周倩 李雙陽 徐萍 黃曉宇 陳婧 白雪

(1西南醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院心腦病科，四川 瀘州 646000；2邛崍市中醫(yī)醫(yī)院內(nèi)科；3都江堰市醫(yī)療中心消化內(nèi)科)

動脈粥樣硬化是一種嚴重威脅人類生命健康的心血管疾病。平滑肌細胞(VSMCs)的異常增殖和遷移是動脈粥樣硬化的主要病理基礎〔1〕，抑制主動脈VSMCs的過度增殖和遷移對于動脈粥樣硬化的治療有重要意義。NEAT1是一種長鏈非編碼RNA(LncRNA)，其在胃癌、骨肉瘤、膠質(zhì)瘤等腫瘤細胞中表達升高，促進腫瘤細胞增殖、遷移和侵襲，進而促進腫瘤的發(fā)展進程〔2～4〕。但是，NEAT1對VSMCs增殖、遷移和侵襲的影響還未知。生物信息學軟件預測顯示，NEAT1可能靶向結合miR-504-5p。研究顯示，冠狀動脈粥樣硬化患者血清中miR-504-5p表達降低〔5〕。然而，miR-504-5p對VSMCs增殖、遷移和侵襲的影響也還未知。本研究采用血管緊張素(Ang)Ⅱ誘導VSMCs，探討NEAT1對VSMCs增殖、遷移和侵襲的影響及其可否調(diào)控miR-504-5p表達發(fā)揮作用。

1 材料與方法

1.1細胞和試劑 人主動脈VSMCs購自上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所；胎牛血清(FBS)購自杭州四季青；DMEM培養(yǎng)基、雙熒光素酶活性檢測試劑盒和BCA蛋白檢測試劑盒均購自北京索萊寶；胰蛋白酶、AngⅡ和噻唑藍(MTT)均購自美國Sigma公司；LipofectamineTM2000試劑盒購自美國Invitrogen公司；聚合酶鏈反應(PCR)引物購自上海生工生物工程有限公司；Trizol試劑、逆轉錄試劑盒和PCR試劑盒均購自大連寶生物；si-NEAT1、si-NC、miR-144-3p mimics、miR-NC、anti-miR-504-5p及anti-miR-NC均購自廣州銳博生物技術公司；細胞周期蛋白(Cyclin)D1、 P21、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2和E-鈣黏蛋白(E-cadherin)抗體均購自美國Santa Cruz公司。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 從液氮罐中取出VSMCs凍存管，用鑷子夾住凍存管于37℃水浴中不停搖動，使其在1 min內(nèi)快速溶解。在超凈工作臺中將細胞凍存液轉移至15 ml離心管中，加適量磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗細胞2次。1 000 r/min離心5 min，吸棄PBS，加入少量含10%FBS的 DMEM培養(yǎng)基，混懸細胞，制成單細胞懸液。將單細胞懸液轉移至25 cm2細胞培養(yǎng)瓶中，并置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。及時更換培養(yǎng)基，當細胞融合至80%時，0.25%胰蛋白酶消化，傳代培養(yǎng)。

1.2.2細胞轉染 將對數(shù)期VSMCs細胞接種于6孔板(1.0×105個/孔)。培養(yǎng)24 h后，更換無FBS的培養(yǎng)基。采用LipofectamineTM2000脂質(zhì)體轉染法，分別轉染si-NEAT1、si-NC、miR-504-5p mimics、miR-NC、共轉染si-NEAT1與anti-miR-504-5p、si-NEAT1與anti-miR-NC。轉染12 h后，更換為含10% FBS的 DMEM培養(yǎng)基。再培養(yǎng)24 h，實時熒光定量-聚合酶鏈反應(qRT-PCR),檢測NEAT1或miR-504-5p水平評價轉染效果，并收集細胞用于后續(xù)實驗。

1.2.3qRT-PCR檢測細胞中NEAT1和miR-504-5p表達水平 Trizol試劑提取細胞中總RNA，經(jīng)逆轉錄為cDNA后，行PCR擴增。NEAT1正向序列5′-GUCUGUGUGGAAGGAGGAATT-3′，反向序列5′-UUCCUCCUUCCACACAGACTT-3′；GAPDH正向序列5′-GTCAACGGATTTGGTCTGTATT-3′，反向序列5′-AGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3′；miR-504-5p正向序列5′-AGACCCTGGCATGGAACGT-3′，反向序列5′-GGTCCTGGAACTGACGTGG-3′；U6正向序列5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反向序列5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。2-△△Ct法計算NEAT1相對于GAPDH、miR-504-5p相對于U6的表達量。

