洪森榮，陳軒宇，李文麗，張座棟，劉軍，劉佳，蔡紅，陳榮華

（1.上饒師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，江西 上饒 334001；2.上饒市藥食同源植物資源保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/上饒市三葉青保育與利用技術(shù)創(chuàng)新中心/上饒農(nóng)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新研究院，江西 上饒 334001；3.上饒市紅日農(nóng)業(yè)開(kāi)發(fā)有限公司，江西 上饒 334700）

三葉青（TetrastigmahemsleyanumDiels et Gilg）為葡萄科崖爬藤屬植物，學(xué)名三葉崖爬藤，俗名金絲吊葫蘆，中國(guó)特有的藥用植物［1］，其地下塊根的主要活性成分包括黃酮、多糖、山奈酚等，可清熱解毒、祛風(fēng)化痰、活血止痛，具有抗病毒、抗炎、抗腫瘤等生物學(xué)功效，臨床上用于治療高熱驚厥、腹痛、肺炎、哮喘、肝炎等癥，被譽(yù)為“安全有效的植物抗生素”［2］。懷玉山可謂是“天然藥谷”，此處的三葉青成群落式分布，自古以來(lái)便是鄉(xiāng)醫(yī)郎中常用的一味退熱良藥［3］。

土壤鹽漬化已經(jīng)成為全球的生態(tài)環(huán)境難題，且由工業(yè)污染、不合理的農(nóng)業(yè)灌溉、施肥等引起的次生鹽漬化土壤面積仍在不斷擴(kuò)大，全世界約有20%的耕地遭受鹽漬化脅迫，鹽脅迫與植物的種子萌發(fā)、生長(zhǎng)發(fā)育及分化密切相關(guān)［4］。鹽脅迫下，植物會(huì)通過(guò)生理響應(yīng)以減輕鹽脅迫帶來(lái)的影響［5］。但植物種類不同，其細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)和代謝機(jī)理迥異，鹽脅迫下其生理響應(yīng)機(jī)制和活性成分含量變化存在差異［6］。目前關(guān)于三葉青鹽脅迫下生理響應(yīng)和活性成分變化的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本試驗(yàn)以‘懷玉1號(hào)’和‘懷玉2號(hào)’懷玉山三葉青試管苗為研究對(duì)象，從生理生化和次生代謝兩方面開(kāi)展其對(duì)不同濃度NaCl脅迫的響應(yīng)研究，以確定2個(gè)栽培種的耐鹽能力并揭示其在鹽脅迫下的次生代謝產(chǎn)物（黃酮、多酚、多糖）含量變化規(guī)律，這不僅有利于促進(jìn)懷玉山三葉青耐鹽種質(zhì)鑒定和篩選，而且對(duì)其大棚基質(zhì)扦插高效栽培具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

懷玉山三葉青‘懷玉1號(hào)’和‘懷玉2號(hào)’試管苗，由上饒師范學(xué)院植物組織培養(yǎng)室提供，并由上饒市紅日農(nóng)業(yè)開(kāi)發(fā)有限公司陳榮華高級(jí)農(nóng)藝師進(jìn)行種質(zhì)鑒定。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 鹽脅迫培養(yǎng)基的配制和試管苗的鹽脅迫處理 鹽脅迫試驗(yàn)選用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為MS＋1.5 mg·L－1KT＋0.3 mg·L－1NAA＋30 g·L－1蔗糖＋6 g·L－1瓊脂（pH 5.8～6.0），分別添加6種質(zhì)量濃度的NaCl制得鹽脅迫培養(yǎng)基。NaCl質(zhì)量濃度分別為0、2、4、6、8、10 g·L－1。在超凈工作臺(tái)內(nèi)切取‘懷玉1號(hào)’和‘懷玉2號(hào)’試管苗帶2個(gè)腋芽、長(zhǎng)約1.5～2.0 cm的莖段，接入上述6種固體培養(yǎng)基中，每瓶接種5～6個(gè)帶芽莖段，每個(gè)處理接種16瓶；置于培養(yǎng)室中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為光照14 h·d－1，光照強(qiáng)度1 500～2 000 lx，溫度（25±1）℃；鹽脅迫處理60 d后結(jié)束試驗(yàn)，同時(shí)對(duì)其各項(xiàng)生理生化指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定。

