孟凡立,李明月，洪志鵬，趙洋，王子葉，馮廣慧，王旋，孔丹珣，王莞迪，張玲

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，哈爾濱 150030;2.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院/吉林省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)春 130033）

大豆是重要的糧食和油料作物，也是人類主要食用蛋白和工業(yè)原料來(lái)源，在人類日常飲食結(jié)構(gòu)中占有重要比例，大豆生產(chǎn)對(duì)提高人類營(yíng)養(yǎng)水平和促進(jìn)國(guó)民經(jīng)濟(jì)發(fā)展具有重要意義[1]。東北作為我國(guó)大豆主要種植區(qū)，干旱天氣頻繁發(fā)生，嚴(yán)重影響大豆產(chǎn)量。為解決干旱造成的減產(chǎn)及經(jīng)濟(jì)損失，需培育抗旱大豆品種，擴(kuò)大干旱地區(qū)大豆種植面積，提高大豆單產(chǎn)和總產(chǎn)量。

在干旱脅迫下植物體內(nèi)代謝發(fā)生改變，同時(shí)激活相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)干旱信號(hào)傳遞或調(diào)控下游抗旱基因表達(dá)，可降低不利條件對(duì)植物造成的傷害。研究表明，植物體內(nèi)包含大量轉(zhuǎn)錄因子，應(yīng)激反應(yīng)基因表達(dá)涉及不同轉(zhuǎn)錄調(diào)控途徑，順式作用元件和反式作用因子參與并控制各種生物過(guò)程動(dòng)態(tài)基因網(wǎng)絡(luò)轉(zhuǎn)錄調(diào)控[2]。DREB（Dehydration responsive element binding）類轉(zhuǎn)錄因子成為近年來(lái)植物抗逆境研究熱點(diǎn)后廣受關(guān)注，取得突破性進(jìn)展。

DREB轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)應(yīng)激反應(yīng)基因表達(dá)，在植物非生物脅迫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[3-4]。DREB基因參與的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)十分復(fù)雜，針對(duì)不同逆境脅迫有不同DREB成員參與，不同來(lái)源DREB轉(zhuǎn)基因植物在逆境脅迫下差異表達(dá)的基因也不同[5-6]。DREB轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)與抗逆基因啟動(dòng)子區(qū)域中DRE/CRT（脫水反應(yīng)元件）順式元件結(jié)合，調(diào)節(jié)一系列下游基因（包含DRE/CRT元件），增強(qiáng)植物對(duì)不同非生物脅迫抗性[7-8]。在擬南芥中，DREB1A，DREB1B和DREB1C由低 溫 誘導(dǎo)，DREB2A和DREB2B由干旱、高鹽和高溫脅迫等誘導(dǎo)[9-10]。在陸地棉上，發(fā)現(xiàn)DREB基 因GhDBP3、GhDBP1和GhDBP2參 與ABA脫水反應(yīng)途徑[11]。也有一些DREB基因可同時(shí)響應(yīng)低溫、干旱和高鹽等脅迫，例如，甘薯纖維根中SwDREB1基因?qū)Ω珊?、低溫、高鹽等各種脅迫響應(yīng)[12]。因此，過(guò)表達(dá)DREB轉(zhuǎn)錄因子可顯著提高植物非生物脅迫耐受性。迄今為止，關(guān)于DREB基因報(bào)道和評(píng)論主要集中在DREB基因功能驗(yàn)證，以及在非生物脅迫下各種轉(zhuǎn)基因植物DREB基因調(diào)控機(jī)制的鑒定。TaDREB3A在干旱、高鹽、高溫、低溫、病原菌、ABA、乙烯、JA、SA誘導(dǎo)下表達(dá)，可特異調(diào)控含有DRE/CRT順式元件（核心序列：CC?GAC）基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)，提高植物抗旱性、耐鹽性、耐高溫性以及對(duì)白粉病病原菌抗性[13]。李冬梅等研究表明，TaDREB3a過(guò)表達(dá)可改善干旱條件下轉(zhuǎn)基因大豆生長(zhǎng)狀況[14]。Moon等驗(yàn)證OsDREB1G是水稻中一種新型耐冷脅迫響應(yīng)DREB基因，其過(guò)表達(dá)提高水稻耐冷性[15]。柳娜等研究表明將DREB1A轉(zhuǎn)入小麥品種隴春30顯著增強(qiáng)其抗旱性[16]。

