杜志強(qiáng)，丁 然，趙素娟，陳耀峰，王守志

（1.長(zhǎng)江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，哈爾濱 150030）

動(dòng)物肉類產(chǎn)品是人類獲取蛋白重要來源。隨著國(guó)民經(jīng)濟(jì)發(fā)展，人民生活水平進(jìn)一步提高，消費(fèi)者對(duì)肉類口感、色澤、風(fēng)味、嫩度等品質(zhì)要求逐漸提高。肌內(nèi)脂肪（Intramuscular fat,IMF）是指肌纖維間或肌細(xì)胞內(nèi)部積累的脂肪，作為脂肪沉積重要形式之一，與肌肉嫩度直接相關(guān)[1]。肌內(nèi)脂肪可提高肌肉系水力，通過降低烹飪中水損失，提高肉質(zhì)嫩度[2]。同時(shí)，IMF對(duì)肌肉剪切力和風(fēng)味產(chǎn)生重要影響[3]。近年來，通過改善飼料營(yíng)養(yǎng)成分，分子遺傳標(biāo)記和遺傳選育等手段成功降低動(dòng)物腹脂率，但肌肉中IMF隨之降低，極大程度影響肉制品品質(zhì)[4]。因此，合理調(diào)節(jié)IMF含量，改善肉質(zhì)品品質(zhì)成為研究熱點(diǎn)。

IMF分為兩種，在肌肉細(xì)胞內(nèi)由甘油三酯形成的脂滴，稱為肌內(nèi)三酰甘油（IMTGs）；分布在肌肉間質(zhì)或周圍肌束中的脂肪細(xì)胞，稱為肌肉內(nèi)脂肪組織（IMAT）[5]。IMTGs含量?jī)H占IMF總TGs含量5%~20%，對(duì)于肉質(zhì)有重要影響[6]。過度補(bǔ)充包括脂肪酸、氨基酸、葡萄糖在內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，是導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)脂肪沉積重要因素之一[7]。脂肪酸和葡萄糖影響脂質(zhì)代謝及脂肪沉積相關(guān)研究較多，氨基酸在脂肪沉積中作用研究甚少。

氨基酸是蛋白質(zhì)組成成分，以游離形式儲(chǔ)存于動(dòng)物體內(nèi)，起營(yíng)養(yǎng)、感官和生物調(diào)節(jié)等作用。越來越多證據(jù)表明，支鏈氨基酸（Branched-chain amino acids，BCAAs）在脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)中起重要作用[8]，同肥胖及代謝紊亂相關(guān)。血漿中BCAAs濃度被認(rèn)定為脂質(zhì)代謝穩(wěn)態(tài)重要特征之一[9]。BCAAs包括亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸（Valine），均為哺乳動(dòng)物必需氨基酸。BCAAs可通過自身分解代謝，促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化及脂肪合成[10]。飲食剝奪BCAAs對(duì)降低小鼠腹部脂肪量具有重要影響[11]。當(dāng)飲食中缺乏支鏈氨基酸，尤其是纈氨酸時(shí)，小鼠腹部脂肪沉積急劇減少[12]；補(bǔ)充纈氨酸后小鼠血液中循環(huán)脂肪酸水平顯著上升[13]。在豬乳腺上皮細(xì)胞中，纈氨酸可通過上調(diào)AKT/mTOR/SREBP-1c信號(hào)通路相關(guān)蛋白，增加與脂肪酸合成和細(xì)胞內(nèi)TGs含量相關(guān)蛋白表達(dá)[14]。目前支鏈氨基酸研究日益增多，但對(duì)纈氨酸促進(jìn)肌肉細(xì)胞脂肪沉積研究較少，對(duì)其促進(jìn)肌肉細(xì)胞脂肪沉積具體分子機(jī)制尚不明確，有待進(jìn)一步探究。