1.2.4細胞分組 未轉染的VSMCs分為對照組和AngⅡ組，其中對照組細胞常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)；AngⅡ組細胞用含10-7mol/L〔6〕AngⅡ的培養(yǎng)基培養(yǎng)。轉染si-NEAT1、si-NC、miR-504-5p mimics、miR-NC、共轉染si-NEAT1與anti-miR-504-5p、si-NEAT1與anti-miR-NC的細胞均使用10-7mol/L AngⅡ的培養(yǎng)基培養(yǎng)，并依次標記為AngⅡ+si-NEAT1組、AngⅡ+si-NC組、AngⅡ+miR-504-5p組、AngⅡ+miR-NC組、AngⅡ+si-NEAT1+anti-miR-504-5p組、AngⅡ+si-NEAT1+anti-miR-NC組。

1.2.5MTT檢測細胞增殖活性 VSMCs或轉染后的VSMCs均接種于96孔板中(2.5×104個/孔)，培養(yǎng)12 h后，按1.2.4分組處理。分別培養(yǎng)24、48、72 h后，加20 μl MTT(5 mg/ml)。孵育4 h，棄培養(yǎng)基，加150 μl二甲基亞砜，振蕩混勻后，于酶標儀490 nm處測光密度(OD)值。

1.2.6Transwell檢測細胞遷移和侵襲 將VSMCs或轉染后的各組VSMCs均接種于6孔板中(1.0×105個/孔)，培養(yǎng)12 h后，按1.2.4分組處理。培養(yǎng)24 h后，收集各組細胞，并將細胞密度調(diào)整為5.0×104個/ml。遷移實驗：在Transwell上室加100 μl各組細胞懸液，下室加500 μl含F(xiàn)BS的RPMI 1640培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h，棄培養(yǎng)基，用4%多聚甲醛固定30 min。然后再用0.4%結晶紫染色15 min，倒置顯微鏡觀察并計數(shù)。侵襲實驗：預先在Transwell上室鋪基質(zhì)膠，自然晾干后，再加100 μl細胞懸液，后續(xù)操作同遷移實驗。

1.2.7雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?由上海生工生物工程有限公司根據(jù)靶基因在線軟件預測顯示的NEAT1與miR-504-5p的結合位點，構建NEAT1野生型熒光素酶報告載體(NEAT1-WT)，并利用基因突變技術將結合位點突變，構建NEAT1突變型光素酶報告載體(NEAT1-MUT)。將對數(shù)期VSMCs接種于6孔板(1.0×105個/孔)。培養(yǎng)24 h后，更換無FBS的培養(yǎng)基。采用LipofectamineTM2000脂質(zhì)體轉染法，分別共轉染W(wǎng)T-NEAT1與miR-504-5p mimics或miR-NC、MUT-NEAT1與miR-504-5p mimic或miR-NC。轉染12 h后，更換為含10%FBS的 DMEM培養(yǎng)基。再培養(yǎng)24 h后，收集細胞。加細胞裂解液將細胞充分裂解，離心(3 500 r/min、5 min)后取上清，利用雙熒光素酶活性檢測試劑盒檢測熒光素酶活性，結果以螢火蟲與海參的熒光強度比值表示。

1.2.8Western印跡檢測蛋白表達 將VSMCs或轉染后的各組VSMCs均接種于6孔板中(1.0×105個/孔)，培養(yǎng)12 h后，按1.2.4分組處理。再培養(yǎng)24 h后，收集各組細胞。用RIPA試劑提取細胞中總蛋白，經(jīng)BCA法定量、電泳、轉膜及封閉后，分別于CyclinD1(稀釋度1∶600)、P21(稀釋度1∶800)、MMP-2(稀釋度1∶400)、E-cadherin(稀釋度1∶1 000)和GAPDH(稀釋度1∶1 000)一抗中4℃孵育過夜。洗膜后，再于山羊抗兔二抗中37℃孵育1 h。最后滴加顯影液避光顯影，曝光拍照，Image J軟件分析目的蛋白相對于GAPDH表達量。