利用基因工程技術(shù)培育大豆新品種，可實(shí)現(xiàn)大豆抗旱高產(chǎn)栽培。本研究將TaDREB3a基因在大豆中表達(dá)后獲得轉(zhuǎn)基因植株KD1，分析獲得轉(zhuǎn)基因大豆株系中目的基因TaDREB3a和標(biāo)記基因bar遺傳穩(wěn)定性、轉(zhuǎn)錄和翻譯，以明確轉(zhuǎn)基因株系遺傳穩(wěn)定性和分子特征；從轉(zhuǎn)基因大豆基因型、耐旱表型和農(nóng)藝性狀等方面研究大豆抗旱性，進(jìn)一步確定TaDREB3a基因與植物抗旱關(guān)系。研究結(jié)果有助于闡明TaDREB3a基因在大豆抗旱中作用，為大豆抗旱分子育種提供新的靶基因。為培育抗旱且環(huán)境安全轉(zhuǎn)基因大豆品種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

轉(zhuǎn)基因大豆株系KD1，受體對(duì)照墾農(nóng)18。大豆受體墾農(nóng)18種子由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆所保存。

1.2 TaDREB3a基因過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建及大豆遺傳轉(zhuǎn)化

從小麥cDNA文庫(kù)中篩選到一個(gè)長(zhǎng)度1 125 bp的TaDREB3a（GenBank登錄號(hào):AY781149.1）cDNA克隆，根據(jù)開放閱讀框設(shè)計(jì)引物（見(jiàn)表1），利用RNA提取試劑盒（康為世紀(jì)生物科技有限公司）提取黑龍江省主栽大豆品種墾農(nóng)18葉片RNA，反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板，利用KOD高保真酶（TOYOBO）作PCR擴(kuò)增并對(duì)其測(cè)序。利用NcoⅠ和BstEⅡ?qū)CAMBIA3301載體雙酶切，然后將TaDREB3a基因片段連接到pCAMBIA3301載體NcoⅠ和BstEⅡ位點(diǎn)，pCAMBIA3301載體本身攜帶抗除草劑（BASTA）基因bar。

根據(jù)Paz等大豆子葉節(jié)遺傳轉(zhuǎn)化方法[17]，將大豆品種墾農(nóng)18用于農(nóng)桿菌LBA4404介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化，然后將再生植株移植到28℃/24℃溫室中，光/暗周期調(diào)整為16 h/8 h，直至成熟。對(duì)13 000個(gè)大豆子葉節(jié)轉(zhuǎn)化，經(jīng)萌發(fā)、共培養(yǎng)、不定芽誘導(dǎo)、不定芽伸長(zhǎng)和生根等轉(zhuǎn)化過(guò)程，獲得25株再生植株，其中13株開花并結(jié)實(shí)，6個(gè)轉(zhuǎn)基因株系試紙條檢測(cè)為陽(yáng)性，將6個(gè)轉(zhuǎn)基因株系T0代種子播種在溫室中，利用bar試紙條檢測(cè)T1代植株，在KD-1、KD-3、KD-9株系T1代中檢出陽(yáng)性株系。KD-1 T1代轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株共收獲203粒種子，將種子量較多KD1株系用于后續(xù)遺傳分析。

1.3 轉(zhuǎn)基因大豆植株KD1分子檢測(cè)

1.3.1 轉(zhuǎn)基因大豆植株KD1的PCR檢測(cè)

