基于多孔金結(jié)構(gòu)的三相界面酶電極的制備及高效電化學(xué)酶?jìng)鞲行阅?/h1>
2021-10-15 03:50:06張嘉懿丁臻堯王丹丹陳禮平封心建
高等學(xué)校化學(xué)學(xué)報(bào) 2021年10期
張嘉懿，丁臻堯，王丹丹，陳禮平，封心建，2
（1.蘇州大學(xué)材料與化學(xué)化工學(xué)部，2.蘇州大學(xué)化學(xué)科學(xué)國(guó)際合作創(chuàng)新中心,蘇州215123）
開(kāi)發(fā)高性能生物傳感器對(duì)于精準(zhǔn)醫(yī)療和人民健康具有重要意義［1~7］.生物酶因具有專(zhuān)一性好和反應(yīng)條件溫和等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛用于開(kāi)發(fā)酶生物傳感器［8~10］.在天然氧氣的存在下，氧化酶能選擇性地氧化其底物（待測(cè)物），并生成等比例的過(guò)氧化氫，因此通過(guò)電化學(xué)方法測(cè)定酶催化反應(yīng)產(chǎn)物過(guò)氧化氫的生成量即可獲得待測(cè)物的濃度，這也是第一代酶?jìng)鞲衅鞯幕竟ぷ髟恚?1~14］.在酶?jìng)鞲袡z測(cè)中，酶催化反應(yīng)通常發(fā)生在電極/溶液兩相界面，界面反應(yīng)所需的氧氣由溶液提供.在氧化酶量一定的情況下，隨著待測(cè)物濃度的增加，酶催化反應(yīng)對(duì)氧氣的需求量會(huì)逐漸上升，然而受限于溶液中氧氣溶解度低和擴(kuò)散速率慢等缺點(diǎn)，反應(yīng)界面的氧氣無(wú)法得到快速補(bǔ)給，嚴(yán)重限制了酶催化反應(yīng)動(dòng)力學(xué)以及產(chǎn)物過(guò)氧化氫的形成，進(jìn)而限制了酶?jìng)鞲衅鳈z測(cè)的線性范圍以及靈敏度.另外，由于常見(jiàn)待測(cè)溶液中氧氣濃度易波動(dòng)，嚴(yán)重影響了酶催化反應(yīng)的穩(wěn)定性，進(jìn)而限制了酶?jìng)鞲衅鳈z測(cè)的準(zhǔn)確性.
材料的表界面狀態(tài)對(duì)包括酶催化反應(yīng)在內(nèi)的多相催化反應(yīng)有重要的影響［15~17］.自然界中許多生物體的表面（如荷葉）利用特定微納米結(jié)構(gòu)和低表面能物質(zhì)的協(xié)同效應(yīng)而呈現(xiàn)超疏水的性質(zhì)［18~21］.受該特性啟發(fā)，研究者開(kāi)發(fā)了多種具有超疏水性能的人工材料，并廣泛用于自清潔材料［22］、電催化［23~25］以及光電催化［26，27］等物理、生物及化學(xué)研究領(lǐng)域.超疏水材料具較強(qiáng)的憎水/親氣性，當(dāng)其浸入水溶液中時(shí)，會(huì)在液體和固體的界面處形成與大氣連通的穩(wěn)定氣膜，即形成固-液-氣三相共存的界面［28~33］.相比于傳統(tǒng)的固-液兩相界面體系，這一獨(dú)特的三相界面結(jié)構(gòu)使得氣體反應(yīng)物能夠通過(guò)氣相快速傳輸至固-液反應(yīng)界面［34~38］，進(jìn)而大幅提高氣體參與的界面化學(xué)反應(yīng)動(dòng)力學(xué).
本文通過(guò)電沉積法制備三維多孔金結(jié)構(gòu)電極基底，對(duì)其表面進(jìn)行超疏水和親水潤(rùn)濕性調(diào)控，并負(fù)載氧化酶層，構(gòu)建了具有固-液-氣三相界面微環(huán)境的酶電極，實(shí)現(xiàn)了界面氧氣的高濃度穩(wěn)定輸運(yùn)及酶?jìng)鞲行阅艿拇蠓岣?該三相界面酶電極的工作原理如Scheme1所示，當(dāng)該酶電極浸入待測(cè)溶液中時(shí)，會(huì)在超疏水多孔金基底內(nèi)形成與大氣連通的穩(wěn)定氣膜，電子受體氧氣可以通過(guò)氣相傳輸?shù)矫复呋磻?yīng)界面.在氧氣存在下，氧化酶會(huì)選擇性地氧化其底物（待測(cè)物），同時(shí)生成相應(yīng)比例的過(guò)氧化氫.由于氧氣在空氣中的含量遠(yuǎn)高于其在溶液中的溶解氧含量，并且氧氣在氣相中的擴(kuò)散速率比其在液相中高104倍［39］，這使得反應(yīng)界面處的氧氣濃度將從液相依賴(lài)（濃度低且易波動(dòng)）變?yōu)闅庀嘁蕾?lài)（濃度高且穩(wěn)定）.三相界面酶電極的構(gòu)筑將極大提高氧化酶催化反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)及其穩(wěn)定性，進(jìn)而可以大幅提高酶?jìng)鞲衅鳈z測(cè)的線性范圍、靈敏度及準(zhǔn)確性.
Scheme 1 Schematic illustration of the solid?liquid?air triphase enzyme electrode based on a three?dimensional(3D)porous Au substrate
1 實(shí)驗(yàn)部分
1.1 試劑與儀器
1H，1H，2H，2H-全氟辛基三氯硅烷（1H，1H，2H，2H-Perfluorooctyl trichlorosilane，97%，Macklin公司）；三水合四氯金酸（HAuCl4·3H2O，98%，安耐吉化學(xué)公司）；過(guò)氧化氫（H2O2，30%，永華化學(xué)股份有限公司）；D-（+）葡萄糖（C6H12O6，99%）、氯化銨（NH4Cl，99.8%）、環(huán)己烷（C6H12，99.5%）、二水合磷酸二氫鈉（NaH2PO4·2H2O，99%）、無(wú)水磷酸氫二鈉（Na2HPO4，99%）和氯化鉀（KCl，99.5%）（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；實(shí)驗(yàn)室用水為超純水（電阻率≥18.2 MΩ·cm，利用上海和泰儀器有限公司Master-S15純水儀制備）.
CHI 660E型電化學(xué)工作站（上海辰華儀器有限公司）；GVC-2000型離子濺射儀（上海禾早電子科技有限公司）；Evolution220型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（美國(guó)Thermo Fisher公司）；SU8010型掃描電子顯微鏡（日本Hitachi公司）.