1.2.2 株高和生物量測(cè)定 株高用直尺測(cè)量；生物量參照Green［7］和Wu［8］等的方法測(cè)定，將6個(gè)鹽脅迫處理的‘懷玉1號(hào)’和‘懷玉2號(hào)’試管苗洗凈后分別放置于培養(yǎng)皿中，放入80℃烘箱6 h烘干至恒重，取出稱量植株干質(zhì)量。

1.2.3 有機(jī)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量和相對(duì)電導(dǎo)率測(cè)定 選取6個(gè)鹽脅迫處理的‘懷玉1號(hào)’和‘懷玉2號(hào)’試管苗葉片用于有機(jī)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量和相對(duì)電導(dǎo)率測(cè)定?？扇苄缘鞍祝⊿P）含量采用考馬斯亮藍(lán)G－250比色法測(cè)定［9］；游離脯氨酸（Pro）和可溶性糖（SS）含量分別采用酸性茚三酮比色法和蒽酮比色法測(cè)定［10］；葉片相對(duì)電導(dǎo)率（RC）的測(cè)定參照Chen等［11］的方法。

1.2.4 抗氧化酶活性和丙二醛含量測(cè)定 選取6個(gè)鹽脅迫處理的‘懷玉1號(hào)’和‘懷玉2號(hào)’試管苗葉片用于抗氧化酶活性及丙二醛（MDA）含量的測(cè)定。超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化物酶（POD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）活性以及丙二醛（MDA）含量的測(cè)定分別采用愈創(chuàng)木酚法［12］、氮藍(lán)四唑（NBT）比色法［13］、紫外分光光度法［14］和硫代巴比妥酸（TBA）比色法［10］。

1.2.5 黃酮、多酚、多糖含量測(cè)定 2個(gè)栽培種試管苗葉片中的黃酮、多酚、多糖含量用屠玲艷［15］的方法測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

以上試驗(yàn)均重復(fù)3次，所有數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，并使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用單因素方差分析（One－way ANOVA）及Duncan’s多重比較檢驗(yàn)處理間的差異顯著性（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽脅迫對(duì)懷玉山三葉青2個(gè)栽培種試管苗株高和生物量的影響

從圖1可知，2個(gè)栽培種試管苗的株高和生物量均隨著NaCl脅迫處理濃度的升高呈先升高后降低的趨勢(shì)，‘懷玉1號(hào)’‘懷玉2號(hào)’分別在2～4、2～6 g·L－1NaCl范圍內(nèi)與對(duì)照差異不顯著。低鹽脅迫（2～4 g·L－1NaCl）對(duì)‘懷玉1號(hào)’和‘懷玉2號(hào)’試管苗的株高和生物量均有促進(jìn)作用；除6 g·L－1NaCl對(duì)‘懷玉2號(hào)’株高還有一定促進(jìn)作用外，中鹽脅迫（6～8 g·L－1NaCl）和高鹽脅迫（10 g·L－1NaCl）對(duì)‘懷玉1號(hào)’和‘懷玉2號(hào)’試管苗的株高和生物量起到顯著抑制作用。特別是高鹽脅迫（10 g·L－1NaCl）造成了2個(gè)栽培種部分試管苗的死亡。

圖1 鹽脅迫對(duì)懷玉山三葉青2個(gè)栽培種試管苗株高和生物量的影響

2.2 鹽脅迫對(duì)懷玉山三葉青2個(gè)栽培種試管苗有機(jī)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量和相對(duì)電導(dǎo)率的影響

