郭亮，寇儒，李光，宋艷萍，藺旭紅，李真真

西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬西安市中心醫(yī)院血液科1、檢驗(yàn)科2，陜西 西安 710003

急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)是一種起源于髓系造血干祖細(xì)胞，以侵犯骨髓、血液以及其他組織器官的具有高度異質(zhì)性的惡性克隆性疾病[1]。AML 的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，目前有研究證實(shí)微小RNA (microRNA，miR)參與調(diào)控AML 發(fā)生發(fā)展、治療以及預(yù)后等方面[2]。miR是一種進(jìn)化高度保守的長(zhǎng)度約為22 個(gè)核苷酸的短鏈非編碼RNA，通過與目標(biāo)mRNA 的3'UTR 特異性結(jié)合抑制信號(hào)通路的表達(dá)介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄后基因沉默，miR主要由RNA聚合酶Ⅱ介導(dǎo)其轉(zhuǎn)錄過程，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物稱為pri-miR，其特征在于發(fā)夾結(jié)構(gòu)[3]。近年來隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)miR 通過調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、應(yīng)激、自噬、凋亡、血管新生、骨髓微環(huán)境等方面促進(jìn)白血病的發(fā)生發(fā)展[4]。因此了解miR 在AML 中的表達(dá)有助于人們更深入的理解AML 的發(fā)病機(jī)制，并探討其在AML 分類、早期診斷、疾病預(yù)后、治療等方面的應(yīng)用價(jià)值。miR-10a-5p、miR-203是近年來新興的參與腫瘤病理生理過程的分子生物標(biāo)志物，兩者在AML 患者中的表達(dá)水平及對(duì)預(yù)后影響的研究尚不多見。鑒于此，本研究通過檢測(cè)初治AML 患者血清中miR-10a-5p、miR-203 的表達(dá)水平，進(jìn)一步探討其與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2014 年7 月至2018 年1 月期間在西安市中心醫(yī)院住院治療的100 例初治AML患者(初治組)納入研究。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)臨床資料完整；(2)符合世界衛(wèi)生組織關(guān)于AML的診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]；(3)患者或家屬知情同意，且簽署知情同意書；(4)均符合初治AML患者；(5)所有入組人員均耐受化療。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)慢性髓系白血??；(2)嚴(yán)重心力衰竭或嚴(yán)重免疫缺陷者；(3)骨髓增生異常綜合征；(4)合并其他腫瘤者；(5)嚴(yán)重感染者；(6)失訪者。100例初治AML患者中有30例獲得完全緩解(完全緩解組)，27例獲得部分緩解(部分緩解組)，43例未獲得緩解(未緩解組)。同期選取我院體檢中心50例體檢正常者作為正常對(duì)照組。初治組患者中男性56 例，女性44 例；年齡20～78 歲，平均(50.77±8.44)歲。正常對(duì)照組中男性25 例，女性25 例；年齡22～75 歲，平均(49.31±6.23)歲。兩組受檢者的性別和年齡比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 治療方法100 例AML 患者均采取誘導(dǎo)化療。其中CAG 方案治療31 例：即靜脈滴注阿克拉霉素10 mg/次，1 次/d，連續(xù)8 d；皮下注射阿糖胞苷10 mg/m2，2 次/d，連續(xù)14 d；皮下注射粒細(xì)胞集落刺激因子200 μg/m2，1次/d，且以患者白細(xì)胞計(jì)數(shù)>20×109/L為停藥標(biāo)準(zhǔn)。MA方案治療19例：即靜脈滴注阿糖胞苷120～150 mg/m2，1次/d，連續(xù)3 d；米托蒽醌6～8 mg/m2，1 次/d，連續(xù)3 d。DA 方案治療50 例：即靜脈滴注阿糖胞苷120～150 mg/m2，1 次/d，連續(xù)7 d；柔紅霉素35～45 mg/m2，1 次/d，連續(xù)7 d。

1.3 療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)按照《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》[6]對(duì)100 例AML 患者的療效進(jìn)行評(píng)價(jià)：(1)完全緩解：治療后各項(xiàng)癥狀徹底消失，且外周血PLT≥100×109/L，中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)≥1.5×109/L，白細(xì)胞分類中未檢出白血病細(xì)胞，巨核細(xì)胞和紅細(xì)胞恢復(fù)正常，骨髓內(nèi)原始粒細(xì)胞Ⅰ型+Ⅱ型≤5%；(2)部分緩解：治療后血象、臨床表現(xiàn)兩項(xiàng)中存在1項(xiàng)未達(dá)完全緩解標(biāo)準(zhǔn)，且骨髓內(nèi)原始粒細(xì)胞Ⅰ型+Ⅱ型≤20%；(3)未緩解：血象、臨床表現(xiàn)以及骨髓象均未達(dá)到部分緩解標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 研究方法