1.2 多孔金結(jié)構(gòu)三相界面酶電極的制備
1.2.1 多孔金電極基底的制備參照文獻(xiàn)［40］方法，在10 mmol/L HAuCl4與2.5 mol/L NH4Cl的混合溶液中，以金片為工作電極，鉑絲為對(duì)電極，Ag/AgCl（3 mol/L KCl）為參比電極，采用循環(huán)伏安法，以50 mV/s的掃描速率在+0.8~0 V之間進(jìn)行25次掃描.然后在?2.5 V電位下繼續(xù)沉積一定時(shí)間（0~120 s）.
1.2.2 多孔金基底的超疏水處理在10 mL環(huán)己烷中加入20 μL 1H，1H，2H，2H-全氟辛基三氯硅烷，將上述多孔金基底在該混合液中浸泡2 h，取出后放入120℃烘箱中處理2 h，得到具有超疏水性的多孔金基底.
1.2.3 過(guò)氧化氫電催化劑的沉積使用離子濺射儀在超疏水多孔金表面濺射鉑（Pt）納米顆粒，工作電流為20 mA，濺射時(shí)間為45 s.
1.2.4 葡萄糖氧化酶的負(fù)載取體積為100 μL的葡萄糖氧化酶（GOx）溶液（20 mg/mL），加入50 μL殼聚糖溶液（2 mg/mL，1%的乙酸溶液），再加入45 μL去離子水和5 μL戊二醛溶液（質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%），配制葡萄糖氧化酶-殼聚糖（GOx-Chit）混合液.取不同量的GOx-Chit混合液（體積分別為1，3，5，7，10 μL）滴在沉積了Pt催化劑的多孔金基底表面，室溫下干燥，即獲得三相界面葡萄糖氧化酶電極.
兩相界面酶電極采用了類(lèi)似的構(gòu)筑方法，只是沒(méi)有對(duì)多孔金基底進(jìn)行超疏水處理.
1.3 過(guò)氧化氫生成速率的測(cè)定
在磷酸鹽緩沖溶液（PBS，0.2 mol/L Na2HPO4-NaH2PO4）中加入不同濃度的葡萄糖，將三相界面酶電極浸入溶液，以600 r/min的速度攪拌，10 min后取840 μL反應(yīng)液加入比色皿，依次加入375 μL鄰苯二甲酸氫鉀和375 μL碘化鉀/氫氧化鈉/鉬酸鈉混合液（1.2 mol/L碘化鉀溶液、0.18 mol/L氫氧化鈉溶液和0.3 mmol/L七鉬酸鈉溶液按體積比1∶1∶1混合）.再以500 r/min的速度攪拌5 min后，采用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定混合液的吸光度，并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)過(guò)氧化氫的產(chǎn)量進(jìn)行標(biāo)定.
1.4 電化學(xué)檢測(cè)
在PBS溶液中，以三相界面酶電極為工作電極，鉑絲為對(duì)電極，Ag/AgCl（3 mol/L KCl）電極為參比電極，加入不同濃度的待測(cè)液后，攪拌30 s，靜置10 s后，檢測(cè)相應(yīng)電位下的電流值.
2 結(jié)果與討論
2.1 多孔金基底及三相界面酶電極的結(jié)構(gòu)表征
圖1 （A）和（B）分別為電沉積法制備的多孔金結(jié)構(gòu)的低倍和高倍掃描電子顯微鏡（SEM）照片.從圖中可以看到金膜基底呈三維多孔狀結(jié)構(gòu)，孔洞尺寸約為48~56 μm（圖S1，見(jiàn)本文支持信息），多孔結(jié)構(gòu)是由平均粒徑為43.6 nm的金顆粒組裝而成，多孔膜的厚度約為28.2 μm，且各層孔洞間相互連通（圖S2，見(jiàn)本文支持信息）.這是由于在電沉積過(guò)程中，H+和金離子［Au（III）］在陰極同時(shí)被還原，并產(chǎn)生大量的氫氣.氫氣氣泡在脫離基底過(guò)程中充當(dāng)Au（III）還原的動(dòng)態(tài)模板，從而形成多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu).
Fig.1 SEM images of porous Au substrate and triphase enzyme electrode
圖1 （A）插圖為水滴經(jīng)疏水處理后多孔金表面的光學(xué)照片.水在其表面的接觸角為（151±2）°，表明經(jīng)過(guò)1H，1H，2H，2H-全氟辛基三氯硅烷修飾后的多孔金表面具有超疏水特性.在超疏水多孔金表面進(jìn)一步濺射Pt納米顆粒（過(guò)氧化氫電催化劑，圖S3，見(jiàn)本文支持信息），并通過(guò)X射線光電子能譜進(jìn)行元素分析（圖S4，見(jiàn)本文支持信息）.圖S4（A）為所制電極的元素全譜掃描圖，從圖中可以看出金（Au）和鉑（Pt）元素均存在于電極中.圖S4（B）和（C）分別為Au4f和Pt4f的XPS譜［41］.在濺射Pt納米顆粒的電極表面負(fù)載葡萄糖氧化酶，獲得了三相界面酶電極.圖1（C）和（D）分別為多孔金結(jié)構(gòu)三相界面酶電極的表面和側(cè)面SEM照片，從圖中可見(jiàn)酶層均勻鋪展在多孔金表面，且酶電極表面呈現(xiàn)親水性，水在酶電極表面的接觸角為（35±2）°［圖1（C）插圖］.從圖1（D）中可以看出，多孔金表面覆蓋有酶層，但是底部仍然保持多孔形貌.為了更直觀地表征三相界面，將三相界面酶電極浸泡在羅丹明B（RhB）溶液中，使親水的氧化酶層染色，并通過(guò)激光共聚焦顯微鏡采用層掃模式從上到下間隔1 μm進(jìn)行連續(xù)掃描，收集酶層吸附的RhB染料分子的熒光信號(hào)（圖S5，見(jiàn)本文支持信息）.激光共聚焦顯微鏡由圖S5（A）中的掃描方向自上而下進(jìn)行層掃，得到的掃描圖片如圖S5（B）所示.其中，酶層中心區(qū)域［圖S5（A）中每個(gè)小圖的中間區(qū)域］最初熒光信號(hào)較弱（Layer 1），隨后掃描信號(hào)開(kāi)始逐漸增強(qiáng)（Layers 2和3），最后所選區(qū)域中心的熒光信號(hào)完全消失（Layer 4）.該結(jié)果表明，吸附了RhB分子的酶層只能浸潤(rùn)電極表面，無(wú)法浸潤(rùn)電極內(nèi)部，證明只有電極表面的區(qū)域親水，而內(nèi)部保持疏水.