對(duì)TaDREB3a和bar基因作PCR檢測(cè)，使用Edwards等開發(fā)DNA提取方法[18]，從轉(zhuǎn)基因植株嫩葉中提取總基因組DNA。根據(jù)TaDREB3a和bar基因序列設(shè)計(jì)引物（見(jiàn)表1），擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度分別為243和238 bp。PCR擴(kuò)增使用2X Taq PCR Master?Mix（天根有限公司），具體方法參見(jiàn)說(shuō)明書。T2~T4代KD1轉(zhuǎn)基因植株均采用上述方法檢測(cè)。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.3.2 轉(zhuǎn)基因大豆植株KD1轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)分析

在東北農(nóng)業(yè)大學(xué)轉(zhuǎn)基因基地種植轉(zhuǎn)基因大豆KD1的T2~T4代材料，選取鼓粒期（R6期）大豆根、葉、莖和籽粒，液氮速凍后保存。總RNA提取采用Trizol法提?。↖nvitrogen），提取總RNA經(jīng)電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量及測(cè)定濃度后，于-80℃保存。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)使用PrimeScript RT試劑盒和gDNA Eraser（TaKaRa），cDNA樣品用于qRT-PCR分析。

1.4 轉(zhuǎn)基因大豆植株KD1蛋白水平表達(dá)分析

利用南京金絲瑞公司制備TaDREB3a蛋白多克隆抗體對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆材料KD1的T2~T4代葉片組織總蛋白作Western blot檢測(cè)。采用8%SDS-PAGE分離樣品總蛋白（包括轉(zhuǎn)基因和受體材料）。分離后蛋白經(jīng)電轉(zhuǎn)后轉(zhuǎn)移至PVDF膜。然后利用脫脂牛奶對(duì)膜上非特異性位點(diǎn)封閉。一抗為鼠抗TaDREB3a蛋白抗血清或鼠抗bar-PAT蛋白單克隆抗體，抗體稀釋至終濃度2.0 μg·mL-1；二抗為辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗鼠抗體，稀釋濃度隨一抗稀釋濃度成倍遞增或遞減。經(jīng)蛋白雜交和洗膜后，使用化學(xué)發(fā)光的蛋白質(zhì)印跡試劑盒中A、B液（1：1）在膜上直接顯色，利用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)開展分析。

1.5 轉(zhuǎn)基因大豆KD1抗旱性鑒定

1.5.1 芽期抗旱性鑒定

將192 g聚乙二醇-6000（PEG-6000）溶解于去離子水中并定容至1 000 mL，配成0.5 MPa的PEG-6000高滲溶液。T3和T4代轉(zhuǎn)基因大豆KD1和受體墾農(nóng)18種子用蒸餾水清洗1 min，0.1%氯化汞溶液浸泡1 min，然后用70%乙醇浸泡1 min，蒸餾水沖洗3遍后，將種子放到濾紙上吸干。每個(gè)處理3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)含種子30粒。將脅迫處理種子置于放有兩層濾紙培養(yǎng)皿（d=15 cm）中，每皿加入10 mL 0.5 MPa PEG-6000高滲溶液，每隔1 d以稱重法補(bǔ)充蒸餾水以維持溶液滲透勢(shì)恒定。將對(duì)照處理種子置于放有兩層濾紙的培養(yǎng)皿（d=15 cm）中，每皿加入10 mL蒸餾水，每隔1 d以稱重法補(bǔ)充蒸餾水以維持溶液滲透勢(shì)恒定。將脅迫和對(duì)照處理的培養(yǎng)皿放入培養(yǎng)箱中，（25±0.5）℃無(wú)光條件下培養(yǎng)，每隔2 d更換濾紙1次，第8天調(diào)查發(fā)芽種子數(shù)。

