魏秀麗 張志民 張傳津* 李有志 強(qiáng) 莉 郭 騰 王尚明

1.山東省飼料獸藥質(zhì)量檢驗(yàn)中心/山東省畜產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測(cè)與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/動(dòng)物源細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)與精準(zhǔn)化用藥山東省工程實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南250022；2.山東省動(dòng)物用中藥制劑工程實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南250100

龍膽瀉肝散是一種中藥散劑，是由龍膽、梔子、黃芩、柴胡、甘草、當(dāng)歸、車前子等10味藥材粉碎而成的復(fù)方粉末，活性成分主要是龍膽苦苷、梔子苷和黃芩苷；方中以龍膽瀉肝膽經(jīng)實(shí)火，除下焦?jié)駸釣橹魉帲惠o以黃芩、梔子瀉火清熱，助龍膽清肝膽實(shí)火；澤瀉、木通、車前子利尿，引濕熱從尿而出，從而可助龍膽清利肝膽濕熱；然而方中主輔藥皆為苦寒之品，為使其不致苦燥傷陰，并防止肝膽火盛耗傷陰液，故加當(dāng)歸、生地養(yǎng)血益陰以和肝，這樣配伍以達(dá)瀉中有補(bǔ)，使邪去而不傷正，均為佐藥；甘草和中協(xié)調(diào)諸藥；柴胡疏肝膽之氣，并用作引經(jīng)藥，皆為使藥，諸藥合用，而有瀉肝火利濕熱之效。功能主治：瀉肝膽實(shí)火，清三焦?jié)駸?。主治目赤腫痛，淋濁，帶下[1-2]。

在中國(guó)獸藥典2015年版二部等文獻(xiàn)對(duì)龍膽瀉肝散等相關(guān)制劑中龍膽苦苷、梔子苷和黃芩苷均采用高效液相色譜方法[2-14]對(duì)含量進(jìn)行測(cè)定，藥典中檢測(cè)采用梯度洗脫的方式，運(yùn)行時(shí)間長(zhǎng)，流動(dòng)相用量多。本試驗(yàn)開發(fā)了超高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)法（UPLC-PDA）對(duì)3 種主成分進(jìn)行定性鑒別和含量測(cè)定，梯度洗脫所用的時(shí)間縮短90%以上，用來測(cè)定龍膽瀉肝散中3 種主要成分的含量，精準(zhǔn)快捷，綠色環(huán)保。

1 材料與方法

1.1 藥品及試劑

龍膽苦苷對(duì)照品批號(hào)110770-201314，含量99.1%，購自中國(guó)食品藥品檢定研究院；梔子苷對(duì)照品批號(hào)110749-201316，含量97.5%，購自中國(guó)食品藥品檢定研究院；黃芩苷對(duì)照品批號(hào)z0271504，含量96.9%，購自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；磷酸為優(yōu)級(jí)純，甲醇為色譜純；所用水為超純水；龍膽瀉肝散，來自獸藥企業(yè)報(bào)批產(chǎn)品。

1.2 儀 器

Waters 2695 高效液相色譜儀；Waters AcquityTMUltra performance LC 超高效液相色譜儀；二者均購自美國(guó)waters 公司。

1.3 方 法

1）供試品溶液的配制。嚴(yán)格按照中國(guó)獸藥典2015年版二部龍膽瀉肝散質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

2）標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制。精密稱取龍膽苦苷、梔子苷和黃芩苷對(duì)照品適量，按照中國(guó)獸藥典2015年版二部龍膽瀉肝散質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，配制成含黃芩苷200μg/mL、龍膽苦苷160μg/mL 和梔子苷100μg/mL 儲(chǔ)備液。

3）標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制。取適量標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，配制成系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，見表1。

表1 標(biāo)準(zhǔn)工作液各成分濃度 μg/mL

4）色譜操作條件及參數(shù)。色譜柱采用waters公司CSH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相A為甲醇，流動(dòng)相B為0.1%磷酸水溶液，按表2程序進(jìn)行梯度洗脫（甲醇由12%逐步升高到55%，又逐漸下降到12%，均采取6 號(hào)曲線速度變化模式）；采用二極管陣列檢測(cè)器，其掃描范圍為190～400 nm，檢測(cè)波長(zhǎng)選擇254 nm，柱溫選擇35 ℃，進(jìn)樣室溫度10 ℃，流速為0.35 mL/min，進(jìn)樣量為1μL。

5）重復(fù)性試驗(yàn)和精密度試驗(yàn)。精密吸取龍膽苦苷、梔子苷和黃芩苷對(duì)照品儲(chǔ)備溶液，制成含龍膽苦苷40μg/mL、梔子苷25μg/mL 和黃芩苷50μg/mL 的混合對(duì)照品溶液，重復(fù)配制6 份，上機(jī)測(cè)定，計(jì)算3 種成分峰面積RSD。精密吸取上述混合對(duì)照品溶液1 份，重復(fù)進(jìn)樣6 針，計(jì)算3 種成分峰面積RSD。