1.4.1 臨床資料收集收集AML 患者的臨床資料，包括年齡、性別、脾腫大、染色體預(yù)后、白細(xì)胞計(jì)數(shù)(white blood cell，WBC)、血紅蛋白(hemoglobin，HGB)、血小板計(jì)數(shù)(platelet，PLT)、造血祖細(xì)胞抗原CD34(hematopoietic progenitor cell antigen CD34，CD34)陽性率、核仁磷酸蛋白(nucleophosmin，NPM)突變類型。

1.4.2 miR-10a-5p、miR-203 水平檢測(cè)收集AML 患者入院次日清晨空腹?fàn)顟B(tài)下及正常對(duì)照組體檢時(shí)的外周靜脈血3 mL 置于5 mL 的EDTA 試管中，轉(zhuǎn)速3 000 r/min離心5 min，吸取上層澄黃色液體至無菌的Eppendorf 管中，-80℃冰箱中保存?zhèn)溆?。?yīng)用TRIzol 法提取AML 患者及正常對(duì)照組受試者血清總RNA，通過分光光度法驗(yàn)純后根據(jù)說明書采用日本TaKaRa 公司的PrimeScriptTM逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。采用瑞士羅氏公司的實(shí)時(shí)熒光定量PCR 試劑盒和美國ABI 公司的ABI7500 熒光PCR 儀進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。采用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR上下游引物，其中miR-10a-5p引物序列如下：上游，5'-GCGGCGGTACCCTGTAGATC CG-3'，下 游，5'-ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3'。miR-203 引物序列如下：上游，5'-AACCTTGCTCGTGAAATGTTTAG-3'，下游，5'-TATGCTTGTTCTCGTC TCTGTGTC-3'。擴(kuò)增40 個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括預(yù)變性95℃20 s，變性95℃10 s、退火57℃20 s、延伸72℃15 s。設(shè)定統(tǒng)一的CT 值分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，取3 次實(shí)驗(yàn)的平均值。使用cer-miR-39作為內(nèi)源性對(duì)照，通過比較2-△△CT方法計(jì)算樣本中miR-10a-5p、miR-203 的相對(duì)表達(dá)量。

1.4.3 隨訪所有患者均隨訪3 年，統(tǒng)計(jì)其生存情況，若中途死亡則隨訪終止。

1.5 評(píng)價(jià)指標(biāo)比較初治組和正常對(duì)照組受檢者的血清miR-10a-5p、miR-203 表達(dá)水平；比較完全緩解組、部分緩解組、未緩解組患者的血清miR-10a-5p、miR-203 表達(dá)水平；分析血清miR-10a-5p、miR-203 表達(dá)水平與AML 患者的臨床病理特征的關(guān)系；分析不同miR-10a-5p、miR-203 表達(dá)水平AML患者的預(yù)后。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS23.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±ss)表示，兩組組間樣本均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析；計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)；單因素分析血清miR-10a-5p、miR-203 表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系，生存數(shù)據(jù)分析采用Kaplan-Meier法，組間差異采用Log-rank 檢驗(yàn)法，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 正常對(duì)照組與初治組受檢者的血清miR-10a-5p、miR-203 表達(dá)水平比較初治組患者的血清miR-10-5p 表達(dá)水平明顯高于正常對(duì)照組，而血清miR-203表達(dá)水平明顯低于正常對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 正常對(duì)照組與初治組血清miR-10a-5p、miR-203 的表達(dá)水平比較(±s)

表1 正常對(duì)照組與初治組血清miR-10a-5p、miR-203 的表達(dá)水平比較(±s)

組別正常對(duì)照組初治組t值P值例數(shù)50 100 miR-10a-5p 0.11±0.03 0.36±0.11-15.756 0.001 miR-203 0.73±0.14 0.56±0.12 7.730 0.001

2.2 不同療效AML 患者的血清miR-10a-5p、miR-203表達(dá)水平比較完全緩解組和部分緩解組的血清miR-10a-5p表達(dá)水平均低于未緩解組，且完全緩解組低于部分緩解組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；完全緩解組和部分緩解組的血清miR-203 表達(dá)水平均高于未緩解組，且完全緩解組高于部分緩解組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 不同療效AML 患者的血清miR-10a-5p、miR-203 表達(dá)水平比較(±s)

表2 不同療效AML 患者的血清miR-10a-5p、miR-203 表達(dá)水平比較(±s)

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2.3 血清miR-10a-5p、miR-203 表達(dá)水平與AML 患者臨床病理特征的關(guān)系以中位表達(dá)水平分別將100 例初治AML 患者分為miR-10a-5p 高表達(dá)組、miR-10a-5p 低表達(dá)組以及miR-203 高表達(dá)組、miR-203低表達(dá)組，單因素分析結(jié)果顯示：100例初治AML 患者的血清miR-10a-5p、miR-203 的表達(dá)水平與脾腫大及WBC有關(guān)(P<0.05)，而與患者年齡、性別、染色體預(yù)后、HGB、PLT、CD34陽性率、NPM突變無關(guān)(P>0.05)，見表3。

表3 miR-10a-5p、miR-203表達(dá)與AML患者臨床特征的關(guān)系[例(%)]

