劉佳鈺，李銳，周威，張光偉，倪丹紅，劉丹，李娟

1.西安市第五醫(yī)院，陜西 西安 710082；2.西安醫(yī)學(xué)院，陜西 西安 710021

類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種病因不明的慢性炎性疾病，以侵蝕關(guān)節(jié)滑膜慢性炎癥為主要臨床表現(xiàn)，嚴(yán)重時(shí)可發(fā)生關(guān)節(jié)損傷、畸形或殘疾，具有病程長(zhǎng)、遷延難愈、致殘率高等特點(diǎn)，增加患者的醫(yī)療負(fù)擔(dān)，降低生活質(zhì)量［1］。目前，治療RA的藥物主要是拮抗不同炎癥通路的生物制劑，如依那西普、妥珠單抗等。臨床治療費(fèi)用昂貴，且只對(duì)部分患者有效，故迫切需要療效肯定且不良反應(yīng)小的藥物。

薯蕷皂苷是廣泛存在于薯蕷科、百合科和石竹科等中藥中的呋甾烷醇皂苷，可用于治療多種免疫疾病［2］。研究發(fā)現(xiàn)，薯蕷皂苷或甲基化薯蕷皂苷通過(guò)抑制白細(xì)胞介素-1β（interleukin1-β，IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）、環(huán)氧化酶-2（cyclooxyganese-2，COX-2）和前列腺素-E2（prostaglandin E2，PGE2）等促炎細(xì)胞因子，從而抑制炎癥反應(yīng)［3-4］。然而，薯蕷皂苷對(duì)RA的抗炎作用報(bào)道較少。本研究應(yīng)用完全弗氏佐劑（complete freund′s adjuvant，CFA）誘導(dǎo)RA大鼠模型，觀察薯蕷皂苷對(duì)其影響，旨在探討薯蕷皂苷治療RA可能的作用機(jī)制，以期為后續(xù)相關(guān)探索工作奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 動(dòng)物40只SPF級(jí)6周齡SD雄性大鼠，體質(zhì)量200～220 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2012-0001。飼養(yǎng)于西安交大醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，使用許可證件號(hào)：SCXK（陜）2015-0001。自由飲食，室溫（24±1）℃，濕度（55±5）%，每日7∶00～19∶00光照。本研究獲得陜西師范大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，倫理批號(hào)：20160901。

1.2 藥物與試劑薯蕷皂苷（純度＞98%，成都曼思特生物科技有限公司，批號(hào)：MUST-15081101）。CFA（美國(guó)Sigma公司，貨號(hào)：068K8772）；PGE2 ELISA試劑盒（上海通蔚生物科技有限公司，批號(hào)：385r1229）；SYBR ExScript qRT-PCR試劑盒（大連寶生物工程有限公司，批號(hào)：DRR039s）；Triol RNA試劑盒（日本Takara公司，批號(hào)：PK0542）；Easy-Script First-Strand cDNA Synthesis Mix（日本Takara公司，批號(hào)：AIG1952A）；PCR定量試劑盒（日本Takara公司，批號(hào)：H2001081）。

1.3 儀器Vasrioskan Flash型全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo公司）；5450型離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）；TP1020型脫水裝置（德國(guó)Leica公司）；RM2235型切片機(jī)（德國(guó)Leica公司）；YD-AB型烘烤機(jī)（浙江金華益迪公司）；DHG-9203型恒溫干燥鼓風(fēng)干燥機(jī)（上海精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠）；Shandon Gemini型染色機(jī)（美國(guó)Thermo公司）；DP2-BSM型病理圖像采集系統(tǒng)（日本Olympus公司）；足趾容量測(cè)量?jī)x（意大利UGO公司）；7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國(guó)ABI公司）。

2 方法

2.1 大鼠分組及造模將40只大鼠隨機(jī)均分為對(duì)照組、模型組、薯蕷皂苷低劑量（50 mg·kg-1）組、薯蕷皂苷中劑量（100 mg·kg-1）組、薯蕷皂苷高劑量（200 mg·kg-1）組，每組8只。除正常組外，其余大鼠在左后肢皮下注射100μL CFA復(fù)制RA模型［5-6］，對(duì)照組注射等體積的生理鹽水。免疫1周后，連續(xù)灌胃相應(yīng)的藥物15 d。