1.5.2 全生育期抗旱性鑒定

T4代轉(zhuǎn)基因大豆KD1和受體大豆墾農(nóng)18全生育期抗旱性鑒定在旱棚和田間條件下完成。參考北京市地方標(biāo)準(zhǔn)DB11/T 720-2010（大豆品種抗旱性鑒定方法及評(píng)價(jià)）[19]，大豆種植密度為1萬(wàn)~1.2萬(wàn)株·hm-2，試驗(yàn)設(shè)干旱和對(duì)照兩個(gè)處理，隨機(jī)區(qū)組排列，3次重復(fù)，3行區(qū)，行長(zhǎng)3 m，行距0.55 m；在旱棚內(nèi)播種前土壤田間持水量控制在（80±5）%，播種后在第3個(gè)三出復(fù)葉完全展開時(shí)期（V3期）人工補(bǔ)水一次，之后試驗(yàn)地不再人工補(bǔ)水。在旱棚外鄰近試驗(yàn)地設(shè)置對(duì)照試驗(yàn)，田間條件下，對(duì)照試驗(yàn)土壤狀況與旱棚一致且僅接受自然降水，保證大豆全生育期處于水分適宜狀態(tài)，其他管理與脅迫處理一致。每個(gè)小區(qū)測(cè)定10個(gè)單株株高、主莖節(jié)數(shù)、單株莢數(shù)、單株粒數(shù)、單株粒重和單株生物量。

1.6 轉(zhuǎn)基因大豆KD1對(duì)靶標(biāo)和非靶標(biāo)除草劑抗性及耐性鑒定

1.6.1 轉(zhuǎn)基因大豆KD1對(duì)除草劑BASTA抗性穩(wěn)定性鑒定

在東北農(nóng)業(yè)大學(xué)轉(zhuǎn)基因基地種植T2~T4轉(zhuǎn)基因大豆KD1和受體墾農(nóng)18，對(duì)靶標(biāo)除草劑BASTA（主要成分為草丁膦）耐性鑒定于田間完成，轉(zhuǎn)基因大豆幼苗三出復(fù)葉時(shí)噴施靶標(biāo)除草劑BASTA（濃度分別為1 000、2 000、4 000 mg·L-1）。2和4周后調(diào)查轉(zhuǎn)基因大豆耐除草劑情況，計(jì)算受害率。受害率（%）=Σ（N×S/T×M）×100；式中，X-受害率（%），N-同級(jí)受害株數(shù)，S-級(jí)別數(shù)，T-總株數(shù)，M-最高級(jí)別。除草劑藥害癥狀標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表2。

表2 除草劑藥害癥狀分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Grading standards of herbal medicine injury symptoms

1.6.2 轉(zhuǎn)基因大豆KD1對(duì)非靶標(biāo)除草劑抗性及耐性鑒定

在田間鑒定轉(zhuǎn)基因大豆KD1對(duì)非靶標(biāo)除草劑耐受性。以受體大豆墾農(nóng)18為對(duì)照。在東北農(nóng)業(yè)大學(xué)轉(zhuǎn)基因基地播種行長(zhǎng)1 m，播種深度約3 cm，每行播種17粒，播種后按常規(guī)栽培方式管理。選用田間常用非靶標(biāo)除草劑草甘膦、烯禾啶，按照推薦使用劑量1 000、2 000、4 000 mg·L-1濃度噴施，設(shè)清水為對(duì)照，3個(gè)重復(fù)。

噴施2和4周后調(diào)查和記錄成苗率、植株高度（選取最高5株）、藥害癥狀（選取藥害癥狀最輕5株），計(jì)算受害率，利用新復(fù)極差法比較轉(zhuǎn)基因、受體和普通栽培大豆對(duì)常規(guī)非靶標(biāo)除草劑耐受性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)基因大豆植株KD1的PCR檢測(cè)分析

為檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大豆植株，對(duì)連續(xù)3代（T2~T4代）轉(zhuǎn)基因大豆KD1不同單株作PCR檢測(cè)，以含目的基因TaDREB3a質(zhì)粒為陽(yáng)性對(duì)照，以非轉(zhuǎn)化植株墾農(nóng)18和水為陰性對(duì)照，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。PCR結(jié)果如圖1所示，均可檢測(cè)到目的基因TaDREB3a片段，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為243 bp（見(jiàn)圖1），結(jié)果表明外源基因在轉(zhuǎn)基因大豆KD1后代中穩(wěn)定遺傳。對(duì)連續(xù)3代（T2~T4代）轉(zhuǎn)基因大豆KD1不同單株中bar基因作PCR檢測(cè)，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為238 bp（見(jiàn)圖2），結(jié)果表明外源基因TaDREB3a和標(biāo)記基因bar在轉(zhuǎn)基因大豆KD1后代中穩(wěn)定遺傳。