因此，當(dāng)將該酶電極沒(méi)入待測(cè)溶液中時(shí)，溶液可以浸潤(rùn)頂部的親水酶層，無(wú)法浸潤(rùn)下部疏水的多孔金（圖S6，見(jiàn)本文支持信息），這一獨(dú)特的三相界面酶電極結(jié)構(gòu)使得氧氣可以直接從大氣環(huán)境通過(guò)氣相快速傳輸?shù)窖趸复呋磻?yīng)界面，提高酶催化反應(yīng)速率和穩(wěn)定性，進(jìn)而提高酶?jìng)鞲袡z測(cè)的性能.在傳統(tǒng)固-液兩相界面酶電極的傳感體系中（圖S7，見(jiàn)本文支持信息），氧化酶催化反應(yīng)所需要的氧氣只能通過(guò)液相緩慢且不穩(wěn)定地供給.
2.2 三相界面氧化酶催化性能探究
通過(guò)測(cè)量酶催化反應(yīng)產(chǎn)物過(guò)氧化氫的生成速率，考察了基于三相界面的酶催化活性.通過(guò)碘化法對(duì)酶催化反應(yīng)產(chǎn)物過(guò)氧化氫進(jìn)行顯色，并利用紫外-可見(jiàn)吸收光譜測(cè)量顯色產(chǎn)物的吸光度變化，可以得到酶催化反應(yīng)中過(guò)氧化氫的生成速率.如圖2（A）所示，在三相界面酶催化反應(yīng)體系中，隨著葡萄糖濃度的增加，350 nm處的特征吸收峰位置保持不變，但吸光度逐漸增加，表明過(guò)氧化氫的濃度在逐漸增加.通過(guò)Lambert-Beer定律測(cè)量得到酶電極在特定葡萄糖濃度下一定時(shí)間內(nèi)生成的過(guò)氧化氫量，并計(jì)算得到過(guò)氧化氫的反應(yīng)速率v.圖2（B）中紅色曲線為三相界面復(fù)合電極在0~50 mmol/L葡萄糖濃度范圍內(nèi)所測(cè)得的過(guò)氧化氫生成速率，黑色曲線為兩相界面復(fù)合電極在0~20 mmol/L葡萄糖濃度范圍內(nèi)所測(cè)得的過(guò)氧化氫生成速率，曲線擬合結(jié)果表明三相和兩相界面酶電極的酶催化反應(yīng)均遵循米氏（Michaelis-Menten）動(dòng)力學(xué)模型.基于圖2（B）中過(guò)氧化氫生成速率隨葡萄糖濃度的變化曲線，根據(jù)米氏方程
的雙倒數(shù)變形式
以1/v作對(duì)1/［S］作圖，所得方程的截距即為該催化反應(yīng)的最大反應(yīng)速率vmax，繼而根據(jù)下式
可求得催化反應(yīng)速率常數(shù)kcat.其中，KM（mol/L），［S］（mol/L），v（mol?L?1?min?1），［E］（mol?L?1?min?1）分別為米氏常數(shù)、底物濃度、反應(yīng)速率和酶濃度.由圖2（B）中插圖可知，兩相界面酶電極測(cè)得的動(dòng)力學(xué)參數(shù)為kcat=22.2 min?1，三相界面酶電極測(cè)得的動(dòng)力學(xué)參數(shù)為kcat=600.9 min?1，即三相界面酶催化反應(yīng)速率常數(shù)比兩相界面提高了27倍.這主要是由于三相界面電極在浸入待測(cè)溶液中時(shí)，疏水的多孔金能存儲(chǔ)氧氣，使得氧氣可以直接從氣相傳輸至酶催化反應(yīng)界面，酶催化反應(yīng)所需氧氣能得到迅速補(bǔ)充，進(jìn)而大幅度提高了其反應(yīng)動(dòng)力學(xué).
Fig.2 Oxidase kinetics of triphase and diphase nanoporous Au?based enzyme electrodes
2.3 多孔金結(jié)構(gòu)三相界面酶電極的優(yōu)化
進(jìn)一步研究了不同沉積時(shí)間所制備的多孔金基底對(duì)酶催化反應(yīng)的影響，并對(duì)三相界面酶電極結(jié)構(gòu)進(jìn)行了優(yōu)化.圖3（A）~（F）為沉積不同時(shí)間的多孔金基底的SEM照片，當(dāng)沉積時(shí)間小于30 s時(shí)，金顆粒尚未組裝形成三維多孔結(jié)構(gòu)，厚度為8.3 μm（圖S8，見(jiàn)本文支持信息），表面疏水處理后無(wú)法對(duì)氣體的傳輸起到明顯促進(jìn)作用，因此無(wú)法有效提升酶催化反應(yīng)速率［圖3（G）］.當(dāng)電沉積時(shí)間增加到120 s時(shí)，以電化學(xué)還原持續(xù)產(chǎn)生的氫氣氣泡作為Au（III）還原的模板，可以形成完整的三維孔道結(jié)構(gòu).氣體能通過(guò)疏水處理后的孔道快速傳輸至酶催化反應(yīng)區(qū)域，最終提高酶催化反應(yīng)速率.而當(dāng)沉積時(shí)間繼續(xù)增加至150 s時(shí)，雖然所沉積樣品仍然具有三維多孔結(jié)構(gòu)，但由此制備的三相界面酶催化反應(yīng)速率并沒(méi)有進(jìn)一步增加.這可能是由于氣體傳輸?shù)钠款i問(wèn)題已被克服，更厚的多孔膜不會(huì)再帶來(lái)額外的性能提升.另外還發(fā)現(xiàn)在電沉積過(guò)程中一旦沉積時(shí)間超過(guò)120 s，三維多孔金膜容易從導(dǎo)電基底脫落，不利于后續(xù)酶電極的穩(wěn)定構(gòu)筑.如圖3（G）所示，隨著電沉積多孔金的時(shí)間增加，復(fù)合電極酶催化反應(yīng)產(chǎn)物過(guò)氧化氫在1~50 mmol/L葡萄糖中的生成速率逐漸增大，且電沉積時(shí)間為120 s時(shí)生成速率達(dá)到最大值；繼續(xù)增加電沉積時(shí)間，過(guò)氧化氫的生成速率不再增大.通過(guò)電化學(xué)法測(cè)得不同沉積時(shí)間的多孔金基底對(duì)葡萄糖檢測(cè)的影響，如圖S9所示（見(jiàn)本文支持信息），隨著電沉積多孔金的時(shí)間增加，響應(yīng)電流逐漸增大，且電沉積時(shí)間為120 s時(shí)檢測(cè)電流達(dá)到最大值；繼續(xù)增加電沉積時(shí)間，葡萄糖檢測(cè)電流不再增大，與酶動(dòng)力學(xué)測(cè)試結(jié)果一致.因此選擇沉積時(shí)間120 s作為多孔金電極的最佳電沉積時(shí)間.
