潘林鑫，李 玉，徐 濤，錢 成

(安徽醫(yī)科大學(xué) 1.生命科學(xué)學(xué)院，2.藥學(xué)院，3.科研實(shí)驗(yàn)中心，4.炎癥免疫性疾病安徽省實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230032)

肝炎是一種常見的消化系統(tǒng)疾病，其種類繁多、病因復(fù)雜、發(fā)病率高，且隨著病情的發(fā)展，肝臟細(xì)胞遭到持續(xù)地破壞，細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)成分過度異常地沉積，導(dǎo)致肝臟結(jié)構(gòu)發(fā)生病理性改變，損害肝臟代謝功能，進(jìn)一步發(fā)展成為肝纖維化，甚至肝癌，嚴(yán)重威脅著人類的生命健康[1-2]。肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell，HSC)是ECM的主要來源，其持續(xù)增殖與活化是肝臟炎性損傷和纖維化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[3-4]，在肝細(xì)胞癌的發(fā)病機(jī)制中也扮演著重要角色[5]。TMEM173是一種存在于宿主細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的跨膜蛋白，人源的TMEM173由379個(gè)氨基酸組成，其N端(1～137AA)為4次跨膜結(jié)構(gòu)域，C端包含一個(gè)CTD結(jié)構(gòu)域，可以結(jié)合胞質(zhì)中細(xì)菌分泌的重要第二信使環(huán)二核苷酸(cyclic dinucleotides,CDNs)，激活TBK1和IRF3抗病毒細(xì)胞信號(hào)通路，誘導(dǎo)抗感染的固有免疫反應(yīng)[6-7]。有研究表明TMEM173與非酒精性脂肪肝和肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，且在HSC活化過程中扮演著重要角色[8-9]，本研究通過構(gòu)建pEGFP-C2-TMEM173表達(dá)載體和設(shè)計(jì)合成TMEM173-siRNA來調(diào)節(jié)TMEM173在活化LX-2細(xì)胞中的表達(dá)變化，旨在研究TMEM173對HSC活化過程中細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)控作用，為進(jìn)一步探究其在肝炎和纖維化中的功能奠定基礎(chǔ)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 載體、菌株和細(xì)胞pEGFP-C2載體、DH5α感受態(tài)菌株、LX-2細(xì)胞株由校實(shí)驗(yàn)中心實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑引物合成自安徽通用生物有限公司；T4 DNA連接酶(B110041)購于生工生物公司；DMEM培養(yǎng)基(SH30081.01)購于澳洲HyClone公司；胎牛血清(FB25015)購于美國CLARK公司；Lipo8000脂質(zhì)體(C0533)、細(xì)胞裂解液(P0013B)、PMSF蛋白酶抑制劑(ST506)、一抗稀釋液(P0023A)、總RNA抽提試劑盒(R0028)購于上海碧云天公司；Evo M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑預(yù)混液(AG11706)、SYBR Green熒光定量PCR預(yù)混液(AG11701)購于中國AG生物公司；Opti-MEM轉(zhuǎn)染液(31985070)購于美國Invitrogen公司；細(xì)胞凋亡試劑盒(559763)購于美國BD公司；PVDF膜購于美國Millipore公司；各抗體購于美國Proteintech公司。

1.3 主要儀器AL600RGB凝膠成像系統(tǒng)購自美國GE公司；Axio Observer 3倒置熒光顯微鏡購自德國卡爾蔡司公司、MoFlo XDP超速流式細(xì)胞分選儀購自美國Beckman公司；CytoFlex流式細(xì)胞分析儀購自美國Beckman公司。