C2C12細(xì)胞具備良好雙向分化潛能，既可成脂分化，也可成肌分化形成肌管，是研究脂肪沉積的優(yōu)良模型。目前，在肥胖、高血脂、胰島素抵抗和肝脂肪變性等代謝疾病及體外代謝相關(guān)方向研究廣泛[16]。本試驗(yàn)使用不同濃度纈氨酸處理C2C12細(xì)胞，通過蛋白免疫印跡試驗(yàn)檢測(cè)相關(guān)信號(hào)通路蛋白表達(dá)與成熟，油紅O染色檢測(cè)C2C12細(xì)胞內(nèi)脂滴沉積、CCK8試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，探究纈氨酸是否具備影響肌肉細(xì)胞脂肪沉積能力及其潛在機(jī)制，為合理調(diào)節(jié)畜禽肌肉脂肪含量提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

儀器：CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thremo，美國(guó)），SW-CJ-IFD無(wú)菌操作臺(tái)（安泰，蘇州），四度立式展示柜（SC228，海爾，青島），全波長(zhǎng)酶標(biāo)分析儀（Thermo，美國(guó)），熒光倒置顯微鏡（DFC280，Lei?ca，德國(guó)）。

試劑：L-纈氨酸（純度>99%）（Solarbio，北京），胎牛血清（FB25015，Gibco，美國(guó)），DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)基（C11330500bt，Gibco，美國(guó)），PBS（P1020-500,Hyclone,美國(guó)），OPTI-MEM（31985070，Gibco，美國(guó)），SDS-PAGE凝膠試劑盒（P0012A，碧云天，中國(guó)），SREBP-1c抗體（14088-1-AP，Proteintech，美國(guó)）,β-actin抗體（sc-47778，Cell Signaling Technology，美國(guó)），軟脂酸（P101061-5g，阿拉丁，上海），CCK8-Kit（BS350B，Biosharp，北京），蛋白濃度測(cè)定試劑盒（P0012S，碧云天，北京），油紅O染料（Biosharp，北京）。

C2C12細(xì)胞：試驗(yàn)中小鼠成肌細(xì)胞系為商品化細(xì)胞系，購(gòu)自武漢普賽諾生命科技有限公司（CL-0044）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞復(fù)蘇后置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中。密度長(zhǎng)至25 mm2培養(yǎng)瓶底80%左右時(shí)，用PBS沖洗兩次棄廢液。加入500 μL胰蛋白酶于37℃消化50~70 s，細(xì)胞呈流沙狀后加入適量預(yù)配全培養(yǎng)基（加入5%胎牛血清，1%雙抗并過濾除菌的DMEM/F12）。將細(xì)胞懸液混勻后于適當(dāng)密度平鋪在細(xì)胞培養(yǎng)瓶或六孔板中，置于培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.3 纈氨酸處理C2C12細(xì)胞

根據(jù)先前試驗(yàn)得到C2C12培養(yǎng)條件，將生長(zhǎng)狀態(tài)良好C2C12細(xì)胞按照一定初始密度接種于六孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至50%密度時(shí)，將培養(yǎng)基更換為不含胎牛血清的OPTI-MEM培養(yǎng)基，12 h后向六個(gè)孔中依次加入纈氨酸母液，使六個(gè)孔終濃度依次為0、0.15、0.30、0.45、0.60及0.75 mmol·L-1，于37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)36 h。向六孔板每孔加入200 μL的RIPA裂解液（RIPA裂解液需預(yù)先加入PMSF，防止蛋白降解）。細(xì)胞于冰上裂解1 min，用細(xì)胞刮板收集細(xì)胞，移液器轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管中，于-20℃保存或直接作BCA試驗(yàn)。

1.4 蛋白免疫印記

取10 μL樣品，根據(jù)BCA濃度測(cè)定試劑盒說明書加入工作液和標(biāo)準(zhǔn)蛋白，于562 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線后，計(jì)算蛋白質(zhì)含量。將剩余蛋白樣品1：1加入2×蛋白上樣，沸水滾煮10 min，超聲破碎3次，每次30 s,置于冰上作后續(xù)試驗(yàn)。

