李 穎，任炳臣，韓曉慶，王永紅，趙京梅，李 靜，王海靜，肖 寧，何洪英

（1.邯鄲市中心醫(yī)院 呼吸內(nèi)科一病區(qū)， 河北邯鄲 056001;2 邯鄲市第一醫(yī)院院前急救，河北邯鄲 056002;3.河北省華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科， 河北唐山 063000）

支氣管哮喘（bronchial asthma，BA）的發(fā)生機(jī)制比較復(fù)雜，臨床認(rèn)為是免疫因素、炎癥介質(zhì)等相互作用所致的結(jié)果，而輔助性T 細(xì)胞1/輔助性T 細(xì)胞2（helper T cell 1/helper T cell 2，Th1/Th2）失衡與炎癥介質(zhì)密切相關(guān)[1]。Th1 細(xì)胞能夠分泌干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）、白介素-2（interleukin-2，IL-2）等因子，促使巨噬細(xì)胞活化，對(duì)機(jī)體免疫、炎癥有調(diào)節(jié)作用，Th2 細(xì)胞能夠分泌白介素-4（interleukin-4，IL-4），白介素-13（Interleukin-13，IL-13）等因子，具有促炎作用[2]。通常Th1 和Th2 細(xì)胞處于平衡狀態(tài)，一旦二者失衡，易引起氣道炎癥疾病，以BA 最常見(jiàn)[3]。氣道重塑在哮喘中呈進(jìn)行性發(fā)展，可加重氣道壁形態(tài)異常，致病情進(jìn)展為重度哮喘，隨著哮喘程度加重，對(duì)肺功能的影響也越大[4]。既往對(duì)這類(lèi)患者給予激素治療，但部分病人治療無(wú)效[5]，因此臨床需尋求可靠調(diào)控因子，明確新的干預(yù)靶點(diǎn)。近年來(lái)，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)微小核糖核酸-145（micro ribonucleic acid-145，microRNA-145，簡(jiǎn)稱miR-145）基因可能參與了肺損害氣道高反應(yīng)的病變過(guò)程，與慢性阻塞性肺疾病有關(guān)[6]。而該病和哮喘有諸多相似之處，因此miR-145 可能也參與了哮喘進(jìn)展過(guò)程，但目前哮喘患者miR-145 的表達(dá)水平及其在哮喘發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制尚不清楚，臨床仍需大量研究對(duì)此予以論證，鑒于此，本研究擬探討B(tài)A 患者血清miR-145 表達(dá)水平與肺功能、氣道重塑、Th1/Th2 的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 納入邯鄲市中心醫(yī)院2018年7月～2020年7月收治的BA 患者90 例作為BA 組，另選取同期于邯鄲市中心醫(yī)院體檢的62 例健康志愿者作為健康組。研究方案獲得邯鄲市中心醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①BA 組：滿足中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)分會(huì)哮喘學(xué)組制定的《支氣管哮喘防治指南(2016年版)》中的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[7]，年齡≥18歲；急性發(fā)作期病例；初診病例；能配合完成相關(guān)檢查；精神狀態(tài)、認(rèn)知功能正常；知情同意。②健康組：性別、年齡等基線資料與BA 組匹配；身體健康狀況良好；能配合完成相關(guān)檢查；精神狀態(tài)、認(rèn)知功能正常；知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：因肺炎、肺間質(zhì)性疾病等其他因素所致的喘息、咳嗽等癥狀者；自身免疫性疾病者；惡性腫瘤者；入院前三個(gè)月內(nèi)有激素藥物、解痙平喘治療史者；肝、腎、心等臟器嚴(yán)重受損者；危重癥者。BA 組男性47 例，女性43 例，年齡23～45 歲，平均年齡33.94±8.75 歲；并發(fā)過(guò)敏性鼻炎4 例；并發(fā)過(guò)敏史3 例；體質(zhì)量指數(shù)18～24kg/m2，平均年齡22.15±1.41kg/m2；并發(fā)吸煙史16 例；并發(fā)飲酒史18 例；并發(fā)家族遺傳史15 例。健康組男性34 例，女性28 例，年齡22～48歲，平均年齡31.65±9.02 歲；并發(fā)過(guò)敏性鼻炎1例；并發(fā)過(guò)敏史1 例；體質(zhì)量指數(shù)18～24kg/m2，平均22.89±1.64kg/m2；并發(fā)吸煙史10 例；并發(fā)飲酒史13 例；并發(fā)家族遺傳史9 例。兩組基線資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