1.4 質(zhì)粒構(gòu)建設(shè)計(jì)并合成引物序列：上游引物：5′-CCGGAATTCCGGATGCCCCACTCCAGCCT-3′；下游引物：5′-CGGGATCCCGTCAAGAGAAATCCGTGC-3′，以含人TMEM173全長cDNA序列的質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增出TMEM173的CDS序列，將產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，并利用膠回收試劑盒進(jìn)行回收，得到其PCR純化產(chǎn)物，利用限制性內(nèi)切酶EcoR I和BamH I對TMEM173的PCR純化產(chǎn)物和pEGFP-C2空載體分別進(jìn)行雙酶切，用T4 DNA連接酶將二者的酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化于DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，37 ℃培養(yǎng)至單克隆生成，分別挑取數(shù)個(gè)單克隆進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，并抽提菌液中的質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定(EcoR I和BamH I)，選擇鑒定正確的重組質(zhì)粒送公司進(jìn)行測序。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)復(fù)蘇LX-2細(xì)胞，并用完全培養(yǎng)基(10% FBS+90% DMEM高糖+青鏈霉素)在5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)及時(shí)更換完全培養(yǎng)基，待細(xì)胞密度達(dá)到90%以上時(shí)即可進(jìn)行傳代，并取適量細(xì)胞重新接種至新的培養(yǎng)瓶中，用于后續(xù)的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。

1.6 轉(zhuǎn)染本研究采用脂質(zhì)體(Lipo8000)轉(zhuǎn)染法，以十二孔板為例，步驟如下：先后將pEGFP-C2-TMEM173、TMEM173-siRNA及其對照(各1 μg)和Lipo8000(1.6 μL)加入到50 μL Opti-MEM轉(zhuǎn)染液中，輕輕充分混勻后，將溶液加入待轉(zhuǎn)染的LX-2細(xì)胞中，繼續(xù)培養(yǎng)24-48 h，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.7 QPCR檢測收集實(shí)驗(yàn)處理后的各組細(xì)胞，用TRIzol法提取細(xì)胞的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，設(shè)計(jì)并合成引物，引物序列見Tab 1。將cDNA模板、引物和SYBR?Green supermix核酸染料按一定比例加入反應(yīng)體系中，并利用RT-PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增，并分析結(jié)果。

Tab 1 Primer sequence

1.8 Western blot轉(zhuǎn)染約24 h后，收集LX-2細(xì)胞進(jìn)行裂解(4 ℃)，30 min后收集裂解液進(jìn)行高速冷凍離心并收集上清液，蛋白定量后取出適量上清液，加入等量2× SDS上樣緩沖液充分混勻后沸水浴5 min，冰浴后取適量蛋白樣品先后進(jìn)行 SDS-PAGE電泳(100 V，2 h)和恒流濕轉(zhuǎn)(200 mA，1 h)，取出PVDF膜室溫封閉1 h，TBST溶液洗膜后加入一抗 (1 ∶500)進(jìn)行孵育(4 ℃過夜)，TBST洗膜后加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1 ∶5 000)進(jìn)行孵育(室溫1 h)，TBST溶液洗膜后用ECL化學(xué)發(fā)光液進(jìn)行顯色，在蛋白成像儀上進(jìn)行顯影和拍攝。

1.9 免疫熒光轉(zhuǎn)染約24 h后，取出LX-2細(xì)胞爬片，用預(yù)冷的PBS清洗3次后進(jìn)行細(xì)胞固定(-20 ℃預(yù)冷甲醇2 min+70%乙醇5 min)，由于GFP能夠自發(fā)綠色熒光，因此無需進(jìn)行一抗和二抗孵育，固定后用PBS清洗3次后進(jìn)行細(xì)胞核染色(0.15 g·L-1DAPI，2 min)，棄DAPI溶液后用PBS清洗3次后，用熒光封片膠將蓋玻片封于載玻片上，在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.10 MTT細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)染約24 h后棄去各組細(xì)胞的培養(yǎng)基，更換為無血清培養(yǎng)液，然后每孔加入20 μL的MTT (5 g·L-1)，37 ℃繼續(xù)孵育4 h后，棄上清并每孔加150 μL DMSO溶解細(xì)胞內(nèi)結(jié)晶，室溫振蕩溶解10 min后于492 nm波長處測吸光度(A值)。