6）檢測(cè)限和定量限的測(cè)定。對(duì)3種主要成分的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液采用UPLC-PDA 進(jìn)行檢測(cè)分析，并倍比稀釋成多個(gè)不同濃度，以溶液檢測(cè)時(shí)的信噪比S/N≥3時(shí)作為檢測(cè)限，S/N≥10時(shí)作為定量限。

7）不同色譜條件樣品檢測(cè)比較。使用超高效液相色譜儀（流速：0.35 mL/min；進(jìn)樣量：1μL）和高效液相色譜儀（參照中國(guó)獸藥典2015年版二部[1]，流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL）在不同的色譜條件下上機(jī)檢測(cè)，對(duì)同一樣品中龍膽苦苷、梔子苷和黃芩苷的保留時(shí)間、峰面積和含量等參數(shù)分別進(jìn)行比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜分離

在超高效液相色譜中，通過不斷優(yōu)化色譜，測(cè)得龍膽苦苷、梔子苷和黃芩苷色譜峰峰形對(duì)稱，分離度良好，達(dá)到基線分離；在1.3 中4）條件下，龍膽苦苷、梔子苷和黃芩苷對(duì)照品和龍膽瀉肝散樣品，色譜保留時(shí)間分別約為4.9、5.5、9.7 min，分離度均滿足要求。

2.2 線 性

在優(yōu)化的色譜條件下，采用梯度洗脫的方式，快速有效地分離主要成分的色譜峰，龍膽苦苷、梔子苷和黃芩苷的線性良好。龍膽苦苷在16～160 μg/mL范圍內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=3 652.8x+5 218，R2=0.999 4。梔子苷在10～100μg/mL 范圍內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=2 897.6x+2 683.2，R2=0.999 5。黃芩苷在20～200 μg/mL 范圍內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=5 844.5x+521 8，R2=0.999 4。理論塔板數(shù)：龍膽苦苷、梔子苷和黃芩苷均大于7 000，柱效良好。

2.3 重復(fù)性試驗(yàn)和精密度試驗(yàn)

配制含龍膽苦苷40μg/mL、梔子苷25μg/mL 和黃芩苷50 μg/mL 的混合對(duì)照品溶液，重復(fù)配制6份，進(jìn)樣，并計(jì)算龍膽苦苷、梔子苷和黃芩苷其峰面積RSD 分別為0.62%、0.64%、0.57%，完全滿足試驗(yàn)要求。

取含龍膽苦苷40μg/mL、梔子苷25μg/mL 和黃芩苷50 μg/mL 的混合對(duì)照品溶液1 份，重復(fù)進(jìn)樣6次，并計(jì)算龍膽苦苷、梔子苷和黃芩苷其峰面積RSD 分別為0.36%、0.42%、0.55%，完全滿足試驗(yàn)要求。

2.4 檢測(cè)限和定量限

龍膽苦苷8 μg/mL、梔子苷5 μg/mL 和黃芩苷10μg/mL對(duì)照品溶液信噪比≥3定為檢出限，龍膽苦苷16 μg/mL、梔子苷10 μg/mL 和黃芩苷20 μg/mL的對(duì)照品溶液信噪比≥10定為定量限。

2.5 不同色譜條件樣品檢測(cè)結(jié)果的比較

不同色譜條件下3 種化合物保留時(shí)間、理論塔板數(shù)、運(yùn)行時(shí)間等參數(shù)的比較見表3。由表3 可知，使用waters 公司的CSH C18色譜柱保留時(shí)間短，理論塔板數(shù)也高，運(yùn)行時(shí)間短，性能完全滿足檢測(cè)需求。

通過響應(yīng)值比較及光譜圖各成分的最大吸收波長(zhǎng)分別為274.5、240.2、277.5 nm，由于3 種成分的波長(zhǎng)相差較遠(yuǎn)，為了顧及三者化合物的響應(yīng)，依然選擇中國(guó)獸藥典2015年版二部選擇的254 nm 作為含量測(cè)定的檢測(cè)波長(zhǎng)。UPLC 對(duì)照品光譜圖見圖1，HPLC 對(duì)照品光譜圖見圖2；UPLC 對(duì)照品色譜圖見圖3，HPLC對(duì)照品色譜圖見圖4，不同批次的樣品圖見圖5～圖10。保留時(shí)間分別為4.9、5.5、9.7 min，滿足實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)要求。

