雷 健，吳遠(yuǎn)航，趙興坤，蔣凌雁，劉攀道，羅麗娟

（1. 海南大學(xué) 熱帶作物學(xué)院/海南省熱帶生物資源可持續(xù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，?？?570228;2. 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 熱帶作物品種資源研究所，?？?571101）

柱花草（Stylosanthesspp.）起源于南美洲，其產(chǎn)量高、草質(zhì)好且具有耐貧瘠、耐酸性土壤的特點(diǎn)，是世界熱帶地區(qū)重要的豆科牧草和綠肥資源[1?2]。柱花草炭疽?。⊿tylosanthesanthracnose）是危害柱花草生產(chǎn)的嚴(yán)重病害，可導(dǎo)致牧草及種子產(chǎn)量銳減甚至絕收，以及飼草品質(zhì)大幅下降[3?4]。柱花草炭疽病主要由半知菌炭疽病菌屬的膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）引起，有A型和B型2種專化型[5]。目前，對(duì)于柱花草抗炭疽病的基礎(chǔ)研究多側(cè)重于病原菌侵染方式和致病機(jī)理。如炭疽菌致病基因CgDN3及SSD1的鑒定和致病機(jī)制研究[6?7]，膠孢炭疽菌采取活體寄生和死體腐生雙階段侵染策略的發(fā)現(xiàn)[8]，以及炭疽病的致病性和喀斯特炭疽菌的發(fā)掘等[9]。但是，對(duì)于柱花草抗炭疽菌機(jī)制尚未完全了解，仍有待深入研究。游離氨基酸（Free amino acids）約占植物體內(nèi)總氮的2%，是重要的生物活性物質(zhì)。近年來，游離氨基酸在植物生長發(fā)育及抵抗生物與非生物逆境脅迫過程中發(fā)揮的生物學(xué)功能受到廣泛關(guān)注，相關(guān)研究取得諸多進(jìn)展。例如，脯氨酸的大量積累是水稻（Oryza sativa）、小麥（Triticum aestivum）、玉米（Zea mays）等作物中普遍存在的適應(yīng)低溫環(huán)境的機(jī)制[10]；干旱脅迫下，植物體內(nèi)的脯氨酸和賴氨酸含量會(huì)上升，從而調(diào)節(jié)滲透勢(shì)以緩解脅迫對(duì)植株帶來的損傷[11]；γ?氨基丁酸（GABA）作為信號(hào)分子，通過調(diào)節(jié)應(yīng)答分子網(wǎng)絡(luò)提高植物耐鹽與耐鋁毒脅迫能力[12]；β?氨基丁酸（BABA）通過誘導(dǎo)煙草（Nicotiana tabacum）體內(nèi)水楊酸、過氧化氫及病程相關(guān)蛋白（PR蛋白）的積累，有效抵抗了煙草花葉病侵染等[13]。但是，游離氨基酸在柱花草抗炭疽病方面的研究仍未見報(bào)道。本研究將分析膠孢炭疽菌侵染柱花草后，其葉片游離氨基酸的變化，并對(duì)顯著增加積累的葉片游離氨基酸開展進(jìn)一步抑菌活性分析，鑒定參與柱花草抗炭疽病的游離氨基酸種類，旨在為解析柱花草抗炭疽病機(jī)理及綠色防治藥物的開發(fā)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料以柱花草‘熱研2號(hào)’（Stylosanthes guianensiscv. ‘Reyan No.2’）為實(shí)驗(yàn)材料（由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所牧草業(yè)研究室提供）。供試膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）菌株為本實(shí)驗(yàn)室收集保存。

