陳萍萍 游月華 江 巍 戴展峰 彭玉林 黃水明

（龍巖市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所 福建龍巖364000）

稻瘟病具有多種生理小種， 是水稻生產(chǎn)的主要病害，病情嚴(yán)重時(shí)，會影響水稻的產(chǎn)量和品質(zhì)，給糧食生產(chǎn)造成重大的損失，高發(fā)區(qū)可以造成50%以上減產(chǎn)[1]。 但稻瘟病生理小種變異快，一個(gè)單基因的抗病品種育成后，往往種植2～3 年后就容易喪失抗性[2-3]。品種抗病性之所以喪失， 關(guān)鍵在于品種或抗源過于單一化， 通過將幾個(gè)抗稻瘟病基因聚合于同一個(gè)水稻材料中， 可以有效地避免或減緩水稻抗稻瘟病抗性能力喪失。 劉士平等[4]發(fā)展了與Pi-1連鎖的SSR標(biāo)記RM144, 并利用分子標(biāo)記輔助選擇將Pi-1基因?qū)胝渖?7B。吳金紅等[5]開發(fā)了與Pi-2緊密連鎖的SSR 標(biāo)記AP22。 陳紅旗等[6]利用分子標(biāo)記技術(shù)聚合Pi-1、Pi-2和Pi-33基因改良金23B 的稻瘟病抗性，獲得了高抗稻瘟病的保持系， 其對稻瘟病的抗病頻率為96.7%。 孫富等[7]利用分子標(biāo)記輔助聚合稻瘟病抗性基因Pi-1和Pi-2改良紅色特種秈稻桂紅一號的稻瘟病抗性，獲得了具有高抗稻瘟病的改良材料。

本研究利用稻瘟病抗病基因Pi-1、Pi-2和Pi-b的緊密連鎖的標(biāo)記對育種分離世代水稻材料進(jìn)行分子輔助育種選擇，并結(jié)合田間農(nóng)藝性狀、稻瘟病抗性鑒定，快速、準(zhǔn)確選育出聚合Pi-1、Pi-2和Pi-b3 個(gè)抗稻瘟病基因的黑色糯稻新品系。 選育聚合多個(gè)抗稻瘟病基因的水稻品種，是避免或減緩品種抗性喪失的有效途徑，通過分子輔助選擇結(jié)合田間育種技術(shù)，選育新的抗稻瘟病品種，為水稻抗病遺傳育種提供新的供體親本資源。

1 材料與方法

1.1 水稻材料

中組14 是中國水稻研究所選育的抗白葉枯病、稻瘟病、褐飛虱和白背飛虱，且米質(zhì)達(dá)到國標(biāo)1 級的常規(guī)秈稻品種， 攜帶稻瘟病抗性基因Pi-1、Pi-2和Pi-b，具有持久高抗稻瘟病特性，種子由浙江省農(nóng)科院作核所提供。 巖紫糯是由龍巖市農(nóng)科所選育的種皮顏色黑、營養(yǎng)品質(zhì)高、產(chǎn)量較高的紫黑糯品種，稻瘟病抗性差。 龍巖市農(nóng)科所選育的由中組14 與巖紫糯雜交、回交選育的優(yōu)質(zhì)有色稻中間材料。

1.2 抗性基因連鎖標(biāo)記

由表1 可知，與緊密連鎖稻瘟病抗性基因Pi-1、Pi-2和Pi-b緊密連鎖的標(biāo)記分別是RM144、AP22和Pibdom[4-5,8]。

表1 水稻稻瘟病抗性基因的連鎖標(biāo)記及引物序列

1.3 雜交、回交與選擇方案

以巖紫糯為母本，中組14 為父本，雜交獲得F1，然后以巖紫糯為母本與F1回交獲得BC1F1。為加快改良進(jìn)程，在此后的自交選育過程中，通過單株的表現(xiàn)和分子標(biāo)記檢測結(jié)果， 在各自交世代中選擇同時(shí)攜帶Pi-1、Pi-2和Pi-b3 個(gè)抗性基因且農(nóng)藝性狀優(yōu)良的單株，最后獲得抗稻瘟病的株系（圖1）。

圖1 分子輔助選擇聚合3 個(gè)水稻稻瘟病抗性基因的育種程序

1.4 稻瘟病抗性鑒定

2018 年晚季田間稻瘟病自然誘發(fā)鑒定圃設(shè)在福建省上杭縣茶地國家稻瘟病鑒定中心圃進(jìn)行。 所用的菌株為福建省高感的菌株。 每個(gè)品種播種1 條，3 個(gè)重復(fù)，每條播種100 粒，四周設(shè)誘發(fā)行，以廣陸矮4 號、明恢86 和本地糯稻龍黑糯2 號為誘發(fā)品種。不噴施農(nóng)藥，施氮肥，施用量高于普通大田20%。 出苗后30 d 人工噴施菌液使其充分發(fā)病。 按國際水稻所0～9 級的分級標(biāo)準(zhǔn)調(diào)查苗瘟、 葉瘟和穗頸瘟發(fā)病情況，調(diào)查方法參照鄭軼等[9]的方法。