1.11 EdU細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)染約24 h后加入EdU工作液至終濃度為10 μmol·L-1，37 ℃繼續(xù)孵育4 h后去除培養(yǎng)液，并加入4%的多聚甲醛室溫固定15 min，洗滌液洗滌細(xì)胞3次后加入含0.3% Triton X-100的PBS進(jìn)行室溫透化15 min，洗滌液洗滌細(xì)胞3次后加入Click反應(yīng)液室溫避光孵育30 min，然后使用Hoechst 33342進(jìn)行細(xì)胞核染色，并在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.12 細(xì)胞周期轉(zhuǎn)染約24 h后，用不含EDTA的胰酶消化并收集實(shí)驗(yàn)處理后的各組細(xì)胞(濃度大約為1×109·L-1)，預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次后加入100 μL預(yù)冷的結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，依此加入5 μL PE Annexin V 和5 μL 7-AAD后輕輕混懸細(xì)胞，于室溫(25 ℃)避光條件下反應(yīng)15 min，然后加入400 μL結(jié)合緩沖液，4 ℃避光保存，在24 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測。

2 結(jié)果

2.1 pEGFP-C2-TMEM173真核表達(dá)載體的構(gòu)建與熒光表達(dá)對pEGFP-C2-TMEM173的連接產(chǎn)物進(jìn)行轉(zhuǎn)化，并挑取4個(gè)單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)后進(jìn)行質(zhì)粒抽提，然后進(jìn)行雙酶切(EcoR I和BamH I)鑒定，并對酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳，結(jié)果如Fig1A顯示，有2個(gè)質(zhì)粒酶切后出現(xiàn)了兩條亮帶，與DNA Marker橫向比較，發(fā)現(xiàn)其中一條大小約為4 700 bp，與pEGFP-C2空載體酶切產(chǎn)物的大小一致，另一條大小分別約為1 140 bp，與TMEM173目的片段大小一致，表明各重組質(zhì)粒連接成功，選取其中一個(gè)陽性克隆送生物公司進(jìn)行DNA測序，并將測序結(jié)果與TMEM173的CDS序列進(jìn)行比較分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)二者的堿基序列完全一致。將pEGFP-C2-TMEM173瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至LX-2細(xì)胞中，約24 h后在熒光顯微鏡下觀察TMEM173的過表達(dá)情況，結(jié)果如Fig1B所示，具有綠色熒光的細(xì)胞即為表達(dá)成功的細(xì)胞。進(jìn)一步利用激光共聚焦技術(shù)對TMEM173的細(xì)胞亞定位進(jìn)行了觀察，結(jié)果如Fig1C所示，pEGFP-C2-TMEM173過表達(dá)后主要定位在細(xì)胞質(zhì)中。綜上表明pEGFP-C2-TMEM173真核表達(dá)載體成功構(gòu)建并表達(dá)。

Fig 1 Restriction enzyme identification and fluorescent expression of pEGFP-C2-TMEM173A:The restriction enzyme identification of pEGFP-C2-TMEM173,M:DNA marker;1-4:the enzyme digestion products of pEGFP-C2-TMEM173;5:the enzyme digestion products of pEGFP-C2.B:Fluorescent expression of pEGFP-C2-TMEM173 after transfection for 24 hours.C:Subcellular localization of pEGFP-C2-TMEM173,GFP showed the green fluorescence localization of GFP-TMEM173 in LX-2;DAPI staining showed the nucleus;MERGE showed the superposition of GFP and DAPI.

