田孟祥 何友勛 趙 龍 張時(shí)龍 余本勛 葉永印

（畢節(jié)市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所 貴州畢節(jié)551700）

水稻在我國(guó)農(nóng)作物中具有重要的地位， 是最主要的糧食作物之一， 我國(guó)60%以上的人口以稻米為主食。 稻米中蛋白質(zhì)占 8%～10%，根據(jù)其溶解特性，可分為4 種， 即清蛋白、 球蛋白、 醇溶蛋白和谷蛋白[1]，以谷蛋白含量最高，約占總蛋白的80%，也是人體最易于消化吸收的蛋白成分，因此，可通過(guò)提高谷蛋白含量來(lái)增加稻米的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。 然而，對(duì)于患有腎臟疾病的病人來(lái)說(shuō)， 攝入大量的可吸收性蛋白會(huì)增加腎臟負(fù)擔(dān)，導(dǎo)致人體蛋白代謝紊亂，進(jìn)而造成病情惡化。 近年來(lái)，隨著腎臟病患者人數(shù)不斷增多，低谷蛋白含量水稻品種越來(lái)越受到人們的關(guān)注， 培育綜合性狀優(yōu)良的低谷蛋白新品種已成為當(dāng)前功能性水稻育種的一個(gè)重要方向。

日本學(xué)者通過(guò)誘變獲得一個(gè)低谷蛋白突變體，該控制基因命名為L(zhǎng)gc1，將該突變體進(jìn)行雜交，培育出世界第一個(gè)低谷蛋白水稻品種LGC1。 萬(wàn)建民等[2]引入LGC1 品種作為育種親本，培育出了我國(guó)第一個(gè)低谷蛋白水稻品種W3660。 此后， 在我國(guó)水稻育種界，以含低谷蛋白基因Lgc1材料為親本，選育出了一些低谷蛋白水稻新品種[3-7]。

本研究以從江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所引進(jìn)的含低谷蛋白基因Lgc1的材料L06 為親本，與課題組選育的12095B 進(jìn)行雜交組配，后代在田間選擇中，結(jié)合筆者[8]早年參與開(kāi)發(fā)的Lgc1基因功能標(biāo)記鑒定，選育出了低谷蛋白新品系，命名為T(mén)L0695。 該新品系綜合性狀優(yōu)良、豐產(chǎn)性好，具有重要的應(yīng)用價(jià)值，筆者將對(duì)其選育情況進(jìn)行簡(jiǎn)述。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

母本：2014 年從江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所引進(jìn)的含低谷蛋白基因Lgc1的材料L06。

父本：筆者課題組選育的保持系12095B。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 水稻DNA 的提取 水稻分蘗盛期， 單株掛牌， 取葉片， 將所取的葉片存于冰箱-20℃下備用。DNA 提取參照田孟祥等[9-11]的方法進(jìn)行。

1.2.2 分子標(biāo)記檢測(cè) 分子標(biāo)記及檢測(cè)方法參照筆者[8]參與開(kāi)發(fā)的Lgc1基因功能標(biāo)記所述的方法進(jìn)行。Lgc1基因功能標(biāo)記由2 對(duì)引物構(gòu)成， 即InDel-Lgc1-1和 InDel-Lgc1-2。 InDel-Lgc1-1： 正向引物序列5′-TTCTACAATGAAGGCGATGC-3′， 反向引物序列5′-CTGGGCTTTAACGGGACT-3′。 InDel-Lgc1-2：正向引物序列5′-ACCGTGTTATGGCAGTTT-3′，反向引物序列 5′-ATTCAAGGGCTATCGTCT-3′。 根據(jù)標(biāo)記特性， 含純合低谷蛋白Lgc1基因擴(kuò)增881 bp 的帶型，不含低谷蛋白基因擴(kuò)增509 bp 的帶型，而雜合體則擴(kuò)增出以上2 種帶型。

1.2.3 稻米谷蛋白含量測(cè)定 采用考馬斯亮藍(lán)G-250 法進(jìn)行稻米谷蛋白含量測(cè)定， 具體參照王艷平等[1]的方法進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 低谷蛋白新品系的選育過(guò)程

