胡小勤， 蒙 丹， 吳燕春， 段慧明， 曾雪霞， 陶美霖， 蘇日香， 曾學(xué)文*

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院， 南寧 530022； 2.廣西中藥藥效研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 南寧 530022)

高血壓是致死和致殘的首要因素之一，據(jù)統(tǒng)計(jì)，2030年全球由高血壓導(dǎo)致的癡呆患者將達(dá)到 7 550 萬[1]。研究表明，心血管疾病中50%以上是由高血壓引起的,77%左右腦卒中患者有較長(zhǎng)的高血壓病史，高血壓已成為影響人民健康生活的主要疾病[2]。高血壓病是以體循環(huán)動(dòng)脈壓增高為主要臨床表現(xiàn)的綜合征，是臨床最常見的心血管疾病[3]，氣虛血瘀證又是高血壓病的常見中醫(yī)證型[4]。研究表明，高血壓病的發(fā)病機(jī)制[5]及氣虛血瘀證的形成機(jī)理[6]都與細(xì)胞凋亡的病理生理過程有密切的關(guān)系。細(xì)胞凋亡是通過激活和啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)某些特定基因,調(diào)控細(xì)胞主動(dòng)死亡過程, 維護(hù)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定[7]。而研究發(fā)現(xiàn)半胱氨酸蛋白酶(Caspases)在細(xì)胞凋亡、炎癥和纖維化中起核心作用，Caspases的激活是細(xì)胞凋亡必經(jīng)的途徑，Caspase-3是反應(yīng)的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)[8]，且人體抑癌基因53(p53)是一種調(diào)節(jié)許多基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，可誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡和衰老[9]。

臨床上廣泛應(yīng)用補(bǔ)陽(yáng)還五湯治療高血壓病氣虛血瘀證, 且研究證實(shí)了補(bǔ)陽(yáng)還五湯可以糾正高血壓病氣虛血瘀證引起的細(xì)胞凋亡[10]，并通過抑制氣虛血瘀型高血壓腦出血恢復(fù)期患者神經(jīng)凋亡,改善血液循環(huán),提高療效[11]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)：高血壓病氣虛血瘀證患者血清可以誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[12]，并在蛋白質(zhì)層次發(fā)現(xiàn)其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、p53、跨膜糖蛋白(Fas)、跨膜糖蛋白配體(FasL)、兔抗人單克隆抗體(Bax)、B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(Bcl-2)的表達(dá)量有關(guān)，并發(fā)現(xiàn)補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡有一定的保護(hù)作用[13]。故在課題的前期研究基礎(chǔ)上運(yùn)用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(palymerase chain reaction,PCR)芯片技術(shù)和miRNA芯片技術(shù)，對(duì)凋亡細(xì)胞的相關(guān)基因和miRNA表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，從mRNA和miRNA層面探討高血壓病氣虛血瘀證患者血清誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的機(jī)理。以體外培養(yǎng)的人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞作為觀察對(duì)象，進(jìn)一步探討高血壓氣虛血瘀證的患病機(jī)制，對(duì)促進(jìn)高血壓病的防治和提高人民生活健康具有深遠(yuǎn)的意義。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

60只SPF(specific pathogen free)級(jí)SD(Sprague-Dawley)大鼠，雌雄各30只，體重180～210 g，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(桂)2014—0002。

1.2 細(xì)胞

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株CRL-1730，由復(fù)旦生物醫(yī)學(xué)研究院細(xì)胞資源中心提供。

1.3 試劑

胎牛血清、青霉素、鏈霉素購(gòu)自Hyclone；高糖DMEM購(gòu)自Gibco；0.25%胰酶-0.02%EDTA購(gòu)自北京索萊寶；聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)、牛血清白蛋白(BSA)購(gòu)自BioFrox；一抗p53、Bax、Fas、Casapse-3、Fas-L、Bcl-2、微管蛋白(Tublin)均購(gòu)自Sant Cruz；二抗Cy-3羊抗鼠；正常熔點(diǎn)瓊脂糖(NMA)、低熔點(diǎn)瓊脂糖(LMA)購(gòu)自Takara；溴化乙錠(EB)購(gòu)自Sigma；三(羥甲基)胺基甲烷(Tris)購(gòu)自南京凱基；RIPA組織細(xì)胞快速裂解液購(gòu)自Boster；乙二胺四乙酸二鈉(Na2EDTA)購(gòu)自上海前尖生物科技有限公司。