從圖2可知，隨著NaCl脅迫濃度的升高，2個(gè)栽培種試管苗的可溶性蛋白、游離脯氨酸、可溶性糖含量均先升高后降低，‘懷玉2號(hào)’在6 g·L－1NaCl處理時(shí)達(dá)到峰值，‘懷玉1號(hào)’除可溶性糖含量在2 g·L－1NaCl處理時(shí)最高外均在4 g·L－1NaCl處理時(shí)達(dá)到峰值；而相對(duì)電導(dǎo)率持續(xù)升高。低鹽脅迫（2～4 g·L－1NaCl）和中鹽脅迫（6～8 g·L－1NaCl）均可顯著提高‘懷玉1號(hào)’和‘懷玉2號(hào)’試管苗可溶性蛋白和游離脯氨酸的含量；中鹽脅迫（6～8 g·L－1NaCl）也可顯著提高‘懷玉2號(hào)’的可溶性糖含量，但對(duì)‘懷玉1號(hào)’可溶性糖含量的提高作用不顯著；高鹽脅迫（10 g·L－1NaCl）下，‘懷玉1號(hào)’和‘懷玉2號(hào)’的可溶性蛋白含量、‘懷玉1號(hào)’的可溶性糖含量與對(duì)照差異不顯著，而兩者的游離脯氨酸和‘懷玉2號(hào)’的可溶性糖含量均顯著高于對(duì)照。鹽脅迫無(wú)論何種濃度均會(huì)造成懷玉山三葉青2個(gè)栽培種試管苗的相對(duì)電導(dǎo)率顯著提高。

圖2 鹽脅迫對(duì)懷玉山三葉青2個(gè)栽培種試管苗有機(jī)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量和相對(duì)電導(dǎo)率的影響

2.3 鹽脅迫對(duì)懷玉山三葉青2個(gè)栽培種試管苗抗氧化酶活性和丙二醛含量的影響

從圖3可知，隨NaCl脅迫濃度的升高，懷玉山三葉青2個(gè)栽培種的SOD、POD、CAT活性均先升高后降低，總體來(lái)說(shuō)，‘懷玉1號(hào)’和‘懷玉2號(hào)’的這三種酶活性分別在4 g·L－1和6 g·L－1NaCl脅迫時(shí)達(dá)到峰值。除高鹽脅迫（10 g·L－1NaCl）下‘懷玉1號(hào)’的POD、‘懷玉2號(hào)’的CAT活性提高不顯著外，NaCl脅迫處理均可顯著提高‘懷玉1號(hào)’和‘懷玉2號(hào)’試管苗抗氧化酶活性。鹽脅迫無(wú)論何種濃度均會(huì)造成懷玉山三葉青2個(gè)栽培種試管苗丙二醛含量的顯著提高。

圖3 鹽脅迫對(duì)懷玉山三葉青2個(gè)栽培種試管苗抗氧化酶活性和丙二醛含量的影響

2.4 鹽脅迫對(duì)懷玉山三葉青2個(gè)栽培種試管苗葉綠素含量的影響

從圖4可知，2～4 g·L－1NaCl對(duì)‘懷玉1號(hào)’、2～6 g·L－1NaCl對(duì)‘懷玉2號(hào)’試管苗葉綠素含量無(wú)顯著影響，但NaCl濃度繼續(xù)升高，2個(gè)栽培種試管苗的葉綠素a、葉綠素b及總?cè)~綠素含量均顯著下降。

圖4 鹽脅迫對(duì)‘懷玉1號(hào)’（A）、‘懷玉2號(hào)’（B）試管苗葉綠素含量的影響

2.5 鹽脅迫下懷玉山三葉青2個(gè)栽培種試管苗生理生化指標(biāo)的隸屬函數(shù)分析

通過(guò)鹽脅迫下懷玉山三葉青2個(gè)栽培種試管苗的SP、Pro、SS、RC、SOD、POD、CAT、MDA的隸屬函數(shù)分析，對(duì)懷玉山三葉青2個(gè)栽培種的耐鹽性進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果（表1）表明，‘懷玉1號(hào)’除RC和MDA的隸屬函數(shù)值高于‘懷玉2號(hào)’外，其余指標(biāo)的隸屬函數(shù)值均低于‘懷玉2號(hào)’，平均隸屬函數(shù)值低于‘懷玉2號(hào)’。因此，‘懷玉2號(hào)’試管苗的耐鹽性強(qiáng)于‘懷玉1號(hào)’。