1.5 農(nóng)藝性狀及植株色素沉積和分布規(guī)律

1.5.1 農(nóng)藝性狀 考察農(nóng)藝性狀。

1.5.2 植株色素沉積和分布規(guī)律 用數(shù)碼單反相機(jī)觀察拍攝水稻不同生長階段、 不同組織部位的色素沉積和分布規(guī)律， 記錄不同發(fā)育天數(shù)的穎果的形態(tài)和色澤變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 分子標(biāo)記篩選

利用與Pi-1、Pi-2和Pi-b緊密連鎖的 SSR 標(biāo)記RM144、AP22 和 Pibdom 對中組 14 與巖紫糯進(jìn)行多態(tài)性分析， 中組14 與巖紫糯之間具有明顯的多態(tài)性。 結(jié)果見圖 2。 另外，對分子標(biāo)記 RM144、AP22 和Pibdom 用于對水稻植株抗病選擇的可靠性進(jìn)行了分析， 選用單個(gè)特異鑒別菌株對F2群體接種，RM144、AP22 和 Pibdom 對基因Pi-1、Pi-2和Pi-b基因篩選準(zhǔn)確率達(dá) 90%。 說明利用 M144、AP22 和 Pibdom 分別對Pi-1、Pi-2和Pi-b基因進(jìn)行分子輔助選擇改良水稻品種抗病性是完全可行的。

圖2 部分水稻植株抗性基因連鎖標(biāo)記在BC1F3 群體中的分離

2.2 利用分子標(biāo)記選擇抗稻瘟病株系

利用與抗性基因緊密連鎖的標(biāo)記對不同自交世代進(jìn)行選擇，結(jié)果見表2。 在BC1F1中，雜合帶型（帶型 2）與感病帶型（帶型 1）的分離比例符合 1∶1。 在BC1F1的自交群體中，根據(jù)分子標(biāo)記檢測結(jié)果、農(nóng)藝性狀表現(xiàn)和種皮顏色分別選擇3 株種皮為黑色的單株進(jìn)行繁殖獲得BC1F2株系種子。 繼續(xù)種植3 個(gè)BC1F2群體，對這些世代進(jìn)行分子標(biāo)記檢測，各個(gè)分離世代均出現(xiàn)3 種帶型， 即與供體親本相同的純合抗病帶型、 抗感雜合帶型和與受體親本相同的純合感病帶型， 分離比例符合 1∶2∶1。 通過對農(nóng)藝性狀觀察， 篩選獲得5 個(gè)純合抗病帶型種皮為黑色的水稻株系。

表2 BC1F1 和BC1F2 群體的分子標(biāo)記檢測分析結(jié)果

2.3 聚合后代的抗性表現(xiàn)和農(nóng)藝性狀系統(tǒng)選育

2018 年晚季， 將獲得的5 個(gè)穩(wěn)定株系分別種植BC1F4群體，編號16-1～16-5。用福建稻瘟病高致病菌種對不同株系進(jìn)行稻瘟病的苗瘟、 葉瘟和穗頸瘟的接種鑒定。 結(jié)果表明，5 個(gè)株系對高致病菌株均具有抗病能力，其苗瘟和葉瘟均為0 級，株系16-2 穗頸瘟 0 級，株系 16-1、16-3、16-4、16-5 穗頸瘟 1 級，綜合抗性評價(jià)為高抗稻瘟?。ū?）。

表3 16-1~16-5 株系的抗性鑒定

同時(shí)調(diào)查5 個(gè)株系的農(nóng)藝性狀，其中株系16-1 和株系16-2 農(nóng)藝性狀表現(xiàn)穩(wěn)定一致，豐產(chǎn)性最好（表4）。2019 年將這2 個(gè)株系進(jìn)行小區(qū)品比試驗(yàn)， 其中株系16-2 綜合性狀表現(xiàn)優(yōu)異，暫時(shí)定名為龍黑198。

表4 株系16-1~16-5 農(nóng)藝性狀比較

2.4 龍黑198 的農(nóng)藝性狀與色素沉積與分布特征

2.4.1 龍黑198 的農(nóng)藝性狀 優(yōu)質(zhì)多抗稻瘟病新品系龍黑198 綜合性狀好，全生育期136 d，屬于黑色秈糯類型。株型適中，株高138～142 cm，抗倒性強(qiáng)；分蘗性好， 單株成穗 9～12 個(gè)， 屬于散穗型， 每穗粒數(shù) 175～200 粒， 結(jié)實(shí)率 85.7%， 千粒重 25 g， 高抗稻瘟病。