1.4 儀器

低溫臺(tái)式離心機(jī)、CO2培養(yǎng)箱為美國(guó)Thermo公司生產(chǎn)；水平電泳槽、電泳儀為美國(guó)BIO-RAD公司生產(chǎn)；微量移液器為德國(guó)Eppendorf公司生產(chǎn)；實(shí)時(shí)定量PCR儀為美國(guó)Bio-Rad公司生產(chǎn)。

2 資料與方法

2.1 健康體檢者及患者的選擇

選擇健康對(duì)照組20例，為廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院健康體檢者。高血壓病氣虛血瘀證患者及高血壓病非氣虛血瘀證患者各40例，為2016年7月—2017年1月在廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院心血管內(nèi)科就診的高血壓病患者。高血壓病診斷標(biāo)準(zhǔn)采用1999年世界衛(wèi)生組織/國(guó)際高血壓學(xué)會(huì)制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)，氣虛血瘀證辨證標(biāo)準(zhǔn)采用1986年全國(guó)中西醫(yī)結(jié)合虛證及老年病防治學(xué)術(shù)會(huì)議制訂的《中醫(yī)虛證辨證參考標(biāo)準(zhǔn)》及2011年中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)活血化瘀專業(yè)委員會(huì)制定的《血瘀證中西醫(yī)結(jié)合診療共識(shí)》。高血壓病氣虛血瘀證血壓水平與高血壓病非氣虛血瘀證患者的血壓水平比較，兩者無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P>0.05，具有可比性；高血壓病氣虛血瘀證、高血壓病非氣虛血瘀證及健康對(duì)照組三組性別和年齡比較，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P>0.05，具有可比性。

2.2 健康人及患者血清收集

空腹?fàn)顟B(tài)下，每人約取8 mL外周血，放入帶帽無菌不抗凝試管，自凝后4 ℃、3 000 r/m、15 min離心，取上清液置于無菌EP(eppendorf)管，混合均勻，滅活，過濾除菌，置于-80 ℃環(huán)境，備用。每組血清混合后用于細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)。

2.3 含藥血清及空白對(duì)照血清制備

按補(bǔ)陽(yáng)還五湯原方劑量進(jìn)行水煎提取(生黃芪120 g、當(dāng)歸尾6 g、赤芍5 g、地龍3 g、川芎3 g、紅花3 g、桃仁3 g)。按照體表面積換算用藥量，高、中、低劑量組大鼠分別用等效劑量的2、1、1/2倍，即24、12、6 g/(kg·d)灌胃(ig)。將SD大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組和補(bǔ)陽(yáng)還五湯高、中、低劑量組，空白對(duì)照組共30只，補(bǔ)陽(yáng)還五湯高、中、低劑量組各10只。各劑量組每天以補(bǔ)陽(yáng)還五湯 ig 2次，兩次間隔12 h，連續(xù)ig 3 d。于末次ig 1 h后頸動(dòng)脈放血，自凝后 4 ℃、3 000 r/m、15 min離心，取上清液，將同組血清混合，放入無菌EP管，混勻，滅活，過濾除菌，-80 ℃ 凍存?zhèn)溆?。在同樣條件下，以等體積的生理鹽水ig，制備空白對(duì)照組血清。

2.4 分組

分6組按以下方法制備混合血清培養(yǎng)液：高血壓病氣虛血瘀證組、高血壓病非氣虛血瘀證組、健康對(duì)照組分別以10%高血壓病氣虛血瘀證患者血清、10%高血壓病非氣虛血瘀證患者血清、10%健康者血清混合10%空白血清及80%的高糖DMEM培養(yǎng)基，補(bǔ)陽(yáng)還五湯高、中、低劑量組分別以10%補(bǔ)陽(yáng)還五湯高中、低劑量含藥血清混1血高血壓病氣虛血瘀證患者血清及80%高糖DMEM培養(yǎng)基。

2.5 細(xì)胞培養(yǎng)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)皮細(xì)胞，消化、傳代后， 按1×105/mL密度, 接種于25 mL培養(yǎng)瓶, 4 mL/瓶，每組6瓶，共36瓶，每2瓶為一個(gè)樣品。用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，換無血清培養(yǎng)液同步化以后，分為6組，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

2.6 實(shí)時(shí)定量PCR芯片技術(shù)檢測(cè)與人細(xì)胞凋亡相關(guān)的89個(gè)關(guān)鍵基因的表達(dá)