圖1 轉(zhuǎn)基因大豆TaDREB3a基因PCR檢測(cè)Fig.1 PCR detection of TaDREB3a gene in transgenic soybean

圖2 轉(zhuǎn)基因大豆bar基因PCR檢測(cè)Fig.2 PCR detection of bar gene of transgenic soybean

2.2 轉(zhuǎn)基因大豆植株KD1轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)分析

為檢測(cè)整合到基因組上目的基因TaDREB3a和標(biāo)記基因bar在轉(zhuǎn)基因大豆株系KD1中表達(dá)情況，以及在根、莖、葉、籽粒中各組織表達(dá)量差異情況，提取KD1植株鼓粒期（R6期）根、莖、葉、籽粒總RNA，利用qRT-PCR分析轉(zhuǎn)基因大豆KD1 T2~T4代植株根、莖、葉、籽粒中TaDREB3a表達(dá)水平。結(jié)果表明，目的基因TaDREB3a在轉(zhuǎn)基因大豆KD1不同組織中均表達(dá)，在葉片中表達(dá)量相對(duì)較高，籽粒中表達(dá)量相對(duì)較低，TaDREB3a基因在葉片中表達(dá)量為籽粒3倍。連續(xù)三代不同組織中TaDREB3a基因表達(dá)水平分析結(jié)果也表明，TaDREB3a基因在各世代不同組織中穩(wěn)定表達(dá)（見(jiàn)圖3）。

圖3 轉(zhuǎn)基因大豆KD1 T2~T4代鼓粒期不同組織部位TaDREB3a基因表達(dá)水平Fig.3 TaDREB3a gene expression levels in different tissues of transgenic soybean KD1 T2-T4 at the seed filling period

利用qRT-PCR分析轉(zhuǎn)基因大豆KD1 T2～T4代植株根、莖、葉、籽粒中bar基因表達(dá)水平，分析結(jié)果表明，標(biāo)記基因bar在轉(zhuǎn)基因大豆KD1不同組織中均表達(dá)，在根和葉片中表達(dá)量相對(duì)較高，bar基因在葉片中表達(dá)量是籽粒3倍，在根中表達(dá)量是籽粒2倍。連續(xù)三代不同組織bar基因表達(dá)水平分析結(jié)果也表明，bar基因在各世代不同組織中穩(wěn)定表達(dá)（見(jiàn)圖4）。

圖4 轉(zhuǎn)基因大豆KD1 T2~T4代鼓粒期不同組織部位bar基因表達(dá)水平Fig.4 bar gene expression levels in different tissues of transgenic soybean KD1 T2-T4 generation at the seed filling period

2.3 轉(zhuǎn)基因株系KD1中TaDREB3a和bar蛋白表達(dá)分析

2.3.1 TaDREB3a蛋白表達(dá)量分析

Western blot檢測(cè)結(jié)果表明，外源蛋白TaDREB3a在轉(zhuǎn)基因大豆KD1中獲得表達(dá)，約為43 ku，與預(yù)期一致。在轉(zhuǎn)基因材料KD1不同世代（T2~T4）中均檢測(cè)到TaDREB3a蛋白（見(jiàn)圖5），表明外源TaDREB3a蛋白在轉(zhuǎn)基因材料后代中穩(wěn)定表達(dá)并遺傳。

圖5 轉(zhuǎn)基因大豆TaDREB3a蛋白檢測(cè)Fig.5 Detection of TaDREB3a protein in transgenic soybeans