1.2 材料的種植及接菌處理本實(shí)驗(yàn)在海南大學(xué)熱帶作物學(xué)院科研基地的大棚中進(jìn)行。將柱花草種子去種皮后，選取大小一致、飽滿的種子于80 ℃水浴3 min，冷卻至室溫，黑暗條件下萌發(fā)2～3 d后，將幼苗轉(zhuǎn)移到基質(zhì)為V營養(yǎng)土∶V蛭石= 1∶1的育苗盒中繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)4周后，接種炭疽菌。將炭疽菌菌絲塊置于PDA平板上，于28 ℃恒溫箱中黑暗培養(yǎng)7 d。用無菌水沖洗菌絲，兩層無菌紗布過濾洗脫炭疽菌孢子，將孢子懸浮液離心后用無菌水將孢子重懸，用血球計(jì)數(shù)板統(tǒng)計(jì)孢子密度，控制孢子密度在1×107個(gè)·mL?1，加入φ=0.02% silweet-77。實(shí)驗(yàn)設(shè)置2個(gè)處理，采用全株噴灑的方式，將孢子懸浮液均勻噴灑熱研2號(hào)柱花草至葉片上凝成水珠，對(duì)照用含φ=0.02% silweet-77的等量無菌水處理。接種膠孢炭疽菌96 h后收取樣品，每個(gè)處理包含4個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.3 礦質(zhì)元素濃度測(cè)定參照文獻(xiàn)[14]的方法分析柱花草葉片的礦質(zhì)元素濃度，并略作改動(dòng)。其中，磷（P）濃度用鉬黃比色法；鈣（Ca）濃度用EDTA絡(luò)合滴定法；鉀（K）、鎂（Mg）、鐵（Fe）和鈉（Na）濃度用原子吸收分光光度法測(cè)定。

1.4 抗氧化相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定采用分光光度比色法[15]測(cè)定柱花草葉片抗氧化酶活性和次級(jí)代謝物濃度，包括過氧化物酶（POD）、總超氧化物歧化酶（T-SOD）和苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性，總酚、類黃酮和原花青素濃度。參照文獻(xiàn)[16]采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定銅鋅?超氧化物歧化酶（CuZn-SOD）的活性。參照文獻(xiàn)[17]的方法，并略作修改，利用鐵離子還原/抗氧化能力法（FRAP法）檢測(cè)總抗氧化能力（T-AOC），其中，用考馬斯亮藍(lán)法[18]測(cè)定可溶性蛋白質(zhì)濃度。

1.5 氨基酸濃度分析采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）[19]分析柱花草葉片氨基酸濃度。

1.6 氨基酸對(duì)病原菌的抑菌活性測(cè)定對(duì)柱花草葉片中顯著積累的氨基酸，采用瓊脂平板法進(jìn)行病原菌抑菌活性測(cè)定。將氨基酸溶解后過濾除菌，分別配制含不同氨基酸的PDA培養(yǎng)基，且培養(yǎng)基中氨基酸質(zhì)量濃度均為200 mg·L?1，對(duì)照組培養(yǎng)基中加入等量溶劑。將配置好的培養(yǎng)基用移液槍加入直徑9 cm培養(yǎng)皿中，每皿5 mL培養(yǎng)基。用直徑4 mm的無菌打孔器打取大小一致的菌餅，接種于上述培養(yǎng)皿中心。每組6個(gè)重復(fù)。暗培養(yǎng)6 d后，通過十字交叉法測(cè)量各平皿中的菌落直徑，并計(jì)算該代謝物對(duì)膠孢炭疽菌生長的抑菌率。

1.7 數(shù)據(jù)處理采用Microsoft Office 2016軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤表示，用IBM SPSS Statistics 20（SPSS Institute，美國）軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)來分析差異的顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 炭疽菌侵染對(duì)柱花草葉片礦質(zhì)元素濃度及抗氧化系統(tǒng)的影響從圖1可知，與對(duì)照組相比，接種96 h后，柱花草葉片呈現(xiàn)褐色軟腐水漬狀病癥，磷、鉀、鈣、鐵和鈉濃度分別顯著提高了25.4%、35.5%、60.2%、44.9%和19.9%，而鎂離子濃度顯著降低了17.4%。隨后，測(cè)定了4種抗氧化酶系的活性變化，接種炭疽菌后，柱花草葉片的CuZn-SOD、T-SOD、POD和PAL活性分別顯著提高了21.6%、35.0%、39.6%和274.4%（圖2）。此外，總酚濃度、類黃酮濃度、原花青素濃度和總抗氧化能力在接種炭疽菌后分別顯著提高了14.5%、21.4%、290.7%和33.1%（圖2）。