Fig.3 SEM images of porous Au substrate electrodeposited at different times(A—F)and oxidase kinetics of triphase enzyme electrode based on these porous substrates(G)
在電沉積時(shí)間為120 s的多孔金基底上對(duì)GOx-chit的用量進(jìn)行了優(yōu)化.如圖S10（見(jiàn)本文支持信息）所示，當(dāng)GOx-chit的用量由1 μL增加到7 μL時(shí)，測(cè)定的酶催化反應(yīng)產(chǎn)物過(guò)氧化氫的生成速率在1~50 mmol/L葡萄糖濃度下逐漸增加，且當(dāng)Gox-chit的用量為7 μL時(shí)，過(guò)氧化氫生成速率達(dá)到最大值；繼續(xù)增加GOx-chit用量至10 μL時(shí)，過(guò)氧化氫生成速率不再改變.因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)將控制GOx-chit用量為7 μL作為酶電極的最佳制備條件.
2.4 三相界面酶電極的傳感檢測(cè)性能
以葡萄糖為模型待測(cè)物，以三相界面酶電極為工作電極研究了其對(duì)葡萄糖的檢測(cè)性能.圖4（A）為三相界面酶電極對(duì)10 mmol/L葡萄糖的線性掃描伏安法（LSV）檢測(cè)曲線.圖中氧化電流隨著檢測(cè)電位的增加而增加，并在+0.4 V下電流開(kāi)始出現(xiàn)平臺(tái)，繼續(xù)增大電位其響應(yīng)電流不再明顯增加，因此選取+0.4 V為后續(xù)葡萄糖檢測(cè)的工作電位.如圖4（B）所示，在檢測(cè)電位為+0.4 V時(shí)，隨著葡萄糖濃度的增加，氧化電流逐漸增大，選擇第8 s讀取的電流值對(duì)底物濃度作圖，得到圖4（C）中的紅色曲線.可見(jiàn)，三相界面酶?jìng)鞲畜w系的線性檢測(cè)范圍可以達(dá)到80 mmol/L（R2=0.99），靈敏度為9.43 μA·mmol?1·L?1，表明該體系對(duì)葡萄糖檢測(cè)具有良好的線性關(guān)系和較寬的線性范圍.
圖4 （C）插圖為兩相界面酶電極體系檢測(cè)葡萄糖的電流-濃度曲線.可以看到其線性檢測(cè)范圍僅為1.6 mmol/L，遠(yuǎn)低于三相界面?zhèn)鞲畜w系.這是由于在傳統(tǒng)固-液兩相界面反應(yīng)體系中，氧氣在溶液中含量低且傳輸速率慢，在高濃度底物的測(cè)試環(huán)境下氧化酶反應(yīng)所需的氧氣無(wú)法得到及時(shí)快速補(bǔ)給，嚴(yán)重抑制了氧化酶的催化活性.相比之下，對(duì)于固-液-氣三相界面酶催化反應(yīng)體系，氧氣能通過(guò)氣相快速供給到反應(yīng)界面，滿足高濃度葡萄糖條件下酶催化反應(yīng)的需要，并產(chǎn)生大量的過(guò)氧化氫.因此，基于多孔金結(jié)構(gòu)三相界面酶電極的傳感體系表現(xiàn)出了較寬的檢測(cè)線性范圍和高的靈敏度.
Fig.4 Detection performance of triphase nanoporous Au biosensor
溶液中氧氣濃度的波動(dòng)對(duì)酶催化反應(yīng)的穩(wěn)定性以及酶電極的檢測(cè)穩(wěn)定性有很大影響.接下來(lái)通過(guò)在溶液中通入氮?dú)庹{(diào)節(jié)溶解氧濃度，考察了酶電極的抗溶解氧濃度波動(dòng)的性能.如圖4（D）中黑色曲線所示，兩相界面酶電極體系的檢測(cè)電流隨著氧濃度的升高而增大，表明氧氣濃度波動(dòng)對(duì)傳統(tǒng)固-液兩相界面酶催化反應(yīng)速率及酶電極響應(yīng)性能有很大的影響，限制了酶電極檢測(cè)的穩(wěn)定性.而同樣如圖4（D）所示，三相界面酶電極在不同溶解氧濃度情況下，對(duì)同一濃度葡萄糖的氧化電流響應(yīng)基本保持穩(wěn)定（紅色曲線），表明三相反應(yīng)界面體系中所需氧氣可以穩(wěn)定地從氣相中得到補(bǔ)充，擺脫了液相溶解氧濃度波動(dòng)而造成的不利影響，從而具有高的檢測(cè)穩(wěn)定性.
最低檢出限是酶電極傳感性能的一項(xiàng)重要指標(biāo)，在檢測(cè)電位為+0.4 V時(shí)，通過(guò)i?t法測(cè)得本文構(gòu)建的三相界面酶?jìng)鞲畜w系對(duì)葡萄糖的檢出限為2 μmol/L［圖S11（A），見(jiàn)本文支持信息］，這表明多孔金結(jié)構(gòu)三相酶電極不僅可以對(duì)高濃度待測(cè)物進(jìn)行檢測(cè)，還可以對(duì)低濃度待測(cè)物進(jìn)行檢測(cè).重現(xiàn)性也是酶?jìng)鞲袡z測(cè)的一項(xiàng)重要指標(biāo).對(duì)同一個(gè)三相界面酶電極在含5 mmol/L葡萄糖的PBS溶液中連續(xù)進(jìn)行150次測(cè)量，考察了其重現(xiàn)性，結(jié)果表明，150次檢測(cè)電流的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差僅為1.0%［圖S11（B）］，表明該三相界面酶電極體系具有良好的重現(xiàn)性.
通過(guò)與已報(bào)道的用于葡萄糖檢測(cè)的酶電極傳感性能進(jìn)行比較（表S1，見(jiàn)本文支持信息）可以看出，傳統(tǒng)固-液兩相界面的酶電極中，由于反應(yīng)物氧氣供給不足，傳感器的檢測(cè)上限較低.本研究引入固-液-氣三相界面，解決了氧氣供給的問(wèn)題，提升了傳感器檢測(cè)的線性范圍，同時(shí)也保證了較高的靈敏度，實(shí)現(xiàn)了高靈敏度和寬線性范圍的葡萄糖檢測(cè).
3 結(jié) 論
采用電沉積法制備了具有三維多孔結(jié)構(gòu)的導(dǎo)電金基底，通過(guò)對(duì)其表面進(jìn)行超疏水和親水潤(rùn)濕性調(diào)控并負(fù)載氧化酶層，構(gòu)建了具有固-液-氣三相界面微環(huán)境的酶電極.三相界面能夠?yàn)槊复呋磻?yīng)所需要的氧氣提供快速的氣相供給通道，使得反應(yīng)界面氧氣濃度從液相依賴(lài)（濃度低且波動(dòng)）變?yōu)闅庀嘁蕾?lài)（濃度高且穩(wěn)定），顯著提高了酶催化反應(yīng)的速率和穩(wěn)定性.基于該三相界面酶電極實(shí)現(xiàn)了對(duì)葡萄糖的寬線性范圍、高靈敏度和高準(zhǔn)確性的檢測(cè).本研究表明反應(yīng)界面微環(huán)境的設(shè)計(jì)和調(diào)控對(duì)提升酶催化反應(yīng)性能以及開(kāi)發(fā)高效酶?jìng)鞲衅骶哂兄匾饬x.