2.4 血清miR-10a-5p、miR-203 表達(dá)水平與AML 患者預(yù)后的關(guān)系截止隨訪結(jié)束時(shí)，100例初治AML 患者死亡55例，存活45例。其中miR-10a-5p高表達(dá)的AML 患者生存率為27.78% (15/54)，低于miR-10a-5p低表達(dá)的65.22% (30/46)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Log-rank χ2=21.220，P<0.05)；miR-203高表達(dá)的AML患者生存率為55.77% (29/52)，高于miR-203低表達(dá)的33.33% (16/48)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Log-rankχ2=14.706，P<0.05)，Kaplan-Meier生存率曲線圖見圖1。

圖1 血清miR-10a-5p、miR-203表達(dá)水平與AML患者預(yù)后的關(guān)系

3 討論

AML是成年群體中最為常見的急性白血病之一，占成年群體急性白血病的80%～90%，目前其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明[7]。研究顯示miR調(diào)控著人體大約30%的基因表達(dá)，其可作為促癌基因或抑癌基因參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡、發(fā)育、造血、器官形成等一系列重要的病理生理學(xué)過程[8]，同時(shí)miR 的發(fā)現(xiàn)和認(rèn)識(shí)為深入探討腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制、臨床診斷、靶向治療及預(yù)后評(píng)估等方面開啟了新的思路和方法[9]。

miR-10a-5p是近年來新發(fā)現(xiàn)的miR-10基因家族的成員之一，相關(guān)研究顯示miR-10a-5p作為癌基因可與靶基因相互作用，進(jìn)而參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展，而miR-10a-5p在多種腫瘤中表達(dá)異常，但是在不同腫瘤類型中miR-10a-5p 的表達(dá)量具有一定的腫瘤異質(zhì)性[10]。本研究結(jié)果顯示，初治AML 患者血清中的miR-10a-5p表達(dá)水平明顯高于正常人群，而完全緩解組和部分緩解組的miR-10a-5p 表達(dá)水平低于未緩解組，完全緩解組又低于部分緩解組，并且miR-10a-5p高表達(dá)的AML 患者預(yù)后較差，提示miR-10a-5p 可能是AML不良預(yù)后的影響因子，與ZHI 等[11]的研究結(jié)果相吻合，這可能與miR-10a-5p可通過抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡有關(guān)[12]，既往已有研究顯示敲低miR-10a-5p的表達(dá)可靶向抑制血小板反應(yīng)蛋白2 (platelet reactive protein 2，THBS2)基因的表達(dá)，進(jìn)而抑制胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[9]。而支勇金等[13]檢測(cè)到miR-10a在AML患者血清中普遍存在高表達(dá)，且與腫瘤負(fù)荷相關(guān)，提示miR-10a 高表達(dá)可能是AML 預(yù)后不良的分子標(biāo)志物之一，但并未發(fā)現(xiàn)其表達(dá)水平與脾腫大和WBC有關(guān)，這可能是該研究樣本量較少所致。

miR-203 定位于染色體不穩(wěn)定脆性區(qū)域14q32-33，參與細(xì)胞分化、增殖、遷徙、轉(zhuǎn)移、凋亡和自噬等生物學(xué)過程，同時(shí)miR-203還可通過與多種目標(biāo)靶點(diǎn)如轉(zhuǎn)錄因子、分泌蛋白、受體、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等相互作用而發(fā)揮功能[14]。此外，miR-203在血液系統(tǒng)腫瘤、食管鱗癌、胃癌、肝癌、結(jié)直腸癌、膀胱癌、前列腺癌、喉癌、骨肉瘤等多種腫瘤中的表達(dá)下調(diào)，提示miR-203在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起著抑癌基因的作用[15]。本研究結(jié)果顯示，初治AML患者血清中的miR-203表達(dá)水平明顯低于正常人群，而完全緩解組和部分緩解組的血清miR-203 表達(dá)水平均高于未緩解組，完全緩解組又高于部分緩解組，并且miR-203低表達(dá)的AML患者預(yù)后較差，提示miR-203在AML中發(fā)揮抑癌基因的作用，這可能是因?yàn)閙iR-203 可通過靶向抑制SRC、ABL基因的表達(dá)從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖[16-17]。ZHANG等[18]研究顯示miR-203 在取自AML 患者的原代培養(yǎng)細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，并且miR-203 直接靶向survivin 和Bmi-1 mRNA 的3'非翻譯區(qū)，影響白血病干細(xì)胞的增殖和自我更新，證明miR-203/survivin/Bmi-1 軸參與了白血病干細(xì)胞生物學(xué)特性的調(diào)控，以上結(jié)果均提示miR-203 的低表達(dá)與AML 患者不良預(yù)后可能有密切關(guān)系，臨床可通過檢測(cè)miR-203的表達(dá)水平評(píng)估AML患者預(yù)后不良的風(fēng)險(xiǎn)。

綜上所述，miR-10a-5p、miR-203 在AML 患者中異常表達(dá)，且表達(dá)水平與脾腫大和WBC 有關(guān)，miR-10a-5p高表達(dá)及miR-203低表達(dá)均提示AML患者具有不良預(yù)后的風(fēng)險(xiǎn)。