采用蛋白免疫印跡試驗(yàn)方法檢測(cè)SREBP-1c、nSREBP-1c及β-actin蛋白表達(dá)量，參照SDSPAGE快速凝膠試劑盒配制蛋白膠。根據(jù)BCA試驗(yàn)結(jié)果計(jì)算每個(gè)樣品點(diǎn)樣體積，保證每孔蛋白上樣量一致。點(diǎn)樣結(jié)束后，室溫恒壓100 V條件下電泳，至蛋白預(yù)染Marker出現(xiàn)分層時(shí)，調(diào)整電壓至140 V，待溴酚藍(lán)指示條帶距膠底1~2 cm時(shí)停止電泳；120 V恒壓濕轉(zhuǎn)110 min；轉(zhuǎn)膜結(jié)束后用含有5%脫脂乳的TBST溶液室溫封閉120 min；將NC膜置于一抗稀釋液中，按抗體說明書比例稀釋一抗，4℃過夜封閉；12 h后于一抗稀釋液中取出NC膜，TBST清洗3次，每次10 min；37℃搖床孵育二抗60 min；再于TBST中清洗3次，每次10 min；于顯影系統(tǒng)對(duì)條帶顯色。Image J軟件掃描蛋白條帶灰度值，以β-actin為標(biāo)準(zhǔn)，SPSS 17.0對(duì)條帶灰度掃描結(jié)果定量分析，Graphpad繪圖以展示蛋白相對(duì)表達(dá)情況。

1.5 油紅O染色測(cè)定纈氨酸對(duì)C2C12脂肪沉積的影響

按參照1.3試驗(yàn)方法，用0 mmol·L-1及0.45 mmol·L-1纈氨酸處理C2C12細(xì)胞36 h，預(yù)冷PBS沖洗細(xì)胞2~3次，加入預(yù)先配置4%多聚甲醛于4℃下固定細(xì)胞30 min。同時(shí)配制油紅O染料，靜置5~10 min后用3層定性濾紙過濾。細(xì)胞固定結(jié)束后，PBS沖洗2~3次，每孔加入500 μL油紅O染料，37℃避光孵育20 min，孵育結(jié)束后棄油紅O染料，向每孔迅速加入500 μL 60%異丙醇，15 s后棄廢液，1×PBS漂洗3次，每次2 min。于倒置顯微鏡下觀察并拍照，陽(yáng)性細(xì)胞將被染料標(biāo)記為紅色或橙黃色。

1.6 纈氨酸對(duì)細(xì)胞增殖的影響

將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的C2C12細(xì)胞懸液均勻接種于四塊96孔板中，每孔100 μL細(xì)胞懸液（約2 500個(gè)細(xì)胞），12 h后更換OPTI-MEM培養(yǎng)基。12 h后，按照0、0.15、0.30、0.45、0.60及0.75 mmol·L-1濃度梯度向96孔板中加入纈氨酸母液（每個(gè)濃度設(shè)置12次重復(fù)），預(yù)留12個(gè)空位作為空白對(duì)照，于培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。分別于纈氨酸處理12、24、36及48 h時(shí)取出96孔板，于無(wú)菌操作臺(tái)中向每孔加入10 μL CCK8試劑，在酶標(biāo)板振蕩器上震蕩混勻后于37℃恒溫避光孵育90 min，在450 nm波長(zhǎng)處于酶標(biāo)儀測(cè)定OD值，利用SPSS 17.0計(jì)算各組間差異情況。

1.7 棕櫚酸濃度篩選

C2C12細(xì)胞接種于六孔板12 h后更換OPTIMEM，細(xì)胞饑餓處理12 h后按照0、25、50、75及100 μmol·L-1終濃度向六孔板加入棕櫚酸母液，繼續(xù)培養(yǎng)12 h。12 h后收取蛋白樣品，煮樣，BCA定量后，通過蛋白免疫印跡試驗(yàn)檢測(cè)C2C12細(xì)胞中SREBP-1c蛋白表達(dá)情況。