1.3統(tǒng)計學方法 采用SPSS22.0軟件進行獨立樣本t檢驗、單因素方差分析、SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1AngⅡ?qū)SMCs NEAT1和miR-504-5p表達的影響 AngⅡ組NEAT1水平明顯高于對照組，而miR-504-5p水平明顯低于對照組(均P<0.001)。見表1。

表1 NEAT1、miR-504-5p在AngⅡ作用的VSMCs中的表達

2.2敲減NEAT1對誘導的VSMCs增殖的影響 轉染si-NEAT1的VSMCs中NEAT1表達量(0.25±0.02)明顯低于轉染si-NC的VSMCs(1.00±0.05，t=41.781，P<0.05)，說明敲減NEAT1的VSMCs構建成功。AngⅡ組CyclinD1水平和24 h、48 h、72 h細胞活性明顯高于對照組，而P21水平明顯低于對照組(均P<0.05)；AngⅡ+si-NEAT1組CyclinD1水平和24 h、48 h、72 h細胞活性明顯低于AngⅡ+si-NC組，而P21水平明顯高于AngⅡ+si-NC組(均P<0.05)。見圖1、表2。

1～4：對照組、AngⅡ組、AngⅡ+si-NC組、AngⅡ+si-NEAT1組

表2 敲減NEAT1對AngⅡ誘導的VSMCs增殖的影響

2.3敲減NEAT1對AngⅡ誘導的VSMCs遷移和侵襲的影響 與對照組比較，AngⅡ組遷移細胞數(shù)和侵襲細胞數(shù)明顯升高(均P<0.05)，MMP-2蛋白水平明顯升高(P<0.05)，而E-cadherin蛋白水平明顯降低(P<0.05)。與AngⅡ+si-NC組比較，AngⅡ+si-NEAT1組遷移細胞數(shù)和侵襲細胞數(shù)明顯減少(均P<0.05)，MMP-2蛋白水平明顯降低(P<0.05)，而E-cadherin蛋白水平明顯升高(P<0.05)。見圖2、表3、圖3。

圖2 AngⅡ誘導的敲減NEAT1的VSMCs細胞遷移、侵襲(結晶紫，×200)

表3 抑制NEAT1對AngⅡ作用的VSMCs遷移、侵襲的影響

1～4:對照組、AngⅡ組、AngⅡ+si-NC組、AngⅡ+si-NEAT1組

2.4NEAT1靶向調(diào)控miR-504-5p表達 生物信息學軟件預測顯示的NEAT1與miR-504-5p的結合位點見圖4。雙熒光素酶活性檢測結果顯示，與miR-NC組比較，miR-504-5p組WT-NEAT1水平明顯降低(P<0.05)，見表4。轉染si-NEAT1的VSMCs中miR-504-5p表達量(2.16±0.21)明顯高于轉染si-NC的VSMCs(1.00±0.01，t=16.553，P<0.05)，說明敲減NEAT1可促進VSMCs中miR-504-5p的表達。

圖4 NEAT1與miR-504-5p的核苷酸序列存在結合位點

表4 雙熒光素酶報告實驗

2.5過表達miR-504-5p對AngⅡ誘導的VSMCs增殖、遷移和侵襲的影響 轉染miR-504-5p mimics的VSMCs中NEAT1表達量(2.23±0.2)明顯高于轉染miR-NC的VSMCs(1.00±0.04，t=16.502，P<0.05)，說明過表達miR-504-5p的VSMCs構建成功。與AngⅡ+miR-NC組比較，AngⅡ+miR-504-5p組CyclinD1、MMP-2水平明顯降低，24 h、48 h及72 h細胞活性明顯降低，遷移和侵襲細胞數(shù)明顯減少，而P21、E-cadherin水平明顯升高(均P<0.05)。見表5、圖5、圖6。

表5 過表達miR-504-5p對AngⅡ誘導的VSMCs增殖、遷移、侵襲的影響

圖5 AngⅡ誘導的過表達miR-504-5p的VSMCs遷移和侵襲(結晶紫,×200)