2.3.2 bar蛋白表達(dá)量分析

為進(jìn)一步分析轉(zhuǎn)化的標(biāo)記基因bar是否翻譯成蛋白質(zhì)，對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆材料KD1的T2~T4代葉片組織總蛋白作Western blot檢測(cè)。結(jié)果表明，在轉(zhuǎn)基因材料KD1不同世代（T2~T4）葉片組織中均檢測(cè)到21 ku蛋白條帶，與預(yù)期一致，而受體墾農(nóng)18未檢測(cè)到21 ku蛋白條帶（見(jiàn)圖6），說(shuō)明bar蛋白可在轉(zhuǎn)基因材料后代中穩(wěn)定表達(dá)。

圖6 轉(zhuǎn)基因大豆KD1 bar蛋白Western blot檢測(cè)Fig.6 Western blot detection of KD1 bar protein in transgenic soybeans

2.4 轉(zhuǎn)基因大豆KD1抗旱性鑒定

2.4.1 芽期抗旱性鑒定

對(duì)T3和T4代轉(zhuǎn)基因大豆作芽期抗旱性鑒定，利用0.5 MPa PEG-6000高滲溶液處理7 d后，轉(zhuǎn)基因材料KD1種子萌發(fā)較好，其相對(duì)發(fā)芽率為88%~90%，受體大豆墾農(nóng)18相對(duì)發(fā)芽率為10%，轉(zhuǎn)基因材料KD1發(fā)芽率顯著高于對(duì)照受體材料（見(jiàn)圖7），連續(xù)2代芽期抗旱性鑒定結(jié)果表明，T3和T4代KD1芽期抗旱性均為較耐，且芽期抗旱性狀穩(wěn)定遺傳。

圖7 T3~T4代轉(zhuǎn)基因大豆KD1芽期抗旱性鑒定Fig.7 T3-T4 generation transgenic soybean KD1 drought resistance identification at the bud stage

2.4.2 全生育期抗旱性鑒定

在東北農(nóng)業(yè)大學(xué)轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)基地抗旱棚內(nèi)對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆KD1和對(duì)照墾農(nóng)18開展田間抗旱脅迫處理，觀察轉(zhuǎn)基因大豆與受體之間生長(zhǎng)情況。在田間僅接受自然降水狀態(tài)下，T4代轉(zhuǎn)基因大豆KD1和受體大豆墾農(nóng)18株高、節(jié)數(shù)、單株莢數(shù)、每株粒數(shù)以及百粒重均無(wú)顯著差異（見(jiàn)表3）；在干旱脅迫下，轉(zhuǎn)基因大豆和受體大豆株高、節(jié)數(shù)、單株莢數(shù)、單株粒數(shù)明顯減少，兩者間存在顯著差異，轉(zhuǎn)基因大豆株高、單株莢數(shù)、單株粒數(shù)、百粒重明顯高于受體大豆墾農(nóng)18（見(jiàn)表3）。

表3 全生育期干旱農(nóng)藝性狀Table 3 Agronomic traits of drought throughout the growth period

2.5 轉(zhuǎn)基因大豆KD1對(duì)靶標(biāo)除草劑抗性及耐性鑒定

2.5.1 轉(zhuǎn)基因大豆KD1對(duì)除草劑BASTA抗性穩(wěn)定性鑒定

對(duì)KD1轉(zhuǎn)基因材料T2~T4代材料在苗期田間噴施除草劑BASTA（1 500 mg·L-1BASTA，主要成分為草丁膦）抗性檢測(cè)，田間除草劑抗性篩選結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因材料KD1對(duì)除草劑1 500 mg·L-1BASTA具有較好耐受性，而受體品種墾農(nóng)18葉片則全部黃化壞死（見(jiàn)圖8）。連續(xù)3代（T2~T4）田間除草劑抗性篩選結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因大豆KD1對(duì)除草劑1 500 mg·L-1BASTA耐受性較好，表明外源基因bar在轉(zhuǎn)基因大豆中可穩(wěn)定表達(dá)（見(jiàn)圖8）。