表1 鹽脅迫下懷玉山三葉青2個(gè)栽培種試管苗生理生化指標(biāo)的隸屬函數(shù)分析結(jié)果

2.6 鹽脅迫下懷玉山三葉青2個(gè)栽培種試管苗生理生化指標(biāo)的相關(guān)性分析和主成分分析

通過(guò)SPSS 19.0軟件對(duì)各指標(biāo)隸屬函數(shù)值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，并對(duì)標(biāo)準(zhǔn)化值進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果（表2）表明，SOD與Pro、POD與Pro、CAT與Pro、MDA與RC、POD與SOD、CAT與SOD、CAT與POD、CAT與SP之間極顯著或顯著相關(guān)，因此，SOD、Pro、POD、CAT、MDA和RC可以作為懷玉山三葉青2個(gè)栽培種試管苗耐鹽性鑒定的指標(biāo)。進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行主成分分析，結(jié)果（表3）表明，第1主成分對(duì)應(yīng)較大的指標(biāo)有MDA、RC、SS、POD、SP；第2主成分對(duì)應(yīng)較大的指標(biāo)有CAT、Pro、SP、POD、SOD；第3主成分對(duì)應(yīng)較大的指標(biāo)有SS。然后以每個(gè)主成分對(duì)應(yīng)的特征值占所提取主成分總的特征值之和的比例作為權(quán)重，計(jì)算懷玉山三葉青2個(gè)栽培種試管苗的綜合主成分值作為綜合得分，結(jié)果（表4）表明，‘懷玉2號(hào)’的耐鹽性強(qiáng)于‘懷玉1號(hào)’。這與隸屬函數(shù)法的評(píng)價(jià)結(jié)果一致。

表2 鹽脅迫下懷玉山三葉青2個(gè)栽培種試管苗生理生化指標(biāo)的相關(guān)系數(shù)矩陣

表3 鹽脅迫下懷玉山三葉青2個(gè)栽培種試管苗 生理生化指標(biāo)的主成分得分系數(shù)矩陣

表4 鹽脅迫下懷玉山三葉青2個(gè)栽培種試管苗 生理生化指標(biāo)的各主成分得分及綜合得分

2.7 鹽脅迫對(duì)懷玉山三葉青2個(gè)栽培種試管苗葉片次生代謝物含量的影響

從圖5可知，隨著鹽脅迫的不斷加重，‘懷玉1號(hào)’和‘懷玉2號(hào)’試管苗葉片的黃酮和多酚含量呈先升后降趨勢(shì)，并分別于4、6 g·L－1NaCl處理時(shí)最高，且總體來(lái)說(shuō)，除高鹽脅迫（10 g·L－1NaCl）處理的黃酮和多酚含量與對(duì)照差異不顯著外，其他濃度處理均可增加黃酮和多酚的含量；而多糖含量則呈逐漸下降趨勢(shì)，當(dāng)NaCl濃度超過(guò)2 g·L－1后下降顯著。表明，低鹽和中鹽脅迫有助于懷玉山三葉青2個(gè)栽培種試管苗葉片黃酮和多酚含量的提高，但NaCl脅迫導(dǎo)致葉片多糖含量下降。

圖5 鹽脅迫對(duì)懷玉山三葉青2個(gè)栽培種試管苗葉片次生代謝物含量的影響

3 討論與結(jié)論

鹽脅迫下，植株組織和器官等形態(tài)建成受阻，生長(zhǎng)指標(biāo)和生物量發(fā)生變化，是體現(xiàn)植物耐鹽性最直觀的指標(biāo)［16，17］。在本試驗(yàn)中，低鹽（2～4 g·L－1）脅迫下，‘懷玉1號(hào)’和‘懷玉2號(hào)’試管苗長(zhǎng)勢(shì)正常，其株高和生物量增加，這是其積極應(yīng)對(duì)逆境的一種生理響應(yīng)，與檉柳［18］鹽脅迫的結(jié)果較為一致。但在中鹽（6～8 g·L－1）和高鹽（10 g·L－1）脅迫下，‘懷玉1號(hào)’和‘懷玉2號(hào)’試管苗葉片相對(duì)電導(dǎo)率顯著上升，植株高度、生物量和葉綠素含量顯著下降。光合色素含量下降的原因可能是鹽脅迫對(duì)葉綠體結(jié)構(gòu)造成了一定的破壞，提高了葉綠素酶的活性，促進(jìn)了光合色素的分解［19］。