2.2 TMEM173過表達(dá)和沉默效果檢測分別將pEGFP-C2-TMEM173(pEGFP-C2為對照)和TMEM173-siRNA(NC-siRNA為對照)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至LX-2細(xì)胞中，約24 h后收集各組細(xì)胞提取總RNA和總蛋白，并檢測TMEM173的過表達(dá)和沉默效果。QPCR結(jié)果如Fig2A、B所示，與空白組和對照組相比，pEGFP-C2-TMEM173組細(xì)胞中TMEM173的mRNA表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)，反之，TMEM173-siRNA組則明顯降低(P<0.05)。另外，Western blot結(jié)果如Fig2C、D所示，當(dāng)用TMEM173抗體進(jìn)行免疫印跡時(shí)，與空白組和對照組相比，pEGFP-C2-TMEM173組在約64 ku的位置還出現(xiàn)了明顯的蛋白條帶，即為GFP-TMEM173融合蛋白(27 ku+37 ku)的表達(dá)；反之，TMEM173 -siRNA組細(xì)胞中的TMEM173的蛋白表達(dá)水平則明顯降低(P<0.05)，表明TMEM173在LX-2細(xì)胞中能夠成功過表達(dá)和沉默。

Fig 2 Effect of TMEM173 overexpression and silencingA and C:The QPCR and Western blot results of TMEM173 overexpression in LX-2 cells,1:Untransfected LX-2 cells;2:LX-2 cells transfected with pEGFP-C2;3:LX-2 cells transfected with pEGFP-C2-TMEM173.B and D:The QPCR and Western blot results of TMEM173 silencing in LX-2 cells,4:Untransfected LX-2 cells;5:LX-2 cells transfected with NC-siRNA;6:LX-2 cells transfected with TMEM173-siRNA.*P<0.05 vs control group.

2.3 TGF-β1誘導(dǎo)LX-2細(xì)胞活化α-SMA表達(dá)量的增加是HSC活化的主要標(biāo)志，分別在LX-2細(xì)胞中按時(shí)間和濃度梯度加入TGF-β1進(jìn)行刺激，分別收集各組細(xì)胞提取總RNA和總蛋白進(jìn)行QPCR和WB檢測。結(jié)果顯示，當(dāng)TGF-β1誘導(dǎo)12 h后，α-SMA的mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯升高，且隨著誘導(dǎo)時(shí)間的遞增呈上升趨勢，存在一定的時(shí)間依耐性，見Fig3A；當(dāng)TGF-β1誘導(dǎo)濃度為10 μg·L-1時(shí)，α-SMA的mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯升高，且隨著誘導(dǎo)濃度的遞增呈上升趨勢，同樣存在一定的濃度依耐性，見Fig3B。綜上表明10 μg·L-1的TGF-β1誘導(dǎo)12 h后即可使LX-2細(xì)胞活化。

Fig 3 Activation of LX-2 cells induced by TGF-β 1A:The mRNA and protein expression levels of α-SMA were detected after LX-2 cells were induced by TGF-β1 in time gradient.B:The mRNA and protein expression levels of α-SMA were detected after LX-2 cells were induced by TGF-β1 in concentration gradient.*P<0.05 vs control group.

2.4 TMEM173過表達(dá)和沉默對活化LX-2細(xì)胞增殖的影響在TGF-β1誘導(dǎo)LX-2細(xì)胞12 h后，分別將pEGFP-C2-TMEM173(pEGFP-C2為對照)和TMEM173-siRNA(NC-siRNA為對照)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至LX-2細(xì)胞中，約24 h后分別用MTT和EdU法檢測各組細(xì)胞的增殖情況，結(jié)果如Tab 2和Fig4所示，與空白組和對照組相比，pEGFP-C2-TMEM173組細(xì)胞的增殖率明顯升高(P<0.05)，反之，TMEM173-siRNA組細(xì)胞的增殖率則明顯降低(P<0.05)。表明TMEM173過表達(dá)能夠明顯促進(jìn)活化LX-2細(xì)胞的增殖，而其沉默則能發(fā)揮明顯的抑制增殖作用。

