其同位素內(nèi)標溶液的MRM色譜圖Fig. 1 MRM chromatograms of two marker peptides and their isotope interal standards

2.3 質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化

將驢源多肽A1、A2標準溶液(1 mg/L)通過蠕動泵(流速10 μL/min)進樣,通過一級全掃描找到驢源多肽A1、A2的母離子,再分別以一級母離子通過二級全掃描找到二級碎片離子,并通過不斷改變碰撞能使碎片離子響應增強,通過優(yōu)化獲得最佳離子源參數(shù),確定碎裂電壓及碰撞能量。

2.4 酶解條件的優(yōu)化

采用胰蛋白酶水解阿膠,適宜的酶解溫度為35～40 ℃,根據(jù)該酶的特性及使用說明書,本方法采用酶解溫度為37 ℃。

酶解時間的考察:固定酶解溫度(37 ℃)和酶用量(加胰蛋白酶溶液1.0 mL),考察酶解時間對測定結(jié)果的影響,比較了不同酶解時間(0、1、2、4、6、8、16、24、40 h)產(chǎn)生的驢源多肽A1、A2的峰面積,結(jié)果見圖2。由圖2可以看出,隨著酶解時間的增長,驢源多肽A1、A2的含量逐漸升高,當酶解時間超過16 h以后,結(jié)果趨于穩(wěn)定,說明酶解反應趨于完全,因此本方法選擇酶解時間為16 h。

圖 2 不同酶解時間下監(jiān)測離子的峰面積Fig. 2 Peak areas of monitoring ions at different enzymatic hydrolysis times

酶的用量:固定酶解溫度(37 ℃)和酶解時間(16 h),考察酶的用量對測定結(jié)果的影響,結(jié)果見圖3。由圖3可以看出,在胰蛋白酶質(zhì)量濃度為10 g/L時,酶的用量超過1.0 mL以后,結(jié)果趨于穩(wěn)定,說明當酶的用量為1.0 mL時,足以完全酶解樣品,綜合考慮到成本等問題,本方法選擇酶的用量為1.0 mL。

圖 3 不同酶用量下監(jiān)測離子的峰面積Fig. 3 Peak areas of monitoring ions at different enzyme dosages

2.5 定量方式的確定與基質(zhì)效應評價

采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法進行基質(zhì)復雜樣品分析,其復雜基質(zhì)可能對測定結(jié)果產(chǎn)生影響,因此在方法建立時需對基質(zhì)效應進行評價[16]。本方法測定的目標物為阿膠經(jīng)酶解產(chǎn)生的驢源性多肽,由于無法獲得不含驢源性多肽A1、A2的空白基質(zhì),因此以牛皮膠代替評估基質(zhì)效應[17,18]。取混合標準工作溶液,按1.2節(jié)標準曲線工作溶液的配制過程制備系列純?nèi)軇藴使ぷ魅芤?不含內(nèi)標);取牛皮膠按照1.3節(jié)制得酶解前的樣品溶液,以該溶液配制5倍濃度的系列標準工作溶液(不含內(nèi)標),再按照1.3節(jié)樣品酶解步驟酶解,作為基質(zhì)標準工作溶液,分別繪制標準曲線,按文獻[19]中基質(zhì)效應計算方法對絕對基質(zhì)效應進行評估,結(jié)果顯示驢源多肽A1、驢源多肽A2的絕對基質(zhì)效應分別是37.5%、39.2%,說明基質(zhì)效應強,需要消除或降低基質(zhì)效應。本方法采用同位素內(nèi)標法消除基質(zhì)效應,按上述操作重新繪制標準曲線(含內(nèi)標),再次評估基質(zhì)效應分別為4.9%、5.2%,基質(zhì)效應明顯降低,表明純?nèi)軇藴是€內(nèi)標法可確保定量結(jié)果的準確性。

2.6 標準曲線、線性范圍及定量限

取系列標準溶液進樣,按上述色譜條件測得峰面積,以目標物峰面積與相應內(nèi)標峰面積的比值為縱坐標Y,對照品質(zhì)量濃度為橫坐標X,繪制標準曲線,結(jié)果表明在50～1 250 μg/L范圍內(nèi),線性關(guān)系良好(見表2)。測定的29批樣品中驢源多肽A1的含量為216～414 μg/L,驢源多肽A2的含量為293～357 μg/L,所測試樣濃度均在標準曲線線性范圍內(nèi)。將標準溶液逐級稀釋,以10倍信噪比的峰高對應的質(zhì)量濃度為定量限,均為10 μg/L,折合到阿膠中含量為20 mg/kg(見表2)。

表 2 特征肽的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)(r)及定量限

2.7 穩(wěn)定性研究

為研究驢源多肽A1、A2溶液的穩(wěn)定性,本方法考察了驢源多肽A1、A2標準儲備溶液、標準工作溶液及阿膠經(jīng)酶解產(chǎn)生的驢源多肽A1、A2的穩(wěn)定性。實驗考察了標準儲備溶液在-20 ℃下放置1、3、7、10、15、33天的穩(wěn)定性,結(jié)果表明放置10天時濃度開始下降,因此應注意標準儲備液的使用時間;分別考察了室溫下放置0、1、3、5、7、9、11、14、16、18、20、22、24 h的標準工作溶液(1 000 μg/L)及阿膠經(jīng)酶解后樣品溶液中目標肽段的峰面積變化情況,結(jié)果表明在被考察的24 h內(nèi),驢源多肽A1、A2在標準溶液中峰面積的RSD值分別為3.2%、5.9%,在樣品溶液中峰面積的RSD值分別為6.8%、9.1%,穩(wěn)定性良好。

2.8 回收率

本方法通過向樣品中添加低、中、高3個濃度水平的驢源多肽A1、A2標準溶液,每個水平進行6次平行試驗,計算方法回收率,結(jié)果見表3。驢源多肽A1、A2的回收率范圍為103.2%～108.3%,各濃度水平平行測定結(jié)果的相對標準偏差(RSD)為1.0%～3.0%,完全能夠滿足實際樣品的檢測需求。

表 3 3個水平下的加標回收率及RSD (n=6)

2.9 實際樣品測定

采用本方法對不同生產(chǎn)企業(yè)以及市售阿膠樣品進行測定,得到不同廠家不同工藝共29批次阿膠中驢源多肽A1、A2的含量之和。不同廠家因生產(chǎn)工藝、原料等不同,所測得的食品阿膠中驢源多肽A1、A2的含量之和存在差異,含量為0.096%～0.180%,平均值為0.151%。其中1批試樣中驢源多肽A1、A2含量之和小于0.10%;從6批含量較低的阿膠試樣中,應用本實驗室建立的分析方法[14]檢出豬皮源、馬皮源成分。

3 結(jié)論

本文建立了UHPLC-MS/MS測定阿膠中驢皮源成分含量的方法,考察了酶的用量、酶解時間,進行了基質(zhì)效應評估,采用同位素內(nèi)標法定量,方法準確度高。樣品測定結(jié)果表明不同生產(chǎn)企業(yè)的產(chǎn)品驢源多肽含量差異較大,提示部分生產(chǎn)企業(yè)需改進工藝提升產(chǎn)品品質(zhì)。本方法操作簡便,結(jié)果可靠,重現(xiàn)性好,可用于阿膠中驢皮源成分的測定。