鹽脅迫下，植物體內(nèi)會(huì)積累大量的活性氧自由基如OH－和O·－2等，造成膜脂過(guò)氧化反應(yīng)，MDA大量積累，膜結(jié)構(gòu)完整和功能穩(wěn)定性受到破壞［20］。SOD、POD和CAT等抗氧化酶類，可清除過(guò)量活性氧，抑制MDA積累，保證植物正常生長(zhǎng)代謝［21］。在本試驗(yàn)中，隨著鹽脅迫濃度增加，‘懷玉1號(hào)’和‘懷玉2號(hào)’試管苗的MDA含量也顯著增加，相對(duì)電導(dǎo)率顯著上升，表明中高鹽脅迫下‘懷玉1號(hào)’和‘懷玉2號(hào)’試管苗體內(nèi)會(huì)逐漸積累大量的活性氧自由基，膜脂過(guò)氧化，膜結(jié)構(gòu)和功能受損，從而影響了‘懷玉1號(hào)’和‘懷玉2號(hào)’試管苗的生長(zhǎng)，這與龍船花［22］在鹽脅迫下的結(jié)果一致。

滲透調(diào)節(jié)作用也是植物適應(yīng)逆境脅迫的重要生理機(jī)制之一。研究表明，鹽脅迫下植物體內(nèi)會(huì)積累大量有機(jī)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來(lái)維持較高的細(xì)胞質(zhì)滲透壓，增強(qiáng)其滲透調(diào)節(jié)能力，維持植物的正常吸水和代謝活動(dòng)［23］。SP作為植物體內(nèi)重要的滲透物質(zhì)之一，直接反映鹽脅迫對(duì)植物代謝所產(chǎn)生的影響［24］。Pro作為一種重要的有機(jī)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，可起到保護(hù)生物大分子、清除體內(nèi)羥基的作用，還可作為植物抵抗鹽脅迫對(duì)自身所造成影響最直接的氮源、碳源、還原劑［25］。SS也是一種重要的滲透調(diào)節(jié)劑，在逆境脅迫下，它對(duì)細(xì)胞膜和原生質(zhì)體有一定保護(hù)作用，還可在細(xì)胞內(nèi)無(wú)機(jī)離子濃度高時(shí)起保護(hù)酶類和促進(jìn)Pro合成積累的作用［26］。在本試驗(yàn)中，隨著鹽脅迫濃度增加，‘懷玉1號(hào)’和‘懷玉2號(hào)’試管苗的Pro、SP和SS均呈先升后降趨勢(shì)，且顯著高于對(duì)照或與對(duì)照相比無(wú)顯著差異，說(shuō)明‘懷玉1號(hào)’和‘懷玉2號(hào)’試管苗通過(guò)積累SP、Pro和SS使得細(xì)胞液濃度迅速升高，以便植物在鹽脅迫逆境中提高細(xì)胞吸水和保水的能力，維持細(xì)胞正常的生理功能，從而提高‘懷玉1號(hào)’和‘懷玉2號(hào)’試管苗的耐鹽性。

中藥材的品質(zhì)取決于藥用植物活性成分的含量高低。藥用植物活性成分合成與累積的主要誘導(dǎo)因子為逆境脅迫，且對(duì)逆境脅迫的響應(yīng)因植物種類而異。研究發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫可顯著提高薯蕷屬植物的總黃酮含量［27］，也可提高芝麻中總黃酮、總多酚的含量［28］，還可有利于煙草酚類、生物堿等物質(zhì)的積累［29］。本試驗(yàn)也表明，隨著鹽脅迫的不斷加重，‘懷玉1號(hào)’和‘懷玉2號(hào)’試管苗葉片的黃酮和多酚含量呈先升后降趨勢(shì)，而多糖含量則呈逐漸下降趨勢(shì)，這說(shuō)明鹽脅迫會(huì)增強(qiáng)三葉青的次生代謝，促進(jìn)次生代謝產(chǎn)物累積，而多糖含量顯著下降可能是由于植物體通過(guò)分解體內(nèi)多糖，提高可溶性糖含量，以此調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓以適應(yīng)鹽脅迫帶來(lái)的逆境壓力。