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開(kāi)發(fā)高性能生物傳感器對(duì)于精準(zhǔn)醫(yī)療和人民健康具有重要意義［1~7］.生物酶因具有專(zhuān)一性好和反應(yīng)條件溫和等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛用于開(kāi)發(fā)酶生物傳感器［8~10］.在天然氧氣的存在下，氧化酶能選擇性地氧化其底物（待測(cè)物），并生成等比例的過(guò)氧化氫，因此通過(guò)電化學(xué)方法測(cè)定酶催化反應(yīng)產(chǎn)物過(guò)氧化氫的生成量即可獲得待測(cè)物的濃度，這也是第一代酶?jìng)鞲衅鞯幕竟ぷ髟恚?1~14］.在酶?jìng)鞲袡z測(cè)中，酶催化反應(yīng)通常發(fā)生在電極/溶液兩相界面，界面反應(yīng)所需的氧氣由溶液提供.在氧化酶量一定的情況下，隨著待測(cè)物濃度的增加，酶催化反應(yīng)對(duì)氧氣的需求量會(huì)逐漸上升，然而受限于溶液中氧氣溶解度低和擴(kuò)散速率慢等缺點(diǎn)，反應(yīng)界面的氧氣無(wú)法得到快速補(bǔ)給，嚴(yán)重限制了酶催化反應(yīng)動(dòng)力學(xué)以及產(chǎn)物過(guò)氧化氫的形成，進(jìn)而限制了酶?jìng)鞲衅鳈z測(cè)的線性范圍以及靈敏度.另外，由于常見(jiàn)待測(cè)溶液中氧氣濃度易波動(dòng)，嚴(yán)重影響了酶催化反應(yīng)的穩(wěn)定性，進(jìn)而限制了酶?jìng)鞲衅鳈z測(cè)的準(zhǔn)確性.
材料的表界面狀態(tài)對(duì)包括酶催化反應(yīng)在內(nèi)的多相催化反應(yīng)有重要的影響［15~17］.自然界中許多生物體的表面（如荷葉）利用特定微納米結(jié)構(gòu)和低表面能物質(zhì)的協(xié)同效應(yīng)而呈現(xiàn)超疏水的性質(zhì)［18~21］.受該特性啟發(fā)，研究者開(kāi)發(fā)了多種具有超疏水性能的人工材料，并廣泛用于自清潔材料［22］、電催化［23~25］以及光電催化［26，27］等物理、生物及化學(xué)研究領(lǐng)域.超疏水材料具較強(qiáng)的憎水/親氣性，當(dāng)其浸入水溶液中時(shí)，會(huì)在液體和固體的界面處形成與大氣連通的穩(wěn)定氣膜，即形成固-液-氣三相共存的界面［28~33］.相比于傳統(tǒng)的固-液兩相界面體系，這一獨(dú)特的三相界面結(jié)構(gòu)使得氣體反應(yīng)物能夠通過(guò)氣相快速傳輸至固-液反應(yīng)界面［34~38］，進(jìn)而大幅提高氣體參與的界面化學(xué)反應(yīng)動(dòng)力學(xué).
本文通過(guò)電沉積法制備三維多孔金結(jié)構(gòu)電極基底，對(duì)其表面進(jìn)行超疏水和親水潤(rùn)濕性調(diào)控，并負(fù)載氧化酶層，構(gòu)建了具有固-液-氣三相界面微環(huán)境的酶電極，實(shí)現(xiàn)了界面氧氣的高濃度穩(wěn)定輸運(yùn)及酶?jìng)鞲行阅艿拇蠓岣?該三相界面酶電極的工作原理如Scheme1所示，當(dāng)該酶電極浸入待測(cè)溶液中時(shí)，會(huì)在超疏水多孔金基底內(nèi)形成與大氣連通的穩(wěn)定氣膜，電子受體氧氣可以通過(guò)氣相傳輸?shù)矫复呋磻?yīng)界面.在氧氣存在下，氧化酶會(huì)選擇性地氧化其底物（待測(cè)物），同時(shí)生成相應(yīng)比例的過(guò)氧化氫.由于氧氣在空氣中的含量遠(yuǎn)高于其在溶液中的溶解氧含量，并且氧氣在氣相中的擴(kuò)散速率比其在液相中高104倍［39］，這使得反應(yīng)界面處的氧氣濃度將從液相依賴(lài)（濃度低且易波動(dòng)）變?yōu)闅庀嘁蕾?lài)（濃度高且穩(wěn)定）.三相界面酶電極的構(gòu)筑將極大提高氧化酶催化反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)及其穩(wěn)定性，進(jìn)而可以大幅提高酶?jìng)鞲衅鳈z測(cè)的線性范圍、靈敏度及準(zhǔn)確性.
Scheme 1 Schematic illustration of the solid?liquid?air triphase enzyme electrode based on a three?dimensional(3D)porous Au substrate
1 實(shí)驗(yàn)部分
1.1 試劑與儀器
1H，1H，2H，2H-全氟辛基三氯硅烷（1H，1H，2H，2H-Perfluorooctyl trichlorosilane，97%，Macklin公司）；三水合四氯金酸（HAuCl4·3H2O，98%，安耐吉化學(xué)公司）；過(guò)氧化氫（H2O2，30%，永華化學(xué)股份有限公司）；D-（+）葡萄糖（C6H12O6，99%）、氯化銨（NH4Cl，99.8%）、環(huán)己烷（C6H12，99.5%）、二水合磷酸二氫鈉（NaH2PO4·2H2O，99%）、無(wú)水磷酸氫二鈉（Na2HPO4，99%）和氯化鉀（KCl，99.5%）（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；實(shí)驗(yàn)室用水為超純水（電阻率≥18.2 MΩ·cm，利用上海和泰儀器有限公司Master-S15純水儀制備）.
CHI 660E型電化學(xué)工作站（上海辰華儀器有限公司）；GVC-2000型離子濺射儀（上海禾早電子科技有限公司）；Evolution220型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（美國(guó)Thermo Fisher公司）；SU8010型掃描電子顯微鏡（日本Hitachi公司）.
1.2 多孔金結(jié)構(gòu)三相界面酶電極的制備
1.2.1 多孔金電極基底的制備參照文獻(xiàn)［40］方法，在10 mmol/L HAuCl4與2.5 mol/L NH4Cl的混合溶液中，以金片為工作電極，鉑絲為對(duì)電極，Ag/AgCl（3 mol/L KCl）為參比電極，采用循環(huán)伏安法，以50 mV/s的掃描速率在+0.8~0 V之間進(jìn)行25次掃描.然后在?2.5 V電位下繼續(xù)沉積一定時(shí)間（0~120 s）.