2.2 關(guān)節(jié)炎程度的評(píng)估分別于給藥第5天、第10天、第15天，觀察并記錄大鼠一般情況，包括大鼠的體質(zhì)量、飲食狀況、毛發(fā)、整體狀態(tài)及關(guān)節(jié)紅腫情況等；同時(shí)用足趾容量測(cè)量?jī)x測(cè)量小鼠足爪趾體積，評(píng)估關(guān)節(jié)炎程度［6］。

2.3 ELISA法檢測(cè)大鼠血清PGE2水平給藥結(jié)束后，用體積分?jǐn)?shù)7%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠腹主動(dòng)脈取血，3 000 r·min-1離心10 min，取血清，ELISA法檢測(cè)大鼠血清PGE2水平。

2.4 RT-qPCR法檢測(cè)IL-1βmRNA、TNF-α mRNA、COX-2m RNA、I L-6 m RNA水平 取上述大鼠血清，用Trizol試劑提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為50μL，反應(yīng)條件：37℃15 min，85℃5 s。擴(kuò)增反應(yīng)體系25μL，反應(yīng)條件：95℃×30 s、95℃×30 s、60℃×40 s（共40個(gè)循環(huán)）、65℃×5 min。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。采用相對(duì)定量法（2-ΔΔCT法）計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

2.5 大鼠關(guān)節(jié)組織病理學(xué)檢查每組隨機(jī)選3只大鼠，取血后切取后肢踝關(guān)節(jié)，分離周?chē)浗M織，置于40 ng·L-1多聚甲醛中，用于后續(xù)組織病理學(xué)檢測(cè)。將大鼠關(guān)節(jié)組織用不同濃度的乙醇逐級(jí)脫水，二甲苯透明，包埋，切片，其厚度大約為4μm，再對(duì)其進(jìn)行脫蠟處理，染色試劑行蘇木素-伊紅（HE）染色。顯鏡下觀察大鼠關(guān)節(jié)組織病理學(xué)變化。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 21.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），兩兩比較用LSD法，方差不齊時(shí)用Dunnett′s T法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 大鼠的一般情況對(duì)照組大鼠狀態(tài)良好，毛色光滑，飲食及排便正常，活動(dòng)力良好；模型組大鼠活動(dòng)和進(jìn)食均減少，毛色較暗、干枯，對(duì)刺激的反應(yīng)較為遲鈍；薯蕷皂苷低、中、高組大鼠全身癥狀較模型組減輕，但是精神狀況一般，食欲和活動(dòng)力增加，體表毛發(fā)光澤較好。

3.2 薯蕷皂苷對(duì)RA模型大鼠體質(zhì)量的影響給藥前，與對(duì)照組比較，模型組及薯蕷皂苷低、中、高劑量組大鼠體質(zhì)量明顯降低（P＜0.05）。給藥第5天、第10天、第15天，與對(duì)照組比較，模型組大鼠體質(zhì)量明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，薯蕷皂苷低、中、高劑量組大鼠體質(zhì)量明顯升高（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠不同時(shí)間段的體質(zhì)量比較 （±s，g）

表2 各組大鼠不同時(shí)間段的體質(zhì)量比較 （±s，g）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，＃P＜0.05

組別 n 給藥前 給藥第5天 給藥第10天 給藥第15天.21±10.16模型組 8 248.09±2.87* 284.26±1.12* 294.70±1.68* 309.49±2.08*薯蕷皂苷低劑量組 8 248.35±2.76* 287.25±2.76＃ 298.65±2.62＃ 315.80±1.96＃薯蕷皂苷中劑量組 8 249.58±3.04* 296.98±3.13＃ 306.55±2.34＃ 328.18±2.13＃薯蕷皂苷高劑量組 8 248.86±1.98* 298.72±2.37＃ 324.48±2.46＃ 393.03±2.55對(duì)照組 8 328.33±5.71 374.18±10.52 392.04±12.45 421＃