2.5 TMEM173過表達(dá)和沉默對活化LX-2細(xì)胞凋亡的影響在TGF-β1誘導(dǎo)LX-2細(xì)胞12 h后，分別將pEGFP-C2-TMEM173(pEGFP-C2為對照)和TMEM173-siRNA(NC-siRNA為對照)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至LX-2細(xì)胞中，約24 h后收集各組細(xì)胞，分別進(jìn)行PE Annexin V和7-AAD染色，然后利用流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞的凋亡情況，結(jié)果如Tab 3和Fig5所示，與空白組和對照組相比，pEGFP-C2-TMEM173組細(xì)胞的凋亡率明顯降低(P<0.05)，反之，TMEM173-siRNA組細(xì)胞的凋亡率則明顯升高(P<0.05)。表明TMEM173過表達(dá)能夠明顯抑制活化LX-2細(xì)胞的增殖，而其沉默則能發(fā)揮明顯的促進(jìn)凋亡作用。

Tab 2 Effects of TMEM173 overexpression and silencing on proliferation of activated LX-2 cells

Tab 3 Effects of TMEM173 overexpression and silencing on apoptosis of activated LX-2 cells

Fig 4 Effects of TMEM173 overexpression and silencing on proliferation of activated LX-2 cellsA:Effect of TMEM173 overexpression on the proliferation of activated LX-2 cells,1:Blank group without transfection;2:Control group transfected with pEGFP-C2;3:Overexpression group transfected with pEGFP-C2-TMEM173.B:Effect of TMEM173 silencing on the proliferation of activated LX-2 cells,4:Blank group without transfection;5:Control group transfected with NC-siRNA;6:Silencing group transfected with TMEM173-siRNA.*P<0.05 vs control group.

Fig 5 Effects of TMEM173 overexpression and silencing on apoptosis of activated LX-2 cellsA:Effect of TMEM173 overexpression on apoptosis of activated LX-2 cells,1:Blank group without transfection;2:Control group transfected with pEGFP-C2;3:Overexpression group transfected with pEGFP-C2-TMEM173.B:Effect of TMEM173 silencing on apoptosis of activated LX-2 cells,4:Blank group without transfection;5:Control group transfected with NC-siRNA;6:Silencing group transfected with TMEM173-siRNA.*P<0.05 vs control group.

2.6 TMEM173對活化LX-2細(xì)胞的增殖和凋亡相關(guān)通路蛋白表達(dá)的影響在TGF-β1誘導(dǎo)LX-2細(xì)胞12 h后，分別將pEGFP-C2-TMEM173(pEGFP-C2為對照)和TMEM173-siRNA(NC-siRNA為對照)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至LX-2細(xì)胞中，約24 h后收集各組細(xì)胞提取總蛋白，定量分析后進(jìn)行Western blot檢測，分別用PCNA、Bcl-2、Bax、cleaved-caspase-3和cleaved-PARP等抗體進(jìn)行免疫印跡，結(jié)果如Fig6所示，與空白組和對照組相比，pEGFP-C2-TMEM173組細(xì)胞中PCNA和Bcl-2的蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)(P<0.05)，且Bax、cleaved-caspase-3和cleaved-PARP則明顯下調(diào)(P<0.05)；反之，TMEM173 -siRNA組細(xì)胞中PCNA和Bcl-2的蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)(P<0.05)，且Bax、cleaved-caspase-3和cleaved-PARP則明顯上調(diào)(P<0.05)，表明TMEM173的表達(dá)變化對增殖和凋亡相關(guān)通路蛋白具有調(diào)控作用，進(jìn)而發(fā)揮其促增殖和抑凋亡的作用。

Fig 6 Effect of TMEM173 on expression of proliferation and apoptosis related pathway proteins in activated LX-2 cellsA:Effect of TMEM173 overexpression on the expression of proliferation and apoptosis related pathway proteins in activated LX-2 cells,1:Blank group without transfection;2:Control group transfected with pEGFP-C2;3:Overexpression group transfected with pEGFP-C2-TMEM173.B:Effect of TMEM173 silencing on the expression of proliferation and apoptosis related pathway proteins in activated LX-2 cells,4:Blank group without transfection;5:Control group transfected with NC-siRNA;6:Silencing group transfected with TMEM173-siRNA.*P<0.05 vs control group.