1.8 不同濃度棕櫚酸對(duì)C2C12細(xì)胞增殖的影響

本次試驗(yàn)共分為6組，第1組為空白對(duì)照組，即不加任何藥物處理組（Control）。對(duì)照組與其他5組每孔接種100 μL細(xì)胞懸液，鋪板12 h后更換OPTI-MEM培養(yǎng)基，饑餓12 h后，除對(duì)照組，其他5組均加入0.45 mmol·L-1纈氨酸，培養(yǎng)24 h后，按照0、25、50、75及100 μmol·L-1濃度梯度加入棕櫚酸處理12 h。每孔加入10 μL CCK8試劑，混勻后于37℃培養(yǎng)箱靜置孵育90 min，于450 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度，根據(jù)吸光度確認(rèn)細(xì)胞增殖情況，SPSS 17.0計(jì)算組間差異。

1.9 油紅O染色和蛋白免疫印記測(cè)定纈氨酸對(duì)棕櫚酸依賴的脂質(zhì)沉積的影響

試驗(yàn)分為4組：空白對(duì)照組（Control），纈氨酸組（Valine），棕櫚酸組（PA）及纈氨酸與棕櫚酸協(xié)同處理組（Val+PA）。

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好小鼠C2C12細(xì)胞，接種于六孔板中，細(xì)胞生長(zhǎng)至約40%時(shí)更換為OPTI-MEM培養(yǎng)基，饑餓處理12 h后，向Valine組和Val+PA組加入0.45 mmol·L-1纈氨酸，培養(yǎng)24 h后向PA組和Val+PA組加入75 μmol·L-1棕櫚酸，繼續(xù)培養(yǎng)12 h，油紅染色檢測(cè)C2C12細(xì)胞內(nèi)脂滴合成情況。另取一塊六孔板按照上述試驗(yàn)分組設(shè)置對(duì)C2C12加藥處理，收取蛋白后參照1.4所述相關(guān)實(shí)驗(yàn)操作開展蛋白免疫印跡試驗(yàn)，檢測(cè)SREBP-1c蛋白表達(dá)情況。

1.10 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示，使用SPSS 17.0處理與計(jì)算數(shù)據(jù)，Graphpad 8.0軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度纈氨酸處理影響SREBP-1c蛋白表達(dá)

不同濃度纈氨酸對(duì)SREBP-1c蛋白表達(dá)的影響如圖1所示。

圖1 不同濃度纈氨酸對(duì)SREBP-1c蛋白表達(dá)的影響Fig.1 Influence of different concentrations of valine on SREBP-1c protein expression

根據(jù)前期試驗(yàn)結(jié)果，為獲得最適纈氨酸濃度，在六孔板中加入纈氨酸至6種不同終濃度（0、0.15、0.30、0.45、0.60及0.75 mmol·L-1）。蛋白免疫印跡檢測(cè)C2C12細(xì)胞中SREBP-1c、nSREBP-1c表達(dá)情況。由圖1A可知，C2C12細(xì)胞中SREBP-1c及nSREBP-1c蛋白表達(dá)隨纈氨酸劑量升高而逐漸增加；至0.45 mmol·L-1時(shí)，蛋白表達(dá)水平達(dá)到最高，繼而降低（灰度掃描結(jié)果：圖1C和D）。由此可見，纈氨酸呈劑量依賴性形式促進(jìn)C2C12細(xì)胞中SREBP-1c蛋白表達(dá)和成熟，且最適濃度為0.45 mmol·L-1。