圖8 轉(zhuǎn)基因大豆KD1除草劑（1 500 mg·L-1 BASTA）抗性檢測(cè)Fig.8 KD1 herbicide(1 500 mg·L-1 BASTA)resistance test of genetically modified soybean

2.5.2 轉(zhuǎn)基因大豆KD1對(duì)靶標(biāo)除草劑耐性鑒定

利用1 000、2 000和4 000 mg·L-1BASTA噴施轉(zhuǎn)基因大豆KD1和受體墾農(nóng)18葉面。噴施除草劑BASTA 2周后，受體品種墾農(nóng)18葉片枯黃，其生長(zhǎng)發(fā)育受嚴(yán)重影響。4周后，受體墾農(nóng)18植株全部死亡。而轉(zhuǎn)基因大豆KD1在3種濃度BASTA葉面噴灑2和4周后，葉片表型均正常，植株正常生長(zhǎng)發(fā)育，與清水對(duì)照處理相同。上述試驗(yàn)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因大豆KD1對(duì)1 000、2 000和4 000 mg·L-1BASTA均具有較好耐受性（見(jiàn)表4和圖9）。

圖9 轉(zhuǎn)基因大豆KD1對(duì)靶標(biāo)除草劑BASTA耐性鑒定（4 000 mg·L-1）Fig.9 Identification of the resistance of transgenic soybean KD1 to the target herbicide BASTA

表4 轉(zhuǎn)基因大豆KD1對(duì)靶標(biāo)除草劑BASTA耐性鑒定Table 4 Identification of the tolerance of genetically modified soybean KD1 to the target herbicide BASTA

2.6 轉(zhuǎn)基因大豆KD1對(duì)非靶標(biāo)除草劑耐受性分析

利用滅生性除草劑草甘膦和大豆苗后除草劑烯禾啶分別噴施轉(zhuǎn)基因大豆KD1和受體墾農(nóng)18。500、1 000和2 000 mg·L-1草甘膦噴施轉(zhuǎn)基因大豆KD1和受體墾農(nóng)18兩周后，轉(zhuǎn)基因大豆KD1和受體墾農(nóng)18全部死亡。表明滅生性除草劑草甘膦可全部殺死轉(zhuǎn)基因大豆KD1和受體墾農(nóng)18。

利用專殺禾本科雜草的烯禾啶噴施轉(zhuǎn)基因大豆KD1和受體墾農(nóng)18四周后，轉(zhuǎn)基因大豆KD1和受體墾農(nóng)18受害率為0，且3種濃度烯禾啶對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆KD1和受體墾農(nóng)18株高無(wú)顯著影響（見(jiàn)表5和6）。

表5 KD1對(duì)草甘膦耐受性鑒定Table 5 KD1 to glyphosate tolerance identification

表6 KD1對(duì)烯禾啶耐受性鑒定Table 6 KD1 tolerant identification of enoxydim

3 討論與結(jié)論

在全球氣候變化影響下，農(nóng)作物在生長(zhǎng)過(guò)程中不可避免面臨許多非生物脅迫因素，對(duì)其生長(zhǎng)和整體生產(chǎn)力造成嚴(yán)重威脅。其中，干旱被認(rèn)為是嚴(yán)重脅迫源，影響作物產(chǎn)量穩(wěn)定性[20]?，F(xiàn)代生物技術(shù)打破生物之間界限實(shí)現(xiàn)遺傳物質(zhì)重新組合，按照人類預(yù)先設(shè)計(jì)改造生物，改善大豆抗旱性，提高大豆產(chǎn)量。通過(guò)將抗旱基因?qū)朐耘啻蠖蛊贩N，提高大豆抗旱能力，培育出具有高抗旱特性大豆新品種，產(chǎn)生巨大社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益。