1.2 儀器與試劑 主要儀器為高速離心機(jī)（山東博科集團(tuán)，TG-16W），恒溫箱（北京福意電器，F(xiàn)YL-YS-430L）， 熒光PCR 板（Roche 羅氏，4729692001 96 孔板），電泳儀（濟(jì)南來(lái)寶醫(yī)療器械，DYY-6D），紫外分光光度計(jì)（上海屹譜儀器制造有限公司，U-T6A）。主要試劑為T(mén)rizol 試劑盒（無(wú)錫百泰克生物），瓊脂糖（北京中科瑞泰生物）、引物（經(jīng)上海生物工程設(shè)計(jì)）。

1.3 方法 受試者在就診或體檢當(dāng)日，接受相關(guān)檢查與指標(biāo)檢測(cè)。血清miR-145：在受試者空腹?fàn)顟B(tài)下，采集肘靜脈血3ml，行離心處理，時(shí)間為10min，轉(zhuǎn)速3 000r/min，分離血清，存放于-70℃環(huán)境待測(cè)。經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，qRT-PCR）檢測(cè)，利用Trizol 試劑盒提取總RNA，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA 純度，采用Stem-loop 法行miRNA 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，將該反應(yīng)液經(jīng)qRT-PCR 法予以檢測(cè)，擴(kuò)增反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性10min，95℃變性10s、50℃退火50s、72℃延伸30s，共40 個(gè)循環(huán)，以U6作為內(nèi)參引物。引物序列：（1）miR-145：正向引物為5’-CCTCACGGTCCAGTTTTCCC-3’，反向引物為5’-GCAAATCCAGCTGTGAAACCA-3’；（2）U6：正向引物為5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，反向引物為5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’，引物經(jīng)上海生物工程設(shè)計(jì)。待擴(kuò)增反應(yīng)完畢，按照每間隔5s 增加1℃的條件，繼續(xù)加熱至99℃，建熔解曲線，經(jīng)2-△△Ct表示血清miR-145 相對(duì)表達(dá)量。肺功能檢測(cè)：利用涵飛醫(yī)療（上海）S-980A I 肺功能檢測(cè)儀測(cè)定1 秒用力呼氣容積（forced expiratory volume in one second，F(xiàn)EV1），用力肺活量（forced vital capacity，F(xiàn)VC），峰值呼氣流速（peak expiratory flow，PEF），最大呼氣中期流量（maximal mediate expiratory flow 75/25，MMEF75/25）， 并計(jì)算FEV1與FVC 的比值，即FEV1/FVC。氣道重塑指標(biāo)：經(jīng)德國(guó)西門(mén)子Sensation 64 高分辨率CT 進(jìn)行測(cè)定，選用薄層技術(shù)，層間距、層厚均為1.0mm，掃描電壓、矩陣分別為120MV，512×512，通過(guò)骨建法行重塑，受試者均接受深吸氣、深呼氣末屏氣相掃描，各層面取兩個(gè)清晰影像行氣道測(cè)量，各部位取均值作為最終結(jié)果，內(nèi)容包括氣道總面積（total airway crosssectional area，Ao）、氣道腔面積（area of airway，Ai）、氣道外徑（external diameter，D），氣道內(nèi)徑（lumen diameter，L），從而計(jì)算支氣管管壁厚度與外徑比值（airway wall thickness/External diameter，T/D），氣道壁面積占?xì)獾揽偨孛娣e百分比（Percentage of wall area，WA%）。T/D=[（D-L）/2]/D，WA%=（Ao-Ai）/Ao×100%。Th1，Th2，T 細(xì)胞亞群[T cell subsets1（Tc1），T cell subsets2（Tc2）]及IFN-γ，IL-4 檢測(cè)：在受試者空腹下，取4ml 肘靜脈血，分裝于兩管，每管各2ml，一管經(jīng)美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特CytoFLEX 流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血Th1，Th2 細(xì)胞以及Tc1，Tc2 細(xì)胞，另一管行離心處理，2 500 r/min離心15min，離心半徑8cm，取血清存放于低溫冰箱待測(cè)，經(jīng)酶聯(lián)免疫吸附試劑盒（上海仁捷生物）測(cè)定血清IFN-γ，IL-4 水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS23.0 進(jìn)行研究資料分析。觀測(cè)資料中的計(jì)量數(shù)據(jù)，均通過(guò)正態(tài)性檢驗(yàn)，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）描述。兩組間的比較，方差齊同為成組t檢驗(yàn)，方差不齊同為校正t檢驗(yàn)（統(tǒng)計(jì)量為t）。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)及率描述。兩組間比較為卡方檢驗(yàn)或校正卡方檢驗(yàn)（統(tǒng)計(jì)量為χ2）。各指標(biāo)間的相關(guān)分析為Pearson 相關(guān)檢驗(yàn)。統(tǒng)計(jì)推斷的檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清miR-145 表達(dá)水平及肺功能指標(biāo)比較 見(jiàn)表1。BA 組血清miR-145 表達(dá)水平高于健康組，而FEV1，F(xiàn)VC，PEF，MMEF75/25和FEV1/FVC 均低于健康組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