2.2 不同濃度纈氨酸影響C2C12脂滴合成

向六孔板中纈氨酸處理組孔中加入終濃度0.45 mmol·L-1纈氨酸處理36 h后，使用油紅O染色液對(duì)細(xì)胞染色，檢測(cè)C2C12細(xì)胞脂滴合成情況。如圖2所示，添加0.45 mmol·L-1纈氨酸后，細(xì)胞內(nèi)開始產(chǎn)生脂滴。結(jié)果說明，纈氨酸促進(jìn)SREBP-1c表達(dá)和成熟，但若缺乏脂質(zhì)沉積所需底物，纈氨酸可能無(wú)法較大程度促進(jìn)C2C12細(xì)胞脂肪沉積。

圖2 油紅O染色檢測(cè)0.45 mmol·L-1纈氨酸對(duì)C2C12細(xì)胞脂滴沉積的影響Fig.2 Oil red O staining detected the effect of 0.45 mmol·L-1 valine on lipid droplet deposition on C2C12 cells

2.3 纈氨酸促進(jìn)C2C12細(xì)胞增殖

添加6種不同濃度纈氨酸（0、0.15、0.30、0.45、0.60及0.75 mmol·L-1），分別處理12、24、36和48 h，開展CCK8試驗(yàn)以檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。在纈氨酸處理細(xì)胞12 h時(shí)，各組間無(wú)顯著差異（見圖3A）；至24 h時(shí)，0.45 mmol·L-1纈氨酸處理組較對(duì)照組出現(xiàn)顯著差異（P<0.01），較0.15 mmol·L-1纈氨酸組（P<0.05）及0.75 mmol·L-1組（P<0.001）均出現(xiàn)顯著差異（見圖3B）；至36 h時(shí)，與對(duì)照組相比，0.45 mmol·L-1纈氨酸處理組較其余各組均出現(xiàn)不同程度顯著差異，且C2C12細(xì)胞增殖情況隨纈氨酸濃度升高而升高，在0.45 mmol·L-1達(dá)到峰值后，隨濃度進(jìn)一步提高，促進(jìn)作用逐漸降低，但0.75 mmol·L-1時(shí)未對(duì)細(xì)胞增殖產(chǎn)生抑制（見圖3C）；至48 h時(shí)，0.45 mmol·L-1纈氨酸處理組與0.60 mmol·L-1組相比無(wú)顯著差異（P>0.05）（圖3D）。因此，纈氨酸呈劑量依賴性影響C2C12細(xì)胞增殖，且最適濃度為0.45 mmol·L-1，最適處理時(shí)間為36 h。

圖3 纈氨酸影響C2C12細(xì)胞增殖Fig.3 Effects of valine treatment on C2C12 cell proliferation

2.4 不同濃度棕櫚酸促進(jìn)SREBP-1c蛋白表達(dá)

棕櫚酸單獨(dú)處理C2C12后（終濃度分別為0、25、50、75及100 μmol·L-1），檢測(cè)SREBP-1c蛋白表達(dá)情況。在75 μmol·L-1時(shí)，細(xì)胞中SREBP-1c蛋白表達(dá)量達(dá)到峰值（見圖4A），相對(duì)于其他濃度均差異顯著（P<0.05）（見圖4B）。

圖4 不同濃度棕櫚酸對(duì)SREBP-1c的影響Fig.4 Effects of different concentrations of palmitic acid on SREBP-1c

2.5 添加棕櫚酸后纈氨酸對(duì)C2C12細(xì)胞增殖的影響

先前試驗(yàn)結(jié)果表明，添加0.45mmol·L-1纈氨酸促進(jìn)細(xì)胞增殖，通過CCK8試驗(yàn)驗(yàn)證加入棕櫚酸是否對(duì)細(xì)胞增殖產(chǎn)生影響。由圖5可知，棕櫚酸可在一定程度上促進(jìn)C2C12細(xì)胞增殖，增殖作用在50 μmol·L-1時(shí)達(dá)到最盛，75 μmol·L-1次之，但棕櫚酸濃度增至100 μmol·L-1時(shí)，添加棕櫚酸組OD值略低于僅添加0.45 mmol·L-1纈氨酸組，但仍略高于空白對(duì)照組，說明此時(shí)棕櫚酸可能已開始抑制細(xì)胞增殖，但抑制作用低于0.45 mmol·L-1纈氨酸對(duì)C2C12細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用。