2.7 TMEM173對cGAS-STING通路活化的影響在TGF-β1誘導(dǎo)LX-2細(xì)胞12 h后，分別將pEGFP-C2-TMEM173(pEGFP-C2為對照)和TMEM173-siRNA(NC-siRNA為對照)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至LX-2細(xì)胞中，約24 h后收集各組細(xì)胞提取總蛋白，定量分析后進(jìn)行Western blot檢測，分別用TBK1和IRF3抗體進(jìn)行免疫印跡，結(jié)果如Fig7所示，與空白組和對照組相比，pEGFP-C2 -TMEM173組細(xì)胞中TBK1和IRF3的蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)(P<0.05)，反之，TMEM173-siRNA組細(xì)胞中TBK1和IRF3的蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)(P<0.05)。表明TMEM173的表達(dá)變化對cGAS-STING通路的活化具有調(diào)控作用。

Fig 7 Effect of TMEM173 on activation of cGAS-STING pathwayA:Effect of TMEM173 overexpression on activation of cGAS-STING pathway,1:Blank group without transfection;2:Control group transfected with pEGFP-C2;3:Overexpression group transfected with pEGFP-C2-TMEM173.B:Effect of TMEM173 silencing on activation of cGAS-STING pathway,4:Blank group without transfection;5:Control group transfected with NC-siRNA;6:Silencing group transfected with TMEM173-siRNA.*P<0.05 vs control group.

3 討論

HSC占肝臟固有細(xì)胞總數(shù)的15%，占非實(shí)質(zhì)細(xì)胞的30%左右。HSC是細(xì)胞外基質(zhì)的主要來源，各種致纖維化因素均把其作為最終靶細(xì)胞，當(dāng)肝臟受到炎癥或機(jī)械刺激等損傷時(shí)，其被激活并轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞，其表型便由靜止型轉(zhuǎn)變?yōu)榧せ钚?。激活的肝星狀?xì)胞通過增生和分泌細(xì)胞外基質(zhì)參與肝纖維化的形成和肝內(nèi)結(jié)構(gòu)的重建，最終奠定了肝纖維化的病理學(xué)基礎(chǔ)。本研究涉及的LX-2細(xì)胞是最常見的HSC體外細(xì)胞模型之一，其保留著活化HSC的關(guān)鍵特征，如細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)、神經(jīng)元基因表達(dá)、維甲酸代謝和纖維形成等，廣泛應(yīng)用于肝炎及纖維化的體外研究[10-11]。

TMEM173又稱為STING、MPYS或ERIS，其具有高度的保守性，在不同真核細(xì)胞和無脊椎動(dòng)物中都存在同源物，人源與鼠源的TMEM173的相似性高達(dá)81%[12]。TMEM173高表達(dá)于一些免疫細(xì)胞來源的細(xì)胞系，提示其可能在免疫系統(tǒng)中具有重要功能。而且TMEM173本身還可以作為受體，直接結(jié)合細(xì)菌分泌的重要第二信使——環(huán)二核苷酸(cyclic dinucleotides，CDNs)，誘導(dǎo)抗感染的固有免疫反應(yīng)[13-14]。有研究表明TMEM173在非酒精性脂肪肝患者肝組織中表達(dá)水平明顯增加，DMXAA誘導(dǎo)能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的小鼠肝臟炎癥和纖維化因子的表達(dá)，并增強(qiáng)HSC的活化[9]。