表1 兩組血清miR-145 表達(dá)水平及肺功能指標(biāo)比較（±s）

表1 兩組血清miR-145 表達(dá)水平及肺功能指標(biāo)比較（±s）

項(xiàng) 目BA 組（n=90）健康組（n=62）tP miR-145（2-△△Ct）2.98±0.491.32±0.2527.3800.000 FEV1（L）1.66±0.282.37±0.3114.7040.000 FVC（L）2.65±0.473.38±0.697.7620.000 PEF（L/s）5.34±1.266.45±1.027.2520.000 MMEF75/25（L/s）0.43±0.071.39±0.1256.6960.000 FEV1/FVC（%）62.64±3.9770.12±6.518.0720.000

2.2 兩組氣道重塑指標(biāo)比較 見(jiàn)表2。BA 組D，Ao，T/D，WA%均顯著高于健康組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），兩組L，Ai 比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。

表2 兩組氣道重塑指標(biāo)比較（±s）

表2 兩組氣道重塑指標(biāo)比較（±s）

項(xiàng) 目BA 組（n=90）健康組（n=62）tP L（mm）2.64±0.512.66±0.460.2470.805 D（mm）4.84±0.414.47±0.375.6870.000 Ao（mm2）22.39±5.3514.62±3.6410.6560.000 Ai（mm2）5.43±1.195.01±1.881.5570.123 T/D（%）22.73±0.7120.25±0.6521.8970.000 WA（%）75.75±7.5465.73±6.388.5610.000

2.3 兩組Th1，Th2，Tc1，Tc2 細(xì)胞及血清IFN-γ，IL-4 比較 見(jiàn)表3。BA 組Th1，Th1/Th2，Tc1，Tc1/Tc2 和IFN-γ 均低于健康組，而Th2，Tc2 和IL-4較健康組顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

表3 兩組Th1，Th2，Tc1，Tc2 細(xì)胞及血清IFN-γ，IL-4 比較（±s）

表3 兩組Th1，Th2，Tc1，Tc2 細(xì)胞及血清IFN-γ，IL-4 比較（±s）

項(xiàng) 目BA 組（n=90）健康組（n=62）tP Th1（%）0.50±0.110.79±0.1513.0040.000 Th2（%）0.84±0.270.58±0.128.0540.000 Th1/Th20.59±0.081.36±0.3119.1240.000 Tc1（%）14.04±1.7630.61±6.5722.7990.000 Tc2（%）10.06±3.253.48±0.4515.8220.000 Tc1/Tc21.40±0.328.79±2.7625.1940.000 IFN-γ（pg/ml）19.97±4.4533.43±5.5216.5980.000 IL-4（ng/ml）18.41±4.897.31±1.5420.1340.000