核糖核酸(RNA)抽提，脫氧核糖核酸酶I (DNase I) 消化RNA樣品，RNA純化，RNA質(zhì)量檢測(cè)，反轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)脫氧核糖核酸(cDNA)鏈，作為PCR模板；將模板加入到熒光定量PCR(RT2 Real-Time TM SYBR Green PCR Master Mix)反應(yīng)體系中。取96孔板，在各孔中固定好基因特異性引物，然后加入等量的PCR反應(yīng)體系，進(jìn)行PCR反應(yīng)。采用配套軟件計(jì)算PCR芯片中的每個(gè)基因的循環(huán)閾值(Ct)。采用△△Ct方法比較對(duì)應(yīng)的兩個(gè)樣本中同一基因的表達(dá)量變化。通過分析看家基因Ct值的一致性，確定合適的標(biāo)準(zhǔn)化方法。

2.7 miRNA芯片技術(shù)檢測(cè)與人細(xì)胞凋亡相關(guān)的384個(gè)miRNAs表達(dá)

方法同2.6。

2.8 miRNA靶基因預(yù)測(cè)

應(yīng)用數(shù)據(jù)庫(kù)Targetscan，查詢miRNA的靶基因，網(wǎng)址: http://www.targetscan.org/vert_71/。

2.9 篩選目的差異靶基因

對(duì)miRNA靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果及差異表達(dá)的基因作交集分析，即為目的差異的靶基因。

3 結(jié)果

3.1 實(shí)時(shí)定量PCR芯片技術(shù)檢測(cè)結(jié)果

實(shí)時(shí)定量PCR芯片技術(shù)檢測(cè)結(jié)果如圖1所示。

高血壓病氣虛血瘀證組與高血壓病非氣虛血瘀證組比較，共檢測(cè)到2個(gè)差異基因，均表達(dá)上調(diào)。上調(diào)基因包括CIDEA和FASLG。但是無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，如表1所示。

表1 高血壓病氣虛血瘀證組與高血壓病非氣虛血瘀證組 mRNA差異表達(dá)(n=3)

高血壓病氣虛血瘀證組與健康對(duì)照組比較，共檢測(cè)到27個(gè)差異表達(dá)基因，其中，有25個(gè)上調(diào)基因和2個(gè)下調(diào)基因，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的上調(diào)基因22個(gè)，下調(diào)基因1個(gè)(P<0.05)，上調(diào)基因包括BCL10、BCL2A1、BCL2L1、BIK、BNIP2、BRAF、CASP10、CASP3、CASP4、CASP5、CFLAR、GADD45A、HRK、MCL1、RIPK2、TNFRSF10B、TNFRSF11B、TNFRSF9、TNFSF8、TP53、TP53BP2、XIAP，下調(diào)基因?yàn)門NFSF10，如表2所示。

表2 高血壓病氣虛血瘀證組與健康對(duì)照組mRNA 差異表達(dá)(n=3)

每組3個(gè)樣本，A～F依次為高血壓病氣虛血瘀證組、高血壓 病非氣虛血瘀證組、健康組、補(bǔ)陽(yáng)還五湯高劑量組、補(bǔ)陽(yáng)還 五湯中劑量組、補(bǔ)陽(yáng)還五湯低劑量組圖1 DNA變性瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 DNA denaturation agarose gel electrophoresis

高血壓病非氣虛血瘀證組與健康對(duì)照組比較，共檢測(cè)到24個(gè)差異表達(dá)基因，其中，有21個(gè)上調(diào)基因和3個(gè)下調(diào)基因，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的上調(diào)基因19個(gè)和下調(diào)基因1個(gè) (P<0.05)。上調(diào)基因包括BCL10、BCL2A1、BCL2L1、BIK、BNIP2、CASP3、CASP4、CASP5、CFLAR、GADD45A、HRK、MCL1、RIPK2、TNFRSF10B、TNFRSF9、TNFSF8、TP53、TP53BP2、XIAP，下調(diào)基因?yàn)門NFSF10，如表3所示。

表3 高血壓病非氣虛血瘀證組與健康對(duì)照組mRNA 差異表達(dá)(n=3)

補(bǔ)陽(yáng)還五湯高劑量組與高血壓病氣虛血瘀證組比較，共檢測(cè)到9個(gè)差異表達(dá)基因，其中，有6個(gè)上調(diào)基因和3個(gè)下調(diào)基因，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的上調(diào)基因5個(gè)和下調(diào)基因1個(gè) (P<0.05)，上調(diào)基因包括BCL2、DAPK1、GADD45A、NFKB1、TRADD，下調(diào)基因?yàn)镃ASP10，如表4所示。