1.2.2 多孔金基底的超疏水處理在10 mL環(huán)己烷中加入20 μL 1H，1H，2H，2H-全氟辛基三氯硅烷，將上述多孔金基底在該混合液中浸泡2 h，取出后放入120℃烘箱中處理2 h，得到具有超疏水性的多孔金基底.
1.2.3 過(guò)氧化氫電催化劑的沉積使用離子濺射儀在超疏水多孔金表面濺射鉑（Pt）納米顆粒，工作電流為20 mA，濺射時(shí)間為45 s.
1.2.4 葡萄糖氧化酶的負(fù)載取體積為100 μL的葡萄糖氧化酶（GOx）溶液（20 mg/mL），加入50 μL殼聚糖溶液（2 mg/mL，1%的乙酸溶液），再加入45 μL去離子水和5 μL戊二醛溶液（質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%），配制葡萄糖氧化酶-殼聚糖（GOx-Chit）混合液.取不同量的GOx-Chit混合液（體積分別為1，3，5，7，10 μL）滴在沉積了Pt催化劑的多孔金基底表面，室溫下干燥，即獲得三相界面葡萄糖氧化酶電極.
兩相界面酶電極采用了類(lèi)似的構(gòu)筑方法，只是沒(méi)有對(duì)多孔金基底進(jìn)行超疏水處理.
1.3 過(guò)氧化氫生成速率的測(cè)定
在磷酸鹽緩沖溶液（PBS，0.2 mol/L Na2HPO4-NaH2PO4）中加入不同濃度的葡萄糖，將三相界面酶電極浸入溶液，以600 r/min的速度攪拌，10 min后取840 μL反應(yīng)液加入比色皿，依次加入375 μL鄰苯二甲酸氫鉀和375 μL碘化鉀/氫氧化鈉/鉬酸鈉混合液（1.2 mol/L碘化鉀溶液、0.18 mol/L氫氧化鈉溶液和0.3 mmol/L七鉬酸鈉溶液按體積比1∶1∶1混合）.再以500 r/min的速度攪拌5 min后，采用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定混合液的吸光度，并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)過(guò)氧化氫的產(chǎn)量進(jìn)行標(biāo)定.
1.4 電化學(xué)檢測(cè)
在PBS溶液中，以三相界面酶電極為工作電極，鉑絲為對(duì)電極，Ag/AgCl（3 mol/L KCl）電極為參比電極，加入不同濃度的待測(cè)液后，攪拌30 s，靜置10 s后，檢測(cè)相應(yīng)電位下的電流值.
2 結(jié)果與討論
2.1 多孔金基底及三相界面酶電極的結(jié)構(gòu)表征
圖1 （A）和（B）分別為電沉積法制備的多孔金結(jié)構(gòu)的低倍和高倍掃描電子顯微鏡（SEM）照片.從圖中可以看到金膜基底呈三維多孔狀結(jié)構(gòu)，孔洞尺寸約為48~56 μm（圖S1，見(jiàn)本文支持信息），多孔結(jié)構(gòu)是由平均粒徑為43.6 nm的金顆粒組裝而成，多孔膜的厚度約為28.2 μm，且各層孔洞間相互連通（圖S2，見(jiàn)本文支持信息）.這是由于在電沉積過(guò)程中，H+和金離子［Au（III）］在陰極同時(shí)被還原，并產(chǎn)生大量的氫氣.氫氣氣泡在脫離基底過(guò)程中充當(dāng)Au（III）還原的動(dòng)態(tài)模板，從而形成多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu).
Fig.1 SEM images of porous Au substrate and triphase enzyme electrode
圖1 （A）插圖為水滴經(jīng)疏水處理后多孔金表面的光學(xué)照片.水在其表面的接觸角為（151±2）°，表明經(jīng)過(guò)1H，1H，2H，2H-全氟辛基三氯硅烷修飾后的多孔金表面具有超疏水特性.在超疏水多孔金表面進(jìn)一步濺射Pt納米顆粒（過(guò)氧化氫電催化劑，圖S3，見(jiàn)本文支持信息），并通過(guò)X射線光電子能譜進(jìn)行元素分析（圖S4，見(jiàn)本文支持信息）.圖S4（A）為所制電極的元素全譜掃描圖，從圖中可以看出金（Au）和鉑（Pt）元素均存在于電極中.圖S4（B）和（C）分別為Au4f和Pt4f的XPS譜［41］.在濺射Pt納米顆粒的電極表面負(fù)載葡萄糖氧化酶，獲得了三相界面酶電極.圖1（C）和（D）分別為多孔金結(jié)構(gòu)三相界面酶電極的表面和側(cè)面SEM照片，從圖中可見(jiàn)酶層均勻鋪展在多孔金表面，且酶電極表面呈現(xiàn)親水性，水在酶電極表面的接觸角為（35±2）°［圖1（C）插圖］.從圖1（D）中可以看出，多孔金表面覆蓋有酶層，但是底部仍然保持多孔形貌.為了更直觀地表征三相界面，將三相界面酶電極浸泡在羅丹明B（RhB）溶液中，使親水的氧化酶層染色，并通過(guò)激光共聚焦顯微鏡采用層掃模式從上到下間隔1 μm進(jìn)行連續(xù)掃描，收集酶層吸附的RhB染料分子的熒光信號(hào)（圖S5，見(jiàn)本文支持信息）.激光共聚焦顯微鏡由圖S5（A）中的掃描方向自上而下進(jìn)行層掃，得到的掃描圖片如圖S5（B）所示.其中，酶層中心區(qū)域［圖S5（A）中每個(gè)小圖的中間區(qū)域］最初熒光信號(hào)較弱（Layer 1），隨后掃描信號(hào)開(kāi)始逐漸增強(qiáng)（Layers 2和3），最后所選區(qū)域中心的熒光信號(hào)完全消失（Layer 4）.該結(jié)果表明，吸附了RhB分子的酶層只能浸潤(rùn)電極表面，無(wú)法浸潤(rùn)電極內(nèi)部，證明只有電極表面的區(qū)域親水，而內(nèi)部保持疏水.
因此，當(dāng)將該酶電極沒(méi)入待測(cè)溶液中時(shí)，溶液可以浸潤(rùn)頂部的親水酶層，無(wú)法浸潤(rùn)下部疏水的多孔金（圖S6，見(jiàn)本文支持信息），這一獨(dú)特的三相界面酶電極結(jié)構(gòu)使得氧氣可以直接從大氣環(huán)境通過(guò)氣相快速傳輸?shù)窖趸复呋磻?yīng)界面，提高酶催化反應(yīng)速率和穩(wěn)定性，進(jìn)而提高酶?jìng)鞲袡z測(cè)的性能.在傳統(tǒng)固-液兩相界面酶電極的傳感體系中（圖S7，見(jiàn)本文支持信息），氧化酶催化反應(yīng)所需要的氧氣只能通過(guò)液相緩慢且不穩(wěn)定地供給.