2.4 BA 患者血清miR-145 表達(dá)水平與肺功能、氣道重塑及Th1，Th2，Tc1，Tc2 的相關(guān)性 經(jīng)Pearson 線性相關(guān)分析顯示，血清miR-145 表達(dá)水平與FEV1，F(xiàn)VC，PEF，MMEF75/25，F(xiàn)EV1/FVC，Th1，Th1/Th2，IFN-γ，Tc1 和Tc1/Tc2 呈負(fù)相關(guān)（r=-0.612，-0.403，-0.490，-0.534，-0.558，-0.537，-0.619，-0.591，-0.711 和-0.619， 均P＜0.05）， 而其與D，Ao，T/D，WA%，Th2，IL-4 和Tc2 呈正相關(guān)（r=0.577，0.556，0.416，0.409，0.542，0.508 和0.624，均P＜0.05），血清miR-145與L，Ai無(wú)相關(guān)性（r=0.305，0.319，均P＞0.05）。

3 討論

BA 是由肥大細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、T 淋巴細(xì)胞等多種細(xì)胞因子參與的一種呼吸系統(tǒng)疾病，大部分患者既往有哮喘家族史[8]。研究表明在哮喘發(fā)病過(guò)程中，CD4+T 細(xì)胞發(fā)揮了重要作用，其受抗原刺激后，可分化Th1 和Th2 細(xì)胞亞群，而Th1 和Th2細(xì)胞亞群失衡可能參與了哮喘炎癥的進(jìn)展過(guò)程[9]。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)BA 發(fā)病可能與miRNA 表達(dá)有關(guān)，其可能通過(guò)影響炎癥因子釋放參與BA 的病理改變[10]。哮喘患者伴有明顯的氣道病理改變，具體表現(xiàn)為氣道上皮增厚、支氣管腺體肥大、氣道平滑肌細(xì)胞增殖等，能引起氣道高反應(yīng)[11]。研究認(rèn)為miRNA-145 與氣道高反應(yīng)性發(fā)生有關(guān)，但作用機(jī)制不明確[12]。鑒于此，臨床可考慮觀察BA 患者血清miR-145 表達(dá)水平變化，以便進(jìn)一步了解病情，提出針對(duì)性治療方案。

本結(jié)果顯示BA 患者的血清miR-145 表達(dá)水平增高。炎癥反應(yīng)促進(jìn)了BA 進(jìn)展，例如IL-4，IL-13 等炎癥介質(zhì)大量釋放，能通過(guò)對(duì)B 細(xì)胞進(jìn)行刺激，致抗體免疫球蛋白M 與免疫球蛋白E 生成，加重氣道高反應(yīng)[13]。miR-145 是高度保守的一種miRNA，小鼠實(shí)驗(yàn)[14]提示其能調(diào)控細(xì)胞免疫以及炎癥進(jìn)展，對(duì)IL-1，IL-6 等因子有調(diào)控作用，表明miR-145 可能通過(guò)調(diào)控炎癥因子水平參與疾病進(jìn)展，但該研究發(fā)現(xiàn)miR-145 對(duì)炎癥反應(yīng)有抑制作用，與本次結(jié)論相悖。該研究主要探討miR-145 與動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)系，與本研究所討論的疾病類(lèi)型不同，提示miR-145 在不同疾病中的表達(dá)與作用存在特異性。孫海霞等[15]發(fā)現(xiàn)BA 患者的血清miR-145 表達(dá)水平較體檢者增高，與本次結(jié)論吻合。本研究還提示BA 患者存在肺損害。肺損害在哮喘中較常見(jiàn)，在哮喘發(fā)作過(guò)程中有炎癥介質(zhì)參與，可引起氣道高反應(yīng)，致黏膜充血、氣道分泌物增加，削弱氣道上皮屏障功能，從而致病菌侵襲肺部，導(dǎo)致肺功能下降，哮喘嚴(yán)重程度與肺損害程度、氣道高反應(yīng)嚴(yán)重度密切相關(guān)[16]。因此，臨床必須重視對(duì)BA 患者進(jìn)行肺功能檢測(cè)。