3.3 薯蕷皂苷對(duì)RA模型大鼠關(guān)節(jié)體積的影響給藥前，與對(duì)照組比較，模型組大鼠足趾體積明顯增大（P＜0.05）。第5天、第10天、第15天，與對(duì)照組比較，模型組大鼠足趾體積明顯增大（P＜0.05）；與模型組比較，薯蕷皂苷低、中、高劑量組大鼠足趾體積明顯減?。≒＜0.05）。見(jiàn)圖1、表3。

表3 各組大鼠不同時(shí)間段的關(guān)節(jié)體積比較 （±s，mL）

表3 各組大鼠不同時(shí)間段的關(guān)節(jié)體積比較 （±s，mL）

注：對(duì)照組比較，*P＜0.05，模型組比較，＃P＜0.05

組別 n 給藥前 第5天 第10天 第15天±0.014模型組 8 0.798±0.045* 0.623±0.047* 0.582±0.055* 0.411±0.042*薯蕷皂苷低劑量組 8 0.654±0.058* 0.585±0.059＃ 0.557±0.076＃ 0.361±0.041＃薯蕷皂苷中劑量組 8 0.692±0.053* 0.565±0.015＃ 0.528±0.080＃ 0.334±0.054＃薯蕷皂苷高劑量組 8 0.680±0.088* 0.536±0.024＃ 0.508±0.063＃ 0.313±0.048對(duì)照組 8 0.087±0.010 0.121±0.032 0.177±0.011 0.197＃

圖1 薯蕷皂苷對(duì)CFA誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)體積的影響

3.4 薯蕷皂苷對(duì)RA模型大鼠血清炎性因子水平的影響與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清IL-1βmRNA、TNF-αmRNA、COX-2 mRNA、IL-6 mRNA水平顯著升高（P＜0.01，P＞0.001）；與模型組比較，薯蕷皂苷低、中、高劑量組大鼠血清IL-1βmRNA、TNF-αmRNA、COX-2 mRNA、IL-6 mRNA水平顯著降低（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001），且呈劑量依賴性。見(jiàn)圖2。

圖2 薯蕷皂苷對(duì)RA模型大鼠血清炎癥因子的影響

3.5 薯蕷皂苷對(duì)RA模型大鼠PGE2表達(dá)水平的影響與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清PGE2水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，薯蕷皂苷低、中、高劑量組大鼠血清PGE2水平顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），且呈劑量依賴性。見(jiàn)圖3。

圖3 薯蕷皂苷對(duì)RA模型大鼠血清PGE2水平的影響

3.6 對(duì)PA模型大鼠踝關(guān)節(jié)組織病理學(xué)改變的影響對(duì)照組大鼠關(guān)節(jié)滑膜平滑完整，結(jié)構(gòu)清晰，無(wú)滑膜增生及炎癥細(xì)胞；模型組大鼠關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)粗糙，滑膜細(xì)胞增生顯著，可見(jiàn)大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)并侵入下層軟骨；薯蕷皂苷低、中、高劑量組大鼠踝關(guān)節(jié)炎癥及浸潤(rùn)到關(guān)節(jié)區(qū)淋巴細(xì)胞的數(shù)目減少，且呈劑量依賴性。見(jiàn)圖4。

圖4 大鼠踝關(guān)節(jié)組織病理變化（HE染色，×200）

4 討論

穿龍薯蕷具有祛風(fēng)濕、活血等功效［2］，主治風(fēng)寒濕痹、勞損扭傷、癰腫等，臨床上主要用于治療冠心病、抗動(dòng)脈粥樣硬化、降血脂、平喘抗炎、抗腫瘤等［3-8］。而薯蕷皂苷是從穿龍薯蕷中提取出來(lái)的一種天然皂苷類(lèi)化合物，主要成分為水糖性總皂苷，本研究觀察其對(duì)RA模型大鼠的研究。