表4 補(bǔ)陽(yáng)還五湯高劑量組與高血壓病氣虛血瘀證組 mRNA 差異表達(dá)(n=3)Table 4 Differential mRNA expression between the high-dose group of Buyanghuanwu Decoction and the hypertension group with qi deficiency and blood stasis syndrome (n=3)

補(bǔ)陽(yáng)還五湯中劑量組與高血壓病氣虛血瘀證組比較，共檢測(cè)到13個(gè)差異表達(dá)基因，其中，有8個(gè)上調(diào)基因和5個(gè)下調(diào)基因，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的上調(diào)基因7個(gè)，下調(diào)基因3個(gè) (P<0.05)，上調(diào)基因包括BCL2、BCL2A1、BIRC3、DAPK1、GADD45A、NFKB1、TRADD，下調(diào)基因包括CASP10、CASP5、TNFRSF9，如表5所示。

表5 補(bǔ)陽(yáng)還五湯中劑量組與高血壓病氣虛血瘀證組 mRNA 差異表達(dá)(n=3)

補(bǔ)陽(yáng)還五湯低劑量組與高血壓病氣虛血瘀證組比較，共檢測(cè)到11個(gè)差異表達(dá)基因，其中，有5個(gè)上調(diào)基因和6個(gè)下調(diào)基因，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的上調(diào)基因5個(gè)，下調(diào)基因3個(gè) (P<0.05)，上調(diào)基因包括BCL2、DAPK1、GADD45A、NFKB1、TRADD，下調(diào)基因?yàn)镃ASP1、CASP10、TNFRSF9，如表6所示。

表6 補(bǔ)陽(yáng)還五湯低劑量組與高血壓病氣虛血瘀證組 mRNA差異表達(dá)(n=3)

3.2 miRNA芯片技術(shù)檢測(cè)結(jié)果

miRNA芯片技術(shù)檢測(cè)結(jié)果如圖2所示。高血壓病氣虛血瘀證組與高血壓病非氣虛血瘀證組比較，共檢測(cè)到38個(gè)差異表達(dá)基因，其中，有14個(gè)上調(diào)基因和24個(gè)基因下調(diào)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的上調(diào)基因1個(gè)和下調(diào)基因3個(gè) (P<0.05)，上調(diào)基因包括hsa-miR-299-5p，下調(diào)基因分別為hsa-miR-516a-5p、hsa-miR-382-5p、hsa-miR-153-3p。結(jié)果如表7所示。

每組3個(gè)樣本，A～F依次為高血壓病氣虛血瘀證組、高血壓病 非氣虛血瘀證組、健康組、補(bǔ)陽(yáng)還五湯高劑量組、補(bǔ)陽(yáng)還五 湯中劑量組、補(bǔ)陽(yáng)還五湯低劑量組圖2 DNA變性瓊脂糖凝膠電泳圖(1∶1)Fig.2 DNA denaturation agarose gel electrophoresis (1∶1)

表7 高血壓病氣虛血瘀證組與高血壓病非氣虛血瘀證組 miRNA差異表達(dá)(n=3)

高血壓病氣虛血瘀證組與健康對(duì)照組比較，共檢測(cè)到29個(gè)差異表達(dá)基因，其中，有17個(gè)上調(diào)基因和12個(gè)下調(diào)基因，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的上調(diào)基因8個(gè)和下調(diào)基因2個(gè) (P<0.05)，上調(diào)基因包括hsa-miR-181a-3p、hsa-miR-99a-3p、hsa-miR-30b-3p、hsa-miR-22-5p、hsa-miR-449a、hsa-miR-21-3p、hsa-miR-26a-2-3p、hsa-miR-212-3p，下調(diào)基因?yàn)閔sa-miR-127-3p、hsa-miR-874-3p。結(jié)果如表8所示。

表8 高血壓病氣虛血瘀證組與健康對(duì)照組miRNA 差異表達(dá)(n=3)