氣道重塑是BA 患者的常見(jiàn)表現(xiàn)，本次結(jié)果提示BA 患者的D，Ao，T/D 和WA%均增高，表明其存在明顯氣道重塑。BA 患者的氣道重塑主要集中于肌層以及外膜氣道壁，可引起形態(tài)學(xué)、組織學(xué)改變，致氣道狹窄，且具有不可逆性，盡早發(fā)現(xiàn)、評(píng)估氣道重塑，對(duì)改善預(yù)后有益。D，Ao，T/D 和WA%是評(píng)估氣道重塑的常用指標(biāo)，其中WA%能對(duì)氣道重構(gòu)給予直觀、準(zhǔn)確判斷，尤其在判斷氣道狹窄中敏感度高，哮喘程度越重，則WA%值越高，D，Ao 和T/D 對(duì)氣道重塑的評(píng)估敏感性均較高，能反映氣道反應(yīng)性程度，氣道反應(yīng)性越重，則D，Ao和T/D 值越高[17]。本研究還發(fā)現(xiàn)BA 患者的Th1/Th2 和Tc1/Tc2 處于失衡狀態(tài)。IL-4 是Th2 和Tc2的生成因子，它可促進(jìn)B 細(xì)胞分化、增殖，有效抑制這類(lèi)細(xì)胞的凋亡，還可對(duì)嗜酸性粒細(xì)胞凋亡進(jìn)行抑制，致該類(lèi)細(xì)胞數(shù)目增多，使炎癥機(jī)制啟動(dòng)，發(fā)揮促炎作用[18]。IFN-γ 則是Th1 和Tc1 的生成因子，它對(duì)Th2 和Tc2 釋放促炎因子有抑制作用，可抑制炎性浸潤(rùn)[19]。一旦Th1，Tc1 細(xì)胞受抑制，Th2，Tc2 細(xì)胞過(guò)度活躍，則會(huì)導(dǎo)致促炎因子大量釋放，而抑炎介質(zhì)的釋放減少，促進(jìn)BA 進(jìn)展。

血清miR-145 表達(dá)水平與FEV1，F(xiàn)VC，PEF，MMEF75/25，F(xiàn)EV1/FVC，Th1，Th1/Th2，IFN-γ，Tc1 和Tc1/Tc2 呈負(fù)相關(guān)，與D，Ao，T/D，WA%，Th2，IL-4 和Tc2 呈正相關(guān)。其中IL-4 過(guò)表達(dá)能使Th2 細(xì)胞直接活化，加重氣道高反應(yīng)與肺損害，而miR-145 能調(diào)控IL-4 的表達(dá)，其過(guò)表達(dá)可致炎癥程度更重，miR-145 過(guò)表達(dá)可能通過(guò)上調(diào)IL-4促進(jìn)BA 患者的肺損害。藍(lán)英等[20]研究提示哮喘患兒的Runt 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子3（RUNX3）mRNA 表達(dá)水平下降。而另有學(xué)者指出，miR-145有促炎作用，Th2 生成的促炎因子能刺激miR-145 表達(dá)，且mi-R145 表達(dá)能通過(guò)靶向調(diào)控RUNX3 而調(diào)節(jié)哮喘病人的Th1/Th2 失衡狀態(tài)，在miR-145 表達(dá)受到抑制后，則可糾正該失衡現(xiàn)象[21]。由此可見(jiàn)，mi-R145 靶向調(diào)節(jié)RUNX3 可能是參與哮喘病情進(jìn)展的重要機(jī)制。Tc2 有促炎作用，Tc1 有炎癥抑制作用，而miR-145與Tc2 作用相似，也具有促炎作用，其可能通過(guò)共同作用，參與BA 患者病情進(jìn)展。

綜上所述，BA 患者的血清miR-145 表達(dá)水平增高，其過(guò)表達(dá)對(duì)患者肺功能、氣道重塑、Th1/Th2 細(xì)胞影響較大，可促進(jìn)Th1/Th2 失衡，臨床可通過(guò)測(cè)定血清miR-145 表達(dá)進(jìn)一步了解BA 患者病情。本研究的局限性為選取樣本較少，且未分析不同BA 嚴(yán)重程度患者血清miR-145 水平的變化，未來(lái)還需增加樣本量，進(jìn)一步分析BA 嚴(yán)重度與miR-145 的關(guān)系，更加深入闡述miR-145 對(duì)BA 的影響。