2014 年畢節(jié)正季以低谷蛋白種質(zhì)L06 為母本，以12095B 為父本進(jìn)行雜交，獲F1，同年冬繁種于海南，移栽 20 株，成熟后種子混收，為 F2；2015 年畢節(jié)正季種植F2，移栽種植600 株，單株種植，掛牌，取葉片進(jìn)行分子標(biāo)記檢測(cè)，熟后選農(nóng)藝性狀優(yōu)良單株，收單穗，結(jié)合分子標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果，留含目標(biāo)基因植株的種子，15 個(gè)單穗，將種子互混保存，為F3，同年冬繁種于海南，移栽種植500 株，單株種植，掛牌，單株取葉片進(jìn)行分子標(biāo)記檢測(cè)，熟后選農(nóng)藝性狀優(yōu)良單株，收單穗，結(jié)合分子標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果，留含目標(biāo)基因植株的種子，20 個(gè)單穗，互混保存，為 F4；2016 年畢節(jié)正季種植F4，移栽400 株，單株種植，掛牌，單株取葉片進(jìn)行分子標(biāo)記檢測(cè)， 熟后選農(nóng)藝性狀優(yōu)良單株， 收單穗，結(jié)合分子標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果，留含目標(biāo)基因植株的種子，10 個(gè)單穗，單穗保存，為F5，同年冬繁種于海南，10 個(gè)單穗種植成10 個(gè)小區(qū)，每小區(qū)100 株，田間選擇與分子標(biāo)記輔助選擇相結(jié)合，收單穗12 個(gè)，為F6；2017 年畢節(jié)正季種植F6，12 個(gè)單穗種成12 個(gè)小區(qū)，每小區(qū)100 株， 田間選擇與分子標(biāo)記輔助選擇相結(jié)合，收單穗8 個(gè)，為F7，同年冬繁種于海南，8 個(gè)單穗種植成8 個(gè)小區(qū)，每小區(qū)100 株，田間選擇與分子標(biāo)記輔助選擇相結(jié)合，收獲單穗10 個(gè)，為F8；2018 年正季種植 F8，10 個(gè)單穗種植成 10 個(gè)小區(qū)， 收獲 8 個(gè)單穗，經(jīng)分子標(biāo)記鑒定確認(rèn)含目標(biāo)基因，為F9，遺傳穩(wěn)定，同年海南南繁進(jìn)行擴(kuò)繁；2019 年正季參加品比試驗(yàn)，篩選出表現(xiàn)突出品系4 個(gè)；2020 年將上年4 個(gè)表現(xiàn)好的品種再參加品比試驗(yàn)， 最終選留綜合表現(xiàn)最突出的低谷蛋白新品系1 個(gè)，暫定名為T(mén)L0695。

2.2 低谷蛋白基因分子標(biāo)記鑒定

在低谷蛋白新品系選育過(guò)程中， 從基因分離的F2世代開(kāi)始，應(yīng)用Lgc1基因功能標(biāo)記對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行跟蹤。 低谷蛋白基因功能標(biāo)記對(duì)F2群體植株的檢測(cè)情況見(jiàn)附圖，后面世代的檢測(cè)大致與其相似，不再累贅。 由附圖可知，L06/12095B 的 F2群體植株，在編號(hào)為 3～19 的單株中，編號(hào)為 10、11、13、14 僅有一條大小為881 bp 的帶型，與親本L06 的帶型一致，是含低谷蛋白Lgc1純合基因的植株；編號(hào)為 3、5、12、15、17 僅有一條大小為509 bp 的帶型， 與親本12095B的帶型一致，是谷蛋白正常的植株；而編號(hào)為4、6、7、8、9、16、18、19 同時(shí)出現(xiàn) 881 bp 和 509 bp 的帶型，為以上兩類型植株的雜合體。

附圖 低谷蛋白Lgc1 基因功能標(biāo)記對(duì)L06/12095B 的F2 群體植株的檢測(cè)