圖1 接種炭疽菌96 h后柱花草葉片6種礦質(zhì)元素濃度的變化Fig. 1 Changes in concentration of six mineral elements in Stylosanthes leaves after 96 h Colletotrichum gloeosporioides infection

圖2 接種炭疽菌96 h后柱花草葉片的抗氧化相關(guān)酶及代謝物濃度變化Fig. 2 Changes in antioxidant enzyme activity and metabolite concentration in Stylosanthes leaves after 96 h of inoculation with Colletotrichum gloeosporioides

2.2 炭疽菌侵染對(duì)柱花草葉片游離氨基酸濃度的影響利用LC-MS/MS檢測(cè)柱花草葉片16種氨基酸的濃度變化（圖3），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照相比，接種炭疽菌使得柱花草葉片丙氨酸（Ala）、β?丙氨酸（bAla）和肌肽（Car）這3種氨基酸的濃度分別顯著提高了7.61倍、1.43倍和15.09倍。與之相反，精氨酸（Arg）、高瓜氨酸（Hcit）、苯丙氨酸（Phe）和色氨酸（Trp）這4種氨基酸的濃度在炭疽菌侵染后分別顯著降低了85.1%、58.7%、39.0%和56.5%。而其他9種氨基酸，即：谷氨酸（Glu）、組氨酸（His）、賴氨酸（Lys）、蛋氨酸（Met）、鳥氨酸（Orn）、脯氨酸（Pro）、絲氨酸（Ser）、蘇氨酸（Thr）和酪氨酸（Tyr）濃度在對(duì)照與接種處理間無顯著差異。

圖3 接種炭疽菌96 h后柱花草葉片的游離氨基酸濃度變化Fig. 3 Changes of free amino acid concentration in Stylosanthes leaves after 96 h of inoculation with Colletotrichum gloeosporioides

2.3 3種游離氨基酸對(duì)膠孢炭疽菌的體外抑菌能力分析鑒于柱花草葉片在接種炭疽菌侵染后，肌肽、丙氨酸和β?丙氨酸的濃度顯著提高，在PDA培養(yǎng)基中通過添加這3種游離氨基酸，分析它們對(duì)膠孢炭疽菌生長的體外抑制能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖4），添加肌肽對(duì)膠孢炭疽菌的生長無顯著影響（圖4-A）。但是，與對(duì)照相比，添加丙氨酸和β?丙氨酸分別使得菌落直徑顯著減小27.9%和12.4%（圖4-B），表明丙氨酸和β?丙氨酸對(duì)膠孢炭疽菌具有抑制作用。

圖4 PDA培養(yǎng)基中添加3種游離氨基酸對(duì)膠孢炭疽菌生長的影響Fig. 4 Effects of three free amino acids on the growth of Colletotrichum gloeosporioides in the PDA medium

3 討 論

柱花草炭疽病的病原菌為膠孢炭疽菌，危害我國柱花草生產(chǎn)的主要是B型膠孢炭疽菌[3?4]。當(dāng)遭受炭疽菌侵染時(shí)，柱花草可能通過多種生理生化反應(yīng)來提高抗病能力。本研究發(fā)現(xiàn)，接種炭疽菌后，柱花草葉片中5種礦質(zhì)元素的濃度顯著升高，其中鈣濃度提高最多，達(dá)60.2%。鈣對(duì)于生物膜的穩(wěn)定性具有重要作用，研究發(fā)現(xiàn)，氯化鈣、丙酸鈣及硅酸鈣對(duì)膠孢炭疽菌和尖孢炭疽菌的生長及侵染均有抑制效果[20]。柱花草可能通過提高鈣離子濃度來增強(qiáng)對(duì)炭疽菌侵染的抵抗能力。