RA是一種以關(guān)節(jié)滑膜慢性炎癥為特征的自身免疫性疾病，主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)疼痛、腫脹和僵硬，出現(xiàn)關(guān)節(jié)骨和軟骨破壞，進(jìn)而導(dǎo)致不可逆的關(guān)節(jié)畸形［9］。以CFA誘導(dǎo)的大鼠模型與人RA的病理過(guò)程類(lèi)似，其誘導(dǎo)RA大鼠模型廣泛用于研究，組織學(xué)特點(diǎn)包括滑膜增生、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、軟骨及骨組織破壞等特征［10］。研究表明，知母總皂苷可明顯改善佐劑型關(guān)節(jié)炎大鼠改善滑膜增生和炎性浸潤(rùn)［11］。本研究觀察到CFA誘導(dǎo)大鼠關(guān)節(jié)炎后，模型組大鼠出現(xiàn)關(guān)節(jié)紅腫、活動(dòng)不便，給予薯蕷皂苷后很大程度上緩解大鼠關(guān)節(jié)腫痛，這與薯蕷皂苷對(duì)膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎模型的作用相近［12-13］，證實(shí)了薯蕷皂苷可緩解RA模型大鼠的關(guān)節(jié)腫痛。但是單用一種動(dòng)物模型有一定的局限性［14］，應(yīng)用多種動(dòng)物模型從不同角度去驗(yàn)證，今后將進(jìn)一步完善，同時(shí)提取人滑膜細(xì)胞進(jìn)一步完善體外實(shí)驗(yàn)。

目前RA的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，但已證實(shí)炎癥反應(yīng)在RA的病理進(jìn)程中發(fā)揮重要作用。目前已開(kāi)發(fā)出多種針對(duì)不同炎癥因子的生物制劑，對(duì)RA的治療發(fā)揮重要作用，但價(jià)格較高［15］。近年來(lái)，薯蕷皂苷元免疫調(diào)節(jié)的作用被逐漸重視［16-18］。穿龍薯蕷總皂苷具有免疫抑制作用。研究表明，穿龍薯蕷皂苷元對(duì)RA模型小鼠的Th1和Th17細(xì)胞可以產(chǎn)生明顯抑制作用，對(duì)Th2細(xì)胞、Treg細(xì)胞有一定的促進(jìn)作用［19-20］，對(duì)膠原誘導(dǎo)小鼠關(guān)節(jié)炎模型有一定的療效，可降低血清和關(guān)節(jié)滑液中IL-1β、IL-6、TNF-α水平，這與本研究結(jié)果一致。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)RA模型大鼠血清中PGE2和COX-2水平明顯升高。COX-2為前列腺素合成過(guò)程的關(guān)鍵酶，該酶在正常細(xì)胞中的含量較低，在TNF-α、IL-1β等炎癥因子作用下，其表達(dá)會(huì)明顯升高，PGE2水平也隨之增高。COX-2及PGE2已成炎癥性疾病及腫瘤治療的重要的靶分子［21］。本研究結(jié)果證實(shí)薯蕷皂苷可降低兩者水平，明確其對(duì)CFA誘導(dǎo)的大鼠模型具有抗炎效應(yīng)。

本研究發(fā)現(xiàn)，RA模型組大鼠滑膜組織中可見(jiàn)大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)；薯蕷皂苷干預(yù)后，中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)減少。提示薯蕷皂苷可能通過(guò)影響氧化應(yīng)激發(fā)揮治療作用。目前認(rèn)為，RA發(fā)病進(jìn)程中的重要促炎因子IL-1β、TNF-α可通過(guò)NADPH氧化酶產(chǎn)生活性氧簇［22］。RA患者的滑膜組織及軟骨是一氧化氮的主要來(lái)源之一。活性氧簇和活性氮簇相互作用可產(chǎn)生大量活性產(chǎn)物，進(jìn)而參與RA疾?。?3］。目前尚無(wú)薯蕷皂苷與氧化應(yīng)激的研究，我們課題組也將進(jìn)一步完善研究。

中醫(yī)藥在治療類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的臨床實(shí)踐中積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)［24-25］，具有良好的應(yīng)用和開(kāi)發(fā)前景。多成分、多靶點(diǎn)、多途徑是中藥治療疾病的特點(diǎn)［26-27］。RA患者的腫瘤發(fā)生率、心血管疾病發(fā)生率較高，薯蕷皂苷除了明顯的免疫調(diào)控作用外，同時(shí)具有抗腫瘤、降血脂作用，對(duì)RA患者的綜合治療很有優(yōu)勢(shì)。通過(guò)本研究明確薯蕷皂苷對(duì)RA的治療作用，為推進(jìn)薯蕷皂苷臨床研究提供更全面的理論依據(jù)。