2.2 三相界面氧化酶催化性能探究
通過(guò)測(cè)量酶催化反應(yīng)產(chǎn)物過(guò)氧化氫的生成速率，考察了基于三相界面的酶催化活性.通過(guò)碘化法對(duì)酶催化反應(yīng)產(chǎn)物過(guò)氧化氫進(jìn)行顯色，并利用紫外-可見(jiàn)吸收光譜測(cè)量顯色產(chǎn)物的吸光度變化，可以得到酶催化反應(yīng)中過(guò)氧化氫的生成速率.如圖2（A）所示，在三相界面酶催化反應(yīng)體系中，隨著葡萄糖濃度的增加，350 nm處的特征吸收峰位置保持不變，但吸光度逐漸增加，表明過(guò)氧化氫的濃度在逐漸增加.通過(guò)Lambert-Beer定律測(cè)量得到酶電極在特定葡萄糖濃度下一定時(shí)間內(nèi)生成的過(guò)氧化氫量，并計(jì)算得到過(guò)氧化氫的反應(yīng)速率v.圖2（B）中紅色曲線為三相界面復(fù)合電極在0~50 mmol/L葡萄糖濃度范圍內(nèi)所測(cè)得的過(guò)氧化氫生成速率，黑色曲線為兩相界面復(fù)合電極在0~20 mmol/L葡萄糖濃度范圍內(nèi)所測(cè)得的過(guò)氧化氫生成速率，曲線擬合結(jié)果表明三相和兩相界面酶電極的酶催化反應(yīng)均遵循米氏（Michaelis-Menten）動(dòng)力學(xué)模型.基于圖2（B）中過(guò)氧化氫生成速率隨葡萄糖濃度的變化曲線，根據(jù)米氏方程
的雙倒數(shù)變形式
以1/v作對(duì)1/［S］作圖，所得方程的截距即為該催化反應(yīng)的最大反應(yīng)速率vmax，繼而根據(jù)下式
可求得催化反應(yīng)速率常數(shù)kcat.其中，KM（mol/L），［S］（mol/L），v（mol?L?1?min?1），［E］（mol?L?1?min?1）分別為米氏常數(shù)、底物濃度、反應(yīng)速率和酶濃度.由圖2（B）中插圖可知，兩相界面酶電極測(cè)得的動(dòng)力學(xué)參數(shù)為kcat=22.2 min?1，三相界面酶電極測(cè)得的動(dòng)力學(xué)參數(shù)為kcat=600.9 min?1，即三相界面酶催化反應(yīng)速率常數(shù)比兩相界面提高了27倍.這主要是由于三相界面電極在浸入待測(cè)溶液中時(shí)，疏水的多孔金能存儲(chǔ)氧氣，使得氧氣可以直接從氣相傳輸至酶催化反應(yīng)界面，酶催化反應(yīng)所需氧氣能得到迅速補(bǔ)充，進(jìn)而大幅度提高了其反應(yīng)動(dòng)力學(xué).
Fig.2 Oxidase kinetics of triphase and diphase nanoporous Au?based enzyme electrodes
2.3 多孔金結(jié)構(gòu)三相界面酶電極的優(yōu)化
進(jìn)一步研究了不同沉積時(shí)間所制備的多孔金基底對(duì)酶催化反應(yīng)的影響，并對(duì)三相界面酶電極結(jié)構(gòu)進(jìn)行了優(yōu)化.圖3（A）~（F）為沉積不同時(shí)間的多孔金基底的SEM照片，當(dāng)沉積時(shí)間小于30 s時(shí)，金顆粒尚未組裝形成三維多孔結(jié)構(gòu)，厚度為8.3 μm（圖S8，見(jiàn)本文支持信息），表面疏水處理后無(wú)法對(duì)氣體的傳輸起到明顯促進(jìn)作用，因此無(wú)法有效提升酶催化反應(yīng)速率［圖3（G）］.當(dāng)電沉積時(shí)間增加到120 s時(shí)，以電化學(xué)還原持續(xù)產(chǎn)生的氫氣氣泡作為Au（III）還原的模板，可以形成完整的三維孔道結(jié)構(gòu).氣體能通過(guò)疏水處理后的孔道快速傳輸至酶催化反應(yīng)區(qū)域，最終提高酶催化反應(yīng)速率.而當(dāng)沉積時(shí)間繼續(xù)增加至150 s時(shí)，雖然所沉積樣品仍然具有三維多孔結(jié)構(gòu)，但由此制備的三相界面酶催化反應(yīng)速率并沒(méi)有進(jìn)一步增加.這可能是由于氣體傳輸?shù)钠款i問(wèn)題已被克服，更厚的多孔膜不會(huì)再帶來(lái)額外的性能提升.另外還發(fā)現(xiàn)在電沉積過(guò)程中一旦沉積時(shí)間超過(guò)120 s，三維多孔金膜容易從導(dǎo)電基底脫落，不利于后續(xù)酶電極的穩(wěn)定構(gòu)筑.如圖3（G）所示，隨著電沉積多孔金的時(shí)間增加，復(fù)合電極酶催化反應(yīng)產(chǎn)物過(guò)氧化氫在1~50 mmol/L葡萄糖中的生成速率逐漸增大，且電沉積時(shí)間為120 s時(shí)生成速率達(dá)到最大值；繼續(xù)增加電沉積時(shí)間，過(guò)氧化氫的生成速率不再增大.通過(guò)電化學(xué)法測(cè)得不同沉積時(shí)間的多孔金基底對(duì)葡萄糖檢測(cè)的影響，如圖S9所示（見(jiàn)本文支持信息），隨著電沉積多孔金的時(shí)間增加，響應(yīng)電流逐漸增大，且電沉積時(shí)間為120 s時(shí)檢測(cè)電流達(dá)到最大值；繼續(xù)增加電沉積時(shí)間，葡萄糖檢測(cè)電流不再增大，與酶動(dòng)力學(xué)測(cè)試結(jié)果一致.因此選擇沉積時(shí)間120 s作為多孔金電極的最佳電沉積時(shí)間.
Fig.3 SEM images of porous Au substrate electrodeposited at different times(A—F)and oxidase kinetics of triphase enzyme electrode based on these porous substrates(G)
在電沉積時(shí)間為120 s的多孔金基底上對(duì)GOx-chit的用量進(jìn)行了優(yōu)化.如圖S10（見(jiàn)本文支持信息）所示，當(dāng)GOx-chit的用量由1 μL增加到7 μL時(shí)，測(cè)定的酶催化反應(yīng)產(chǎn)物過(guò)氧化氫的生成速率在1~50 mmol/L葡萄糖濃度下逐漸增加，且當(dāng)Gox-chit的用量為7 μL時(shí)，過(guò)氧化氫生成速率達(dá)到最大值；繼續(xù)增加GOx-chit用量至10 μL時(shí)，過(guò)氧化氫生成速率不再改變.因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)將控制GOx-chit用量為7 μL作為酶電極的最佳制備條件.