高血壓病非氣虛血瘀證組與健康對(duì)照組比較，共檢測(cè)到45個(gè)差異表達(dá)基因，其中，有31個(gè)上調(diào)基因和14個(gè)下調(diào)基因，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的上調(diào)基因12個(gè)和下調(diào)基因2個(gè) (P<0.05)，上調(diào)基因包括hsa-miR-374b-3p、hsa-miR-181a-3p、hsa-miR-376b-3p、hsa-miR-99a-3p、hsa-miR-30b-3p、hsa-miR-22-5p、hsa-miR-449a、hsa-miR-375、hsa-miR-21-3p、hsa-miR-26a-2-3p、hsa-miR-140-3p、hsa-miR-212-3p，下調(diào)基因?yàn)閔sa-miR-190a-5p、hsa-miR-874-3p。結(jié)果如表9所示。

表9 高血壓病非氣虛血瘀證組與健康對(duì)照組miRNA 差異表達(dá)(n=3)

補(bǔ)陽(yáng)還五湯高劑量組與高血壓病氣虛血瘀證組比較，共檢測(cè)到64個(gè)差異表達(dá)基因，其中，有60個(gè)上調(diào)基因和4個(gè)下調(diào)基因，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的上調(diào)基因6個(gè)(P<0.05)，下調(diào)基因無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。上調(diào)基因包括hsa-miR-499a-5p、hsa-miR-570-3p、hsa-miR-887-3p、hsa-miR-548c-3p、hsa-miR-134-5p、hsa-miR-135a-5p。結(jié)果如表10所示。

表10 補(bǔ)陽(yáng)還五湯高劑量組與高血壓病氣虛血瘀證組 miRNA差異表達(dá)(n=3)

補(bǔ)陽(yáng)還五湯中劑量組與高血壓病氣虛血瘀證組比較，共檢測(cè)到21個(gè)差異表達(dá)基因，其中，有5個(gè)上調(diào)基因和16個(gè)下調(diào)基因，上調(diào)基因無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的下調(diào)基因3個(gè) (P<0.05)，分別為hsa-miR-129-5p、hsa-miR-190a-5p、hsa-miR-411-5p。結(jié)果如表11所示。

表11 補(bǔ)陽(yáng)還五湯中劑量組與高血壓病氣虛血瘀證組 miRNA差異表達(dá)(n=3)

補(bǔ)陽(yáng)還五湯低劑量組與高血壓病氣虛血瘀證組比較，共檢測(cè)到41個(gè)差異表達(dá)基因，其中，有33個(gè)上調(diào)基因和8個(gè)下調(diào)基因，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的上調(diào)基因3個(gè)和下調(diào)基因1個(gè) (P<0.05)，上調(diào)基因包括hsa-miR-187-3p、hsa-miR-708-5p、hsa-miR-139-5p，下調(diào)基因?yàn)閔sa-miR-410-3p。結(jié)果如表12所示。

表12 補(bǔ)陽(yáng)還五湯低劑量組與高血壓病氣虛血瘀證組 miRNA差異表達(dá)(n=3)

3.3 miRNA靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果及差異靶基因確定

3.3.1 高血壓病氣虛血瘀證組與健康組比較

有22個(gè)顯著上調(diào)的mRNA，1個(gè)顯著下調(diào)的mRNA；8個(gè)顯著上調(diào)的miRNA，2個(gè)顯著下調(diào)的miRNA。對(duì)8個(gè)上調(diào)miRNA做靶基因預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)這8個(gè)上調(diào)的miRNA可以靶向3 041個(gè)mRNA；下調(diào)的mRNA(1個(gè))與上調(diào)的miRNA(8個(gè))的靶基因(3 041個(gè))取交集，得到1個(gè)既有顯著變化的 mRNA，也是上調(diào)miRNA的靶基因，即TNFSF10。

3.3.2 高血壓病非氣虛血瘀證組與健康組比較

有19個(gè)顯著上調(diào)的mRNA，1個(gè)顯著下調(diào)的mRNA；13個(gè)顯著上調(diào)的miRNA，2個(gè)顯著下調(diào)的miRNA；對(duì)13個(gè)miRNA做靶基因預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)這13個(gè)上調(diào)的miRNA可以靶向3 680個(gè)mRNA；下調(diào)的mRNA(1個(gè))與上調(diào)的miRNA(13個(gè))的靶基因(3 680個(gè))取交集，得到1個(gè)既有顯著變化的mRNA，也是上調(diào)miRNA的靶基因，也是TNFSF10。