圖6 AngⅡ誘導的過表達miR-504-5p的VSMCs相關蛋白表達

2.6敲減miR-504-5p降低敲減NEAT1對AngⅡ誘導的VSMCs增殖、遷移和侵襲的作用 與AngⅡ+si-NEAT1+anti-miR-NC組相比，AngⅡ+si-NEAT1+anti-miR-504-5p組遷移和侵襲細胞數(shù)明顯增加，24 h、48 h及72 h細胞活性明顯升高，CyclinD1及MMP-2水平明顯增加，而P21和E-cadherin水平明顯下降(均P<0.05)。見表6、圖7、圖8。

表6 敲減miR-504-5p降低敲減NEAT1對AngⅡ誘導的VSMCs增殖、遷移、侵襲的作用

1～2：AngⅡ+si-NEAT1+anti-miR-NC組、AngⅡ+si-NEAT1+anti-miR-504-5p組，下圖同

圖8 AngⅡ誘導的共轉染si-NEAT1與anti-miR-504-5p的VSMCs相關蛋白表達

3 討 論

動脈粥樣硬化是多種原因?qū)е碌膹碗s疾病，多發(fā)生于老年人。血管VSMCs是血管壁的重要組成部分，其過度增殖和遷移可促進動脈粥樣硬化病變形成〔7〕。AngⅡ是已知的縮血管活性物質(zhì)之一，在維持血管壁的結構和完整性中起重要作用。Zhang等〔8〕研究顯示，AngⅡ可促進VSMCs增殖、遷移和侵襲，這與本研究結果一致，說明AngⅡ可促進動脈粥樣硬化的發(fā)展進程。LncRNA可在轉錄、轉錄后、表觀遺傳等多個方面參與調(diào)控細胞的增殖、遷移和侵襲等生物學行為，其在動脈粥樣硬化發(fā)病機制中的作用越來越受到重視〔9〕。Cui等〔10〕研究顯示，LncRNA 430945在動脈粥樣硬化組織中升高，上調(diào)LncRNA 430945可促進AngⅡ誘導的VSMCs增殖和遷移，其作用機制可能與激活ROR2/RhoA信號傳導途徑有關。劉彥廷等〔11〕研究顯示，LncRNA GASL1可能通過激活Wnt/β-catenin信號通路促進血管VSMCs增殖。

作為一種lncRNA，NEAT1參與多種疾病的發(fā)展進程。Wang等〔12〕研究顯示，NEAT1在骨肉瘤細胞中高表達，敲減NEAT1可有效阻礙骨肉瘤細胞增殖和侵襲，NEAT1有可能成為骨肉瘤治療的分子靶點。Mang等〔13〕研究顯示，NEAT在肝細胞癌組織中表達上調(diào)，下調(diào)NEAT能夠降低肝細胞癌細胞的增殖、侵襲和遷移能力，延緩肝癌發(fā)展進程。但目前，NEAT1對VSMCs增殖、遷移和侵襲的影響還未知。本研究結果提示敲減NEAT1對AngⅡ誘導的VSMCs增殖、遷移和侵襲發(fā)揮抑制作用。CyclinD1和P21是細胞增殖的關鍵調(diào)控分子，其中CyclinD1表達的升高可促進細胞周期進程，進而促進細胞增殖，而P21對細胞增殖起抑制作用〔14〕。MMP-2表達的增加可加劇細胞外基質(zhì)的降解，進而促進細胞遷移和侵襲〔15〕。E-cadherin是上皮蛋白標志物，可維持細胞與細胞間的黏附能力，其表達增加抑制細胞的遷移和侵襲〔16〕。本研究結果說明敲減NEAT1抑制AngⅡ誘導的VSMCs增殖、遷移和侵襲，NEAT1可能是動脈粥樣硬化治療的潛在靶點。

本研究證實了NEAT1在VSMCs中靶向結合并負調(diào)控miR-504-5p表達。miR-504-5p是一種腫瘤抑制因子，在下咽鱗狀細胞癌、非小細胞肺癌等腫瘤中表達降低，過表達miR-504-5p對腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲具有明顯的抑制作用，可通過上調(diào)miR-504-5p表達抑制腫瘤的發(fā)展進程〔17,18〕。

本研究結果提示miR-504-5p對動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展也起抑制作用，NEAT1可能通過靶向負調(diào)控miR-504-5p的表達來影響AngⅡ誘導的VSMCs增殖、遷移和侵襲，但其具體影響的miR-504-5p的靶基因還有待進一步探究。