2.4.2 龍黑198 的色素沉積與分布規(guī)律 為了揭示龍黑198 黑色色素的積累特征，本研究觀察龍黑198在不同生長階段、不同組織部位的色素沉積與分布。在整個(gè)生長周期內(nèi)， 龍黑198 的莖稈和葉片均為綠色；稻穗發(fā)育早期穎殼有紫色色素沉積，顏色由淺變深， 抽穗后穎殼顏色逐漸由紫色轉(zhuǎn)為綠色進(jìn)行光合作用（圖 3A、B）；柱頭為白色，無色素沉積（圖 3C）。隨著穎果灌漿，穎果發(fā)育早期（花后1～7 d），穎殼呈綠色，隨著穎果灌漿成熟，穎殼色素的積累，顏色由綠變紅， 進(jìn)而由紅變紫變黑； 成熟時(shí)穎殼顏色為黑色（圖3D、F）。 通過仔細(xì)觀察穎果果皮的色素沉積后，發(fā)現(xiàn)花色素在穎果果皮中的沉積具有時(shí)序性， 在花后5～7 d 有色稻穎果果皮尖端就開始出現(xiàn)色素沉積，然后延伸到穎果兩端及背部維管束處的果皮沉積色素，后向整個(gè)穎果的果皮擴(kuò)展，最后才是穎果中部和腹部沉積色素（圖3E），一般在花后10～15 d 內(nèi)整個(gè)穎果的果皮充滿色素，隨著色素的沉積，顏色由紅變紫變黑，逐漸加深。

圖3 龍黑198 色素沉積與分布規(guī)律

3 討論與結(jié)論

Pi-b是第一個(gè)被圖位克隆的抗稻瘟病基因。Pi-1與Pi-2是2 個(gè)顯性廣譜稻瘟病抗性基因， 具有有良好的互補(bǔ)效應(yīng)[6,10-11]。 通過接種75 個(gè)來自不同地域的稻瘟病菌株， 結(jié)果表明，Pi-1和Pi-2的抗譜分別高達(dá) 82.67%和 85.53%[12]。Pi-1對南、北方稻區(qū) 322 個(gè)單孢菌株表現(xiàn)為中等毒力，毒力頻率為22.36%，Pi-2表現(xiàn)為弱毒力，毒力頻率為6.83%[13]。 攜帶Pi-2的水稻品系IRBLz5-CA 對來自廣東的146 個(gè)稻瘟病菌株的抗性頻率為48.6%，攜帶Pi-1的水稻品系IRBL1-CL抗性頻率為80.1%，二者對不同生理小種的抗性具有很好的互補(bǔ)效應(yīng)[14]。

本研究將Pi-1、Pi-2和Pi-b基因聚合到感病的紫黑色糯稻巖紫糯中，人工接種鑒定結(jié)果表明，聚合了3 個(gè)抗稻瘟基因的水稻株系能夠抗福建省內(nèi)高致病菌株的侵染，自然病圃苗瘟和葉瘟均為0 級，穗頸瘟0～1 級，綜合評價(jià)達(dá)高抗稻瘟病水平。 研究表明，多個(gè)抗稻瘟病基因聚合后， 其抗性抗譜并不是單個(gè)抗稻瘟病基因之間的簡單累加， 而是通過基因間的互作效應(yīng)，增強(qiáng)單個(gè)抗稻瘟病基因抗性能力，在聚合2～3 個(gè)抗稻瘟病基因后，水稻品種的抗性抗譜能夠增強(qiáng)拓寬。 多個(gè)抗性基因聚合是培育具有持久抗性水稻品種的有效方法，柳武革等[10]聚合Pi-1和Pi-2基因改良GD-7S 兩系不育系的稻瘟病抗性， 獲得5 個(gè)帶Pi-1和Pi-2基因的純合株系，其稻瘟病抗性較原始GD-7S 有大幅度提高。王軍等[15]聚合Pi-ta和Pi-b抗稻瘟病基因，選育出多抗高產(chǎn)的優(yōu)質(zhì)水稻新品系。本研究通過將Pi-1、Pi-2和Pi-b3 個(gè)抗稻瘟病基因聚合到優(yōu)質(zhì)、感稻瘟病的紫黑糯，獲得5 個(gè)高抗稻瘟病的株系，結(jié)合農(nóng)藝性狀篩選出抗稻瘟病、優(yōu)質(zhì)的黑色糯稻新品系龍黑198。