圖5 添加棕櫚酸后纈氨酸對(duì)C2C12細(xì)胞增殖的影響Fig.5 Effects of valine on C2C12 cell proliferation after adding PA

2.6 纈氨酸協(xié)同棕櫚酸促進(jìn)C2C12細(xì)胞脂肪沉積

為探究纈氨酸與棕櫚酸同時(shí)處理C2C12細(xì)胞如何發(fā)揮作用，設(shè)置4個(gè)組別：對(duì)照（Control組）；0.45 mmol·L-1纈氨酸（Valine組）；75 μmol·L-1棕櫚酸（PA組）；0.45 mmol·L-1Val處理24 h后，添加75 μmol·L-1PA（Val+PA組）。油紅O染色后，發(fā)現(xiàn)PA組較Control組細(xì)胞內(nèi)脂滴明顯增多，而Val+PA組脂滴沉積最多（圖6A）。PA組較Control組，SREBP-1c蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，但是與Valine組無(wú)顯著差異（圖6B；圖6C）。Val+PA組，同其他3組差異顯著，表明纈氨酸和棕櫚酸處理，可以協(xié)同促進(jìn)C2C12細(xì)胞脂肪沉積。

圖6 纈氨酸協(xié)同棕櫚酸促進(jìn)C2C12脂肪沉積Fig.6 Synergistic effects of valine and palmitic acid on C2C12 lipid deposition

3 討論

3.1 纈氨酸對(duì)C21C2細(xì)胞脂肪沉積和細(xì)胞增殖的影響

肌內(nèi)脂肪是肉質(zhì)一項(xiàng)重要指標(biāo)，主要成分為磷脂與TGs。體外研究表明，過表達(dá)調(diào)控甘油三脂（TG）合成關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子SREBP-1c，主要通過AKT磷酸化，激活mTOR/SREBP-1c信號(hào)通路促進(jìn)山羊乳腺上皮細(xì)胞中脂肪酸從頭合成及TG合成[17]。相反，如果抑制AKT/mTOR信號(hào)通路，則使脂肪沉積相關(guān)基因表達(dá)下調(diào)[18]。研究表明，支鏈氨基酸對(duì)細(xì)胞脂肪沉積具有調(diào)節(jié)作用。亮氨酸可增加肌管內(nèi)脂質(zhì)含量，當(dāng)亮氨酸和棕櫚酸酯協(xié)同處理細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞代謝偏好發(fā)生改變[19]。異亮氨酸可通過肌肉生成和肌內(nèi)脂質(zhì)沉積共同增加肌肉質(zhì)量[20]。妊娠母豬補(bǔ)充纈氨酸，可通過刺激AKT/mTOR/SREBP-1c信號(hào)途徑，增加乳腺合成總?cè)橹?、甘油三酯和多不飽和脂肪酸含量[21]。但纈氨酸是否使肌肉細(xì)胞內(nèi)沉積脂滴及其作用機(jī)制未見報(bào)道。