2.4 三相界面酶電極的傳感檢測(cè)性能
以葡萄糖為模型待測(cè)物，以三相界面酶電極為工作電極研究了其對(duì)葡萄糖的檢測(cè)性能.圖4（A）為三相界面酶電極對(duì)10 mmol/L葡萄糖的線性掃描伏安法（LSV）檢測(cè)曲線.圖中氧化電流隨著檢測(cè)電位的增加而增加，并在+0.4 V下電流開(kāi)始出現(xiàn)平臺(tái)，繼續(xù)增大電位其響應(yīng)電流不再明顯增加，因此選取+0.4 V為后續(xù)葡萄糖檢測(cè)的工作電位.如圖4（B）所示，在檢測(cè)電位為+0.4 V時(shí)，隨著葡萄糖濃度的增加，氧化電流逐漸增大，選擇第8 s讀取的電流值對(duì)底物濃度作圖，得到圖4（C）中的紅色曲線.可見(jiàn)，三相界面酶?jìng)鞲畜w系的線性檢測(cè)范圍可以達(dá)到80 mmol/L（R2=0.99），靈敏度為9.43 μA·mmol?1·L?1，表明該體系對(duì)葡萄糖檢測(cè)具有良好的線性關(guān)系和較寬的線性范圍.
圖4 （C）插圖為兩相界面酶電極體系檢測(cè)葡萄糖的電流-濃度曲線.可以看到其線性檢測(cè)范圍僅為1.6 mmol/L，遠(yuǎn)低于三相界面?zhèn)鞲畜w系.這是由于在傳統(tǒng)固-液兩相界面反應(yīng)體系中，氧氣在溶液中含量低且傳輸速率慢，在高濃度底物的測(cè)試環(huán)境下氧化酶反應(yīng)所需的氧氣無(wú)法得到及時(shí)快速補(bǔ)給，嚴(yán)重抑制了氧化酶的催化活性.相比之下，對(duì)于固-液-氣三相界面酶催化反應(yīng)體系，氧氣能通過(guò)氣相快速供給到反應(yīng)界面，滿足高濃度葡萄糖條件下酶催化反應(yīng)的需要，并產(chǎn)生大量的過(guò)氧化氫.因此，基于多孔金結(jié)構(gòu)三相界面酶電極的傳感體系表現(xiàn)出了較寬的檢測(cè)線性范圍和高的靈敏度.
Fig.4 Detection performance of triphase nanoporous Au biosensor
溶液中氧氣濃度的波動(dòng)對(duì)酶催化反應(yīng)的穩(wěn)定性以及酶電極的檢測(cè)穩(wěn)定性有很大影響.接下來(lái)通過(guò)在溶液中通入氮?dú)庹{(diào)節(jié)溶解氧濃度，考察了酶電極的抗溶解氧濃度波動(dòng)的性能.如圖4（D）中黑色曲線所示，兩相界面酶電極體系的檢測(cè)電流隨著氧濃度的升高而增大，表明氧氣濃度波動(dòng)對(duì)傳統(tǒng)固-液兩相界面酶催化反應(yīng)速率及酶電極響應(yīng)性能有很大的影響，限制了酶電極檢測(cè)的穩(wěn)定性.而同樣如圖4（D）所示，三相界面酶電極在不同溶解氧濃度情況下，對(duì)同一濃度葡萄糖的氧化電流響應(yīng)基本保持穩(wěn)定（紅色曲線），表明三相反應(yīng)界面體系中所需氧氣可以穩(wěn)定地從氣相中得到補(bǔ)充，擺脫了液相溶解氧濃度波動(dòng)而造成的不利影響，從而具有高的檢測(cè)穩(wěn)定性.
最低檢出限是酶電極傳感性能的一項(xiàng)重要指標(biāo)，在檢測(cè)電位為+0.4 V時(shí)，通過(guò)i?t法測(cè)得本文構(gòu)建的三相界面酶?jìng)鞲畜w系對(duì)葡萄糖的檢出限為2 μmol/L［圖S11（A），見(jiàn)本文支持信息］，這表明多孔金結(jié)構(gòu)三相酶電極不僅可以對(duì)高濃度待測(cè)物進(jìn)行檢測(cè)，還可以對(duì)低濃度待測(cè)物進(jìn)行檢測(cè).重現(xiàn)性也是酶?jìng)鞲袡z測(cè)的一項(xiàng)重要指標(biāo).對(duì)同一個(gè)三相界面酶電極在含5 mmol/L葡萄糖的PBS溶液中連續(xù)進(jìn)行150次測(cè)量，考察了其重現(xiàn)性，結(jié)果表明，150次檢測(cè)電流的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差僅為1.0%［圖S11（B）］，表明該三相界面酶電極體系具有良好的重現(xiàn)性.
通過(guò)與已報(bào)道的用于葡萄糖檢測(cè)的酶電極傳感性能進(jìn)行比較（表S1，見(jiàn)本文支持信息）可以看出，傳統(tǒng)固-液兩相界面的酶電極中，由于反應(yīng)物氧氣供給不足，傳感器的檢測(cè)上限較低.本研究引入固-液-氣三相界面，解決了氧氣供給的問(wèn)題，提升了傳感器檢測(cè)的線性范圍，同時(shí)也保證了較高的靈敏度，實(shí)現(xiàn)了高靈敏度和寬線性范圍的葡萄糖檢測(cè).
3 結(jié) 論
采用電沉積法制備了具有三維多孔結(jié)構(gòu)的導(dǎo)電金基底，通過(guò)對(duì)其表面進(jìn)行超疏水和親水潤(rùn)濕性調(diào)控并負(fù)載氧化酶層，構(gòu)建了具有固-液-氣三相界面微環(huán)境的酶電極.三相界面能夠?yàn)槊复呋磻?yīng)所需要的氧氣提供快速的氣相供給通道，使得反應(yīng)界面氧氣濃度從液相依賴(lài)（濃度低且波動(dòng)）變?yōu)闅庀嘁蕾?lài)（濃度高且穩(wěn)定），顯著提高了酶催化反應(yīng)的速率和穩(wěn)定性.基于該三相界面酶電極實(shí)現(xiàn)了對(duì)葡萄糖的寬線性范圍、高靈敏度和高準(zhǔn)確性的檢測(cè).本研究表明反應(yīng)界面微環(huán)境的設(shè)計(jì)和調(diào)控對(duì)提升酶催化反應(yīng)性能以及開(kāi)發(fā)高效酶?jìng)鞲衅骶哂兄匾饬x.
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