轉(zhuǎn)基因育種最終目標(biāo)是在改良目標(biāo)性狀前提下，盡量不影響作物其他品質(zhì)和產(chǎn)量性狀，或提升作物品質(zhì)和產(chǎn)量性狀。但研究結(jié)果表明，表達(dá)外源基因改變轉(zhuǎn)基因作物目標(biāo)性狀，影響轉(zhuǎn)基因作物其他性狀。例如，林茹等分析GmMYB12B轉(zhuǎn)基因大豆株系和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓贽r(nóng)藝性狀[21]，轉(zhuǎn)GmMYB12B基因大豆除增強(qiáng)抗旱性，受到干旱脅迫后轉(zhuǎn)基因大豆株系和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓晗啾?，主根更長(zhǎng)側(cè)根更多。樊超等將抗旱相關(guān)基因GsSA?MS轉(zhuǎn)入大豆植株與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ障啾让黠@提高其抗旱性，且5個(gè)轉(zhuǎn)基因株系農(nóng)藝性狀無(wú)顯著變化，說(shuō)明轉(zhuǎn)GsSAMS基因?qū)r(nóng)藝性狀未產(chǎn)生影響[22]。

本研究調(diào)查T4代轉(zhuǎn)TaDREB3a基因KD1株系與受體墾農(nóng)18性狀。對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆材料KD1抗旱性分析表明，轉(zhuǎn)基因材料KD1種子相對(duì)發(fā)芽率顯著高于對(duì)照受體材料。對(duì)KD1表型和綜合農(nóng)藝性狀評(píng)價(jià)表明，在田間自然狀態(tài)下，轉(zhuǎn)基因大豆KD1和受體大豆墾農(nóng)18株高、節(jié)數(shù)、單株莢數(shù)、每株粒數(shù)以及百粒重均無(wú)顯著差異，但在干旱脅迫下，轉(zhuǎn)基因大豆株高、單株莢數(shù)、單株粒數(shù)、百粒重明顯高于受體大豆墾農(nóng)18。用不同濃度靶標(biāo)及非靶標(biāo)除草劑噴施轉(zhuǎn)基因大豆KD1和受體墾農(nóng)18，4周后轉(zhuǎn)基因大豆KD1和受體墾農(nóng)18表型和株高無(wú)顯著差異。因此，本研究證明外源基因TaDREB3a和標(biāo)記基因bar在轉(zhuǎn)基因大豆KD1葉、莖、根和籽粒中均轉(zhuǎn)錄和翻譯，TaDREB3a基因在葉片和根中轉(zhuǎn)錄水平較高，TaDREB3a基因在受體植株墾農(nóng)18中正常表達(dá)可提高目標(biāo)性狀抗旱性。轉(zhuǎn)基因大豆KD1對(duì)靶標(biāo)除草劑BASTA抗性良好，對(duì)非靶標(biāo)除草劑草甘膦和烯禾啶耐受性與受體墾農(nóng)18相比無(wú)顯著差異，對(duì)株高無(wú)影響。TaDREB3a基因在大豆墾農(nóng)18中表達(dá)可提高目標(biāo)性狀抗旱性，不改變靶標(biāo)及非靶標(biāo)除草劑性狀。李冬梅等研究表明轉(zhuǎn)TaDREB3a基因大豆在復(fù)雜的大田干旱條件下主要農(nóng)藝性狀，包括株高、分支數(shù)、節(jié)數(shù)、莢數(shù)、粒數(shù)、百粒重及單株粒重均明顯優(yōu)于對(duì)照組大豆東農(nóng)50[14]，說(shuō)明干旱條件下，轉(zhuǎn)TaDREB3a基因可提高受體抗旱性，從而提高作物產(chǎn)量性狀。當(dāng)肥水多時(shí)，耐旱品種是否耐澇應(yīng)通過(guò)相關(guān)試驗(yàn)加以驗(yàn)證，也需綜合評(píng)估DREB轉(zhuǎn)基因大豆在田間條件下單個(gè)或多個(gè)脅迫后耐受性和產(chǎn)量潛力，以便進(jìn)一步大規(guī)模栽培DREB轉(zhuǎn)基因大豆。