研究顯示，纈氨酸對(duì)C2C12細(xì)胞中SREBP-1c蛋白表達(dá)與成熟具有顯著促進(jìn)作用，但油紅染色結(jié)果顯示細(xì)胞內(nèi)并未產(chǎn)生較多脂滴。纈氨酸分解代謝產(chǎn)物3-羥基異丁酸酯（3-HIB）可作為內(nèi)皮細(xì)胞旁分泌因子刺激脂肪酸攝取[22]，被認(rèn)為與飲食誘導(dǎo)肥胖造成的胰島素抵抗相關(guān)[23]，是公認(rèn)的2型糖尿病和胰島素抵抗重要標(biāo)志[24]。與亮氨酸和異亮氨酸降解產(chǎn)生CoA結(jié)合分解代謝物不同，3-HIB-CoA完全且僅由纈氨酸分解形成，被限速酶3-羥基異丁酰輔酶A水解酶（HIBCH）水解[25]。Lyon等研究表明，3-HIB從肌肉、心臟和前脂肪細(xì)胞釋放[26]，參與肌管中胰島素信號(hào)傳遞[27]。在發(fā)育脂肪細(xì)胞中，3-HIB線粒體分解代謝是將由纈氨酸衍生的碳結(jié)合到從頭合成脂肪酸中的關(guān)鍵步驟，3-HIB還可轉(zhuǎn)化為葡萄糖[28]。因此，纈氨酸處理后C2C12細(xì)胞內(nèi)脂滴沉積較少，可能因缺乏脂質(zhì)沉積相關(guān)底物，將添加棕櫚酸作為底物開展后續(xù)試驗(yàn)。

3.2 棕櫚酸對(duì)C2C12細(xì)胞脂肪沉積和細(xì)胞增殖的影響

無(wú)脂肪酸存在時(shí)，0.45 mmol·L-1纈氨酸雖可刺激C2C12細(xì)胞中SREBP-1c蛋白表達(dá)與成熟，但在細(xì)胞內(nèi)沉積的脂滴較少。Zhou等研究發(fā)現(xiàn)，在奶牛乳腺上皮細(xì)胞中，脂肪酸是激活SREBP-1c信號(hào)和甘油三酯合成必需物質(zhì)[29]。

棕櫚酸又名軟脂酸，是脂肪生成過程中第一種脂肪酸，由軟脂酸可繼續(xù)生成更長(zhǎng)脂肪酸。棕櫚酸較油酸對(duì)HepG2細(xì)胞中SREBP-1c信號(hào)通路影響更大，顯著增加細(xì)胞中甘油三脂合成與脂滴沉積[30]。但過量棕櫚酸對(duì)細(xì)胞造成脂毒性，引起C2C12肌管萎縮[31]。

研究表明，50 μmol·L-1棕櫚酸孵育C2C12肌管24 h可引起脂滴積聚并增加TG含量[32]，但未見棕櫚酸對(duì)C2C12細(xì)胞脂滴沉積影響的報(bào)道。本次試驗(yàn)通過SREBP-1c蛋白表達(dá)情況初步篩選棕櫚酸濃度。結(jié)果表明，75 μmol·L-1棕櫚酸孵育細(xì)胞12 h，可在不對(duì)細(xì)胞增殖造成抑制情況下，使SREBP-1c蛋白表達(dá)量顯著上調(diào)，并在細(xì)胞內(nèi)沉積脂滴。進(jìn)一步試驗(yàn)結(jié)果表明，在同時(shí)添加0.45 mmol·L-1纈氨酸和75 μmol·L-1棕櫚酸條件下，C2C12細(xì)胞中SREBP-1c蛋白表達(dá)量顯著高于其他組；油紅染色結(jié)果表明，細(xì)胞內(nèi)可沉積較多脂滴。說明在脂肪酸存在情況下，纈氨酸對(duì)C2C12細(xì)胞中脂肪沉積的促進(jìn)效應(yīng)顯著。但纈氨酸促進(jìn)脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)還是甘油三酯合成，亦或二者均受調(diào)控仍有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

研究揭示纈氨酸劑量依賴性促進(jìn)C2C12細(xì)胞SREBP-1c蛋白成熟與表達(dá)，且呈劑量依賴性方式促進(jìn)細(xì)胞增殖。研究表明，纈氨酸在棕櫚酸存在時(shí)，促進(jìn)C2C12細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積，為纈氨酸作為飼料添加劑提高畜禽肉質(zhì)水平提供理論依據(jù)。