3.3.3 其余各組之間比較

差異mRNA和miRNA靶基因沒有交集。

4 討論

細(xì)胞凋亡(apoptosis)是由基因控制的細(xì)胞主動(dòng)死亡過程[14]。實(shí)時(shí)定量PCR芯片(RT-qPCR array)借助基因芯片的高通量檢測(cè)技術(shù)與功能和qPCR 的精確定量，能同時(shí)對(duì)上百個(gè)基因的mRNA表達(dá)進(jìn)行定量分析，是一種可靠的、高度靈敏的分析方法[15]。micro RNAs(miRNAs)是一種21～25 nt的單鏈小分子RNA，是非編碼RNA的重要組成部分，miRNAs具有高度的保守性、時(shí)序性和組織特異性[16]。近年來，越來越多的研究表明，miRNA能夠靶向調(diào)控凋亡因子的激活劑或抑制劑，進(jìn)而影響凋亡因子的表達(dá)，也可以直接靶向凋亡調(diào)控因子，影響細(xì)胞凋亡的進(jìn)程[17-19]。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：高血壓氣虛血瘀證組與健康組相比，在89個(gè)mRNA中，有22個(gè)上調(diào)基因和1個(gè)下調(diào)基因，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，在384個(gè)mi RNA中有8個(gè)上調(diào)miRNA和2個(gè)下調(diào)miRNA，顯示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；高血壓非氣虛血瘀證組在89個(gè)相關(guān)基因中有19個(gè)上調(diào)基因和1個(gè)下調(diào)基因，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，在384個(gè)miRNA中有12個(gè)上調(diào)miRNA和2個(gè)下調(diào)miRNA，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。另外，補(bǔ)陽(yáng)還五湯高劑量組在89個(gè)相關(guān)基因中有5個(gè)上調(diào)基因和1個(gè)下調(diào)基因，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，在384個(gè)miRNA中只有6個(gè)上調(diào)miRNA，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；補(bǔ)陽(yáng)還五湯中劑量組在89個(gè)相關(guān)基因中有7個(gè)上調(diào)基因和3個(gè)下調(diào)基因，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；在384個(gè)miRNA中只有3個(gè)下調(diào)miRNA，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；與高血壓病氣虛血瘀證組相比，補(bǔ)陽(yáng)還五湯低劑量組在89個(gè)相關(guān)基因中有5個(gè)上調(diào)基因和3個(gè)下調(diào)基因，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，在384個(gè)miRNA中有3個(gè)上調(diào)miRNA和1個(gè)下調(diào)miRNA，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明：高血壓病氣虛血瘀證患者血清誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的機(jī)制，與相關(guān)基因和mi RNA的上調(diào)和下調(diào)有關(guān)，補(bǔ)陽(yáng)還五湯各劑量組能糾正高血壓病氣虛血瘀證的相關(guān)基因和miRNA表達(dá)的失衡，具有抑制高血壓病氣虛血瘀證細(xì)胞凋亡的作用。將miRNA靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果與差異mRNA做交集分析，發(fā)現(xiàn)與高血壓病氣虛血瘀證和高血壓病非氣虛血瘀證的形成密切相關(guān)的核心因子都是TNFSF10 基因。腫瘤壞死因子 (tumor necrosis factor,TNF) 是Carswell 等于1975 年發(fā)現(xiàn)的一種能使腫瘤細(xì)胞凋亡、壞死的細(xì)胞因子[20]。TNFSF10(TRAIL)是在其序列同源性的基礎(chǔ)上，由Wiley等[21]于 1995年首次發(fā)現(xiàn)，是腫瘤壞死因子配體家族的成員之一，TNFSF10對(duì)體外的細(xì)胞系包括一些腫瘤細(xì)胞系具有誘導(dǎo)凋亡的作用。與其他 TNF 家族成員相比，TNFSF10具有兩個(gè)特性：①TNFSF10在大多數(shù)組織中都能表達(dá)，而其他TNF 家族成員只在活化的細(xì)胞中暫時(shí)表達(dá)[22]；②TNFSF10是一個(gè)促凋亡配體，目前發(fā)現(xiàn)在一些炎癥細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中能夠高表達(dá)。但是，關(guān)于TNFSF10促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的研究，尚未見報(bào)道。下一步，擬進(jìn)行擴(kuò)大樣本的實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)和蛋白質(zhì)印跡法(western blot)驗(yàn)證，每組取20個(gè)樣本，對(duì)TNFSF10基因和蛋白質(zhì)表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。TNFSF10得到驗(yàn)證后，可以作為高血壓病的一種分子標(biāo)志物，在臨床診斷方面尤其是高血壓病的預(yù)警方面發(fā)揮作用，此外，也可以作為降壓藥物的療效評(píng)價(jià)的指標(biāo)。