2.3 低谷蛋白含量測(cè)定

通過(guò)田間選擇和分子標(biāo)記輔助選擇相結(jié)合，選育成了低谷蛋白新品系TL0659， 為了解其低谷蛋白的具體含量， 采用考馬斯亮藍(lán) G-250 法測(cè)定其中堿溶性蛋白（谷蛋白）含量。 測(cè)定結(jié)果顯示，所育成的低谷蛋白新品系TL0659 的谷蛋白含量為3.11%， 略低于母本 L06 的含量（3.28%），遠(yuǎn)低于父本 12095B 的含量（6.71%）。

2.4 低谷蛋白新品系農(nóng)藝性狀調(diào)查

對(duì)低谷蛋白新品系TL0659 的農(nóng)藝性狀進(jìn)行調(diào)查。 在貴州省畢節(jié)市， 全生育期為 165.2 d， 株高108.2 cm， 株葉型好， 莖稈較堅(jiān)韌， 葉色濃綠， 劍葉直立， 葉鞘、 葉緣綠色； 分蘗力中等， 畝有效穗17.5 萬(wàn)穗；半直立穗，穗型較大，穗粒數(shù)為168.2 粒，結(jié)實(shí)率92.2%，千粒重26.5 g。 粒型闊卵形，穎尖無(wú)色、 無(wú)芒、 后期轉(zhuǎn)色好。 2019 年品比試驗(yàn)折合畝產(chǎn)526.3 kg，2020 年品比試驗(yàn)折合畝產(chǎn) 542.7 kg， 豐產(chǎn)性好，應(yīng)用前景廣闊。

3 討論

日本選育出了第一個(gè)低谷蛋白水稻品種LGC-1，其可溶性蛋白含量低于4%，將該稻米用于腎臟病患者的臨床試驗(yàn)。結(jié)果表明，以LGC-1 為主食的患者蛋白質(zhì)攝入量和血清肌酸酐含量明顯降低 （與食用低蛋白代用品效果相同），患者病情得到明顯改善。 因此，可溶性蛋白低于4%的稻米被認(rèn)為是對(duì)腎病患者（尤其以大米為主食者） 非常有效的食療輔助品，培育低谷蛋白功能性水稻品種不僅給腎臟病人帶來(lái)了福音，也給予了育種者良好的契機(jī)。 萬(wàn)建民等[2]選育出了中國(guó)第一個(gè)低谷蛋白品種W3660，此后，在中國(guó)水稻育種界掀起了低谷蛋白育種潮， 篩選低谷蛋白種質(zhì)資源或利用已有的低谷蛋白種質(zhì)進(jìn)行育種研究。2008 年在江蘇，筆者就跟隨團(tuán)隊(duì)進(jìn)行低谷蛋白種質(zhì)篩選和育種實(shí)踐， 開(kāi)發(fā)出了針對(duì)低谷蛋白基因Lgc1的 2 種功能標(biāo)記[8,12]。 2010 年回到貴州工作，又開(kāi)展了低谷蛋白育種研究， 以含低谷蛋白基因Lgc1的W3660 為親本，與貴州多個(gè)粳稻品種雜交，但后代普遍表現(xiàn)太差， 選育低谷蛋白品種失敗， 或許與W3660 在貴州表現(xiàn)太差相關(guān)。

分子標(biāo)記輔助選擇已經(jīng)成為水稻育種的一個(gè)重要輔助手段，基于基因DNA 序列的功能標(biāo)記，更是能準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、高效地對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行鑒定，具有不受環(huán)境條件影響、提高選擇效率的明顯優(yōu)勢(shì)。 項(xiàng)目組以江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所引進(jìn)低谷蛋白材料L06 為母本，以自育的粳稻保持系12095B 為父本，進(jìn)行雜交組配，采用田間選擇和分子標(biāo)記輔助選擇相結(jié)合，高效地選育出了綜合性狀好、豐產(chǎn)性好的低谷蛋白粳稻新品系， 為貴州低谷蛋白水稻生產(chǎn)和種質(zhì)創(chuàng)新提供了優(yōu)良種質(zhì)材料。