本研究旨在探索TMEM173對活化LX-2的細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)控功能。TGF-β1是肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞受損后釋放的強(qiáng)效致纖維化因子，是啟動(dòng)鄰近靜息態(tài)HSC活化的重要初始信號(hào)之一，因此，在本研究中我們首先利用TGF-β1刺激LX-2建立人肝星狀細(xì)胞體外活化模型。然后我們通過改變活化LX-2細(xì)胞中TMEM173的表達(dá)水平來研究其對細(xì)胞增殖和凋亡的影響，一方面利用基因重組技術(shù)構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-C2-TMEM173來提高LX-2細(xì)胞中TMEM173的表達(dá)水平，另一方面設(shè)計(jì)并合成TMEM173-siRNA來降低TMEM173的表達(dá)水平，且QPCR和Western blot結(jié)果顯示二者能夠達(dá)到TMEM173預(yù)期的過表達(dá)和沉默效果。緊接著我們分別在活化的LX-2細(xì)胞中過表達(dá)和沉默了TMEM173，并分別利用MTT和FCM技術(shù)檢測了其增殖和凋亡情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TMEM173過表達(dá)能夠明顯促進(jìn)細(xì)胞增殖和抑制細(xì)胞凋亡，而沉默TMEM173則能夠得到相反的結(jié)果。

為探索TMEM173促增殖、抑凋亡的分子機(jī)制，我們進(jìn)一步細(xì)胞增殖和凋亡標(biāo)志蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行了檢測。增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)是一類只存在于增殖細(xì)胞中的階段性表達(dá)的蛋白質(zhì)，其濃度在細(xì)胞周期中呈周期性變化，檢測其表達(dá)水平可以作為評價(jià)細(xì)胞增殖狀態(tài)的重要指標(biāo)[15]，本研究發(fā)現(xiàn)TMEM173過表達(dá)后能夠明顯提高PCNA的蛋白表達(dá)水平，而其沉默后又明顯降低PCNA的蛋白表達(dá)水平，進(jìn)一步確定了TMEM173調(diào)控細(xì)胞增殖的功能。Bcl-2家族蛋白是在細(xì)胞凋亡過程中起關(guān)鍵性作用的一類蛋白，主要包括抗凋亡蛋白(如Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w 等)和促凋亡蛋白(如Bax、Bak、Bid 等)，它們可通過調(diào)節(jié)線粒體中細(xì)胞色素C(cyt-c)釋放來調(diào)控細(xì)胞凋亡，cyt-c的釋放是線粒體凋亡途徑激活的顯著特征，其被釋放到細(xì)胞質(zhì)中后能夠與凋亡蛋白酶激活因子1(APAF-1)結(jié)合，導(dǎo)致caspase-3激活而引起細(xì)胞凋亡，而活化的caspase-3能夠水解PAPR，后者被認(rèn)為是凋亡的標(biāo)志物。本研究發(fā)現(xiàn)TMEM173過表達(dá)后能夠明顯提高Bcl-2的蛋白表達(dá)水平，而明顯降低Bax、cleaved-caspase-3和cleaved-PARP的蛋白表達(dá)水平，且TMEM173沉默也能夠得到相反的結(jié)果，進(jìn)一步表明了TMEM173能夠有效調(diào)控細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能與改變 Bax /Bcl-2 及 cleaved caspase-3 的蛋白表達(dá)有關(guān)。接下來本研究還對cGAS-STING通路中關(guān)鍵蛋白TBK1和IRF3的表達(dá)水平進(jìn)行了檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TMEM173過表達(dá)能夠明顯上調(diào)它們的表達(dá)水平，意味著其調(diào)控HSC細(xì)胞增殖可能與cGAS-STING通路的活化有著密切關(guān)系。

綜上表明，TMEM173在活化肝星狀細(xì)胞的增殖與凋亡過程中扮演著積極的角色，很可能成為肝炎和肝纖維化基因治療的潛在靶點(diǎn)。接下來我們將分別建立肝炎和肝纖維化的細(xì)胞和動(dòng)物模型，進(jìn)一步研究TMEM173對肝星狀細(xì)胞中炎癥因子、纖維化因子分泌和表達(dá)的影響，以及對相關(guān)信號(hào)通路的調(diào)控功能，深入探索TMEM173參與肝炎和肝纖維化發(fā)生發(fā)展的具體機(jī)制。