圖1 龍膽苦苷、梔子苷和黃芩苷對(duì)照品光譜圖（UPLC）

圖2 龍膽苦苷、梔子苷和黃芩苷對(duì)照品光譜圖（HPLC）

圖3 黃芩苷100μg/mL、龍膽苦苷80μg/mL和梔子苷50μg/mL對(duì)照品UPLC色譜圖（1μL）

圖4 黃芩苷100μg/mL、龍膽苦苷80μg/mL和梔子苷50μg/mL對(duì)照品HPLC色譜圖（10μL）

圖5 龍膽瀉肝散1 UPLC 色譜圖（1μL）

2 種試驗(yàn)色譜方法均已通過其方法學(xué)驗(yàn)證，均可以準(zhǔn)確控制其指標(biāo)成分。從檢測(cè)效率和色譜圖上看，本試驗(yàn)優(yōu)選超高效液相色譜法，各色譜圖見圖3～圖10。

圖10 龍膽瀉肝散3 HPLC 色譜圖（10μL）

圖6 龍膽瀉肝散1 HPLC 色譜圖（10μL）

圖7 龍膽瀉肝散2 UPLC 色譜圖（1μL）

圖8 龍膽瀉肝散2 HPLC 色譜圖（10μL）

圖9 龍膽瀉肝散3 UPLC 色譜圖（1μL）

使用waters超高效液相色譜儀和普通高效液相色譜儀，對(duì)同一樣品中3種化合物的含量測(cè)定結(jié)果分別進(jìn)行比較，無顯著差異，相對(duì)偏差均小于1.0%，表明本試驗(yàn)方法結(jié)果精準(zhǔn)可靠，而且簡(jiǎn)單快速（表4）。

3 討 論

3.1 流動(dòng)相的選擇

本研究采用的甲醇和0.1%磷酸水溶液進(jìn)行梯度洗脫，原藥典方法[1]采用的是甲醇和0.2%磷酸水溶液，因?yàn)?.1%磷酸水溶液可以很好地達(dá)到分離要求，為了保護(hù)色譜柱，就選擇了較低濃度的磷酸。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)和流速、柱溫的選擇

本研究將龍膽苦苷、梔子苷和黃芩苷的對(duì)照溶液利用PDA檢測(cè)器采集其光譜圖，在波長(zhǎng)190～400 nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，龍膽苦苷、梔子苷和黃芩苷分別在274.5、240.2、277.5 nm 處有最大吸收，根據(jù)光譜圖的波形變化可以判斷其是否含有主成分。改變色譜柱柱溫33、37 ℃，流速0.35 mL/min不變，保留時(shí)間上下浮動(dòng)0.5 min以內(nèi)；改變流動(dòng)相流速0.34、0.36 mL/min，柱溫35 ℃不變，保留時(shí)間上下浮動(dòng)0.5 min以內(nèi)，均能達(dá)到良好的分離度和精確的含量測(cè)定結(jié)果。色譜柱性能穩(wěn)定，適合本項(xiàng)目3種目標(biāo)化合物龍膽苦苷、梔子苷和黃芩苷含量的測(cè)定。最終選擇254 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)，35 ℃柱溫，不同條件下保留時(shí)間見表5。

3.3 流動(dòng)相流速的比較

超高效液相流動(dòng)相的流速為0.35 mL/min，需要運(yùn)行14 min，每針運(yùn)行需要4.9 mL 流動(dòng)相，而且平衡和沖柱子的時(shí)間也大大縮短，檢測(cè)1 個(gè)樣品大約需要2.5 h；高效液相色譜儀器流速為1.0 mL/min，運(yùn)行時(shí)間1 h，每針運(yùn)行需要60 mL流動(dòng)相，平衡色譜柱和洗脫色譜柱的時(shí)間都很長(zhǎng)（大約各需要1 h），檢測(cè)1 個(gè)樣品大約需要10 h。超高效液相色譜更節(jié)約試驗(yàn)耗材溶劑等，每運(yùn)行1 針節(jié)省55 mL 流動(dòng)相，超高效液相色譜方法產(chǎn)生廢液少，更環(huán)保和快捷。

3.4 本方法與藥典方法的結(jié)果對(duì)比

本試驗(yàn)針對(duì)3個(gè)企業(yè)批次的龍膽瀉肝散進(jìn)行含量檢測(cè)，分別采用超高效液相色譜方法和高效液相色譜方法，龍膽瀉肝散和龍膽苦苷、梔子苷和黃芩苷含量相對(duì)偏差均小于1.0%，2批次合格，1批次不合格。企業(yè)可以根據(jù)快速的檢測(cè)結(jié)果，返工查找不合格的原因，查找是藥材不合格還是混合不均勻等因素導(dǎo)致的。本方法運(yùn)行1針需要14 min，比藥典方法60 min節(jié)約時(shí)間46 min，提高了檢測(cè)效率。本方法高效快速準(zhǔn)確可行。

3.5 結(jié) 論

本研究建立的UPLC-PDA 檢測(cè)法，對(duì)龍膽瀉肝散中3 種主成分龍膽苦苷、梔子苷和黃芩苷進(jìn)行定性鑒別和含量測(cè)定，具備精準(zhǔn)快捷、經(jīng)濟(jì)環(huán)保的特點(diǎn)，能有效控制龍膽瀉肝散的質(zhì)量，可以作為備選內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)方法。