植物體中存在一套清除活性氧的抗氧化系統(tǒng)，分別是酶促抗氧化系統(tǒng)和非酶促抗氧化系統(tǒng)。酶促抗氧化系統(tǒng)主要包括SOD、POD等抗氧化酶；而非酶促抗氧化系統(tǒng)主要包括脯氨酸、多酚、類黃酮、生物堿等抗氧化代謝物產(chǎn)物[21]?？寡趸到y(tǒng)已被報(bào)道在植物抵抗生物與非生物脅迫中發(fā)揮著重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，炭疽菌侵染導(dǎo)致柱花草葉片中3種酶促抗氧化系統(tǒng)相關(guān)酶POD、CuZn-SOD、T-SOD的活性顯著提高。此外，接種炭疽菌后，柱花草葉片中總酚、類黃酮和原花青素這3種非酶促抗氧化系統(tǒng)相關(guān)代謝物產(chǎn)物的濃度也顯著提高?？偡?、類黃酮和原花青素均屬于苯丙烷代謝途徑的下游代謝產(chǎn)物，而PAL是催化該途徑第一步反應(yīng)的關(guān)鍵酶和限速酶[22]。柱花草葉片的PAL活性在接種炭疽菌后顯著提高2.7倍。以上結(jié)果說明，柱花草葉片通過提高PAL酶活性促進(jìn)下游抗氧化代謝物合成與積累，協(xié)同抗氧化酶系統(tǒng)的增強(qiáng)共同提高了葉片的總抗氧化能力，以減輕炭疽菌侵染對(duì)其造成的氧化損傷。當(dāng)遭受病原菌侵染后，植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)受到破壞，同時(shí)植物體內(nèi)的新陳代謝活動(dòng)及游離氨基酸等主要營養(yǎng)物質(zhì)也會(huì)隨之改變。游離氨基酸具有生物活性，已被報(bào)道在植物抵抗病原菌侵染中發(fā)揮著重要作用[23]。如：茶餅病菌（Exobasidium vexans）侵染茶樹（Camellia sinensis）后，導(dǎo)致其葉片的γ?氨基丁酸和茶氨酸濃度顯著增加[24]；尖孢鐮孢菌（Fusarium oxysporum）侵染黃瓜（Cucumis sativus）后，使其葉片的丙氨酸、瓜氨酸濃度顯著提高[25]；蘭花膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）侵染墨蘭（Cymbidium sinense）后，致使其葉片的天門氨酸、胱氨酸和谷氨酸濃度顯著提高[26]。筆者發(fā)現(xiàn)，柱花草葉片中丙氨酸、β?丙氨酸和肌肽這3種游離氨基酸的濃度在接種炭疽菌后顯著提高，而隨后的體外抑菌實(shí)驗(yàn)表明，其中只有丙氨酸和β?丙氨酸對(duì)膠孢炭疽菌生長具有顯著抑制作用。游離氨基酸可作為碳源和氮源被病原菌直接吸收，而有致害作用的游離氨基酸被吸收后可對(duì)病原菌生長產(chǎn)生抑制作用[25,27]。生物防治是指利用有益生物或者生物代謝產(chǎn)物來防治植物病害的各種措施[28]。但目前尚未有柱花草炭疽病生物防治藥劑研究的公開報(bào)道。本研究結(jié)果表明，丙氨酸和β?丙氨酸具有用于開發(fā)生物防治藥劑的潛力，但仍需進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

綜上所述，當(dāng)遭受炭疽菌侵染時(shí)，柱花草通過抗氧化系統(tǒng)來抵抗病原菌侵染引起的氧化損傷，同時(shí)通過丙氨酸和β?丙氨酸的積累來抑制炭疽菌的生長。本研究結(jié)果將為解析柱花草抗炭疽病機(jī)理及綠色防治藥物的開發(fā)提供參考依據(jù)。