徐廉松，黃富豪，張語涵，牛雯雯，龐金龍，李姍姍，李 嫻，2，3

1蚌埠醫(yī)學(xué)院，安徽 蚌埠 233030；2中藥飲片制造新技術(shù)安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 亳州 236800；3安徽協(xié)和成藥業(yè)飲片有限公司博士后工作站，安徽 亳州236800

中藥川芎是傘形科植物川芎Ligusticum chuanxiong hort的干燥根莖［1］，具有活血行氣、祛風(fēng)止痛的功效，是中醫(yī)臨床治療腦病常用的中藥之一［2］。現(xiàn)代藥理研究表明，川芎具有保護(hù)心腦血管［3］、抗腫瘤［4］、抗炎［5］、抗氧化［6］、保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)［7］等作用。有研究者分析了中醫(yī)治療腦部腫瘤的用藥規(guī)律，結(jié)果發(fā)現(xiàn)川芎具有很高的使用頻率［8］。然而目前缺乏從細(xì)胞及分子水平系統(tǒng)地闡述川芎治療肺癌腦轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制及物質(zhì)基礎(chǔ)。

本研究以肺癌腦轉(zhuǎn)移為切入點(diǎn)，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法構(gòu)建“活性成分-靶標(biāo)-通路-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖，探討川芎治療肺癌腦轉(zhuǎn)移的潛在靶點(diǎn)、活性組分、信號通路及生物學(xué)過程，并結(jié)合分子對接技術(shù)，進(jìn)一步驗(yàn)證篩選出的活性成分與其靶點(diǎn)蛋白的親和性，以期為川芎治療腦部腫瘤的作用機(jī)制研究提供參考和借鑒。

1 材料和方法

1.1 篩選川芎的活性成分

利用TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索川芎的化學(xué)成分。根據(jù)藥代動力學(xué)原理，以藥物口服生物利用度（OB）≥30%、藥物相似性（DL）≥0.05和血腦屏障≥-0.3為條件，篩選川芎的活性成分。

1.2 預(yù)測川芎活性成分的靶點(diǎn)

基于TCMSP數(shù)據(jù)庫平臺所預(yù)測的成分靶點(diǎn)，并提取相應(yīng)成分的靶點(diǎn)，命名為“target.txt”，借助Uniprot數(shù)據(jù)庫（http://www.uniprot.org/）官方命名，將靶點(diǎn)的全稱轉(zhuǎn)換為簡稱，并刪除無對應(yīng)基因名的靶點(diǎn)，得到基因注釋文件“targetSymbol.txt”。

1.3 篩選肺癌腦轉(zhuǎn)移的疾病靶點(diǎn)

利用GeneCards（http://www.genecards.org/）數(shù)據(jù)庫，以“l(fā)ung cancer brain metastasis”為關(guān)鍵詞檢索，以相關(guān)性打分（Relevance score）≥10為篩選條件，得到疾病相關(guān)的基因文件“Disease.txt”。

1.4 獲得藥物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)的交集基因

將1.2項(xiàng)得出的藥物靶點(diǎn)和1.3項(xiàng)得到的疾病靶點(diǎn)構(gòu)建交集后，獲得川芎與肺癌腦轉(zhuǎn)移疾病的交集靶點(diǎn)文件“Drug-Disease”，即川芎治療肺癌腦轉(zhuǎn)移的潛在作用靶點(diǎn)。

1.5 構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-疾病”的網(wǎng)絡(luò)

將1.4 項(xiàng)得出的藥物與疾病的交集基因輸入Cytoscape3.7.1軟件中，構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-疾病”可視化網(wǎng)絡(luò)圖，利用cytoNCA插件對網(wǎng)絡(luò)圖節(jié)點(diǎn)進(jìn)行分析，同時(shí)輸出type文件，標(biāo)注每個(gè)節(jié)點(diǎn)的屬性是藥物、疾病或者有效成分、靶基因等，其中標(biāo)注為分子屬性的有效成分將輸出為mollistLists文件，即為川芎治療肺癌腦轉(zhuǎn)移的有效成分。

1.6 構(gòu)建與分析蛋白互作作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)

將1.4項(xiàng)得到的藥物-疾病交集靶基因文件“Drug-Disease”數(shù)據(jù)導(dǎo)入STRING（http://string-db.org/），設(shè)定物（organism）條件為人（homo sapiens），選combine score ≥0.4的數(shù)據(jù)，完整構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)模型。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)中基因與鄰接基因的數(shù)目，找出網(wǎng)絡(luò)中的核心基因。

1.7 GO富集分析和KEGG通路富集分析

將1.1項(xiàng)獲得的川芎活性成分和1.6項(xiàng)獲得的核心靶點(diǎn)，利用RX64.4.0.3 軟件計(jì)算及相關(guān)腳本運(yùn)行后，得出GO 富集分析和KEGG 通路富集分析，篩選條件為P<0.05。同樣以P<0.05得到的KEGG通路被認(rèn)為是最重要的信號通路。

1.8 分子對接

從PubChem 數(shù)據(jù)庫（http://pubchem.nc-bi.nih.gov/）下載川芎中潛在活性成分的小分子配體2D結(jié)構(gòu)，通過ChemOffice 軟件將2D結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化為3D結(jié)構(gòu)，利用pymol去除蛋白結(jié)構(gòu)的水分子及小分子配體，并導(dǎo)入AutoDockTools 進(jìn)行加氫等預(yù)處理。將受體和配體進(jìn)行分子對接，分析其結(jié)和活性。

1.9 細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

1.9.1 藥品及試劑 川芎飲片（安徽協(xié)和成藥業(yè)飲片有限公司），經(jīng)蚌埠醫(yī)學(xué)院李紅梅副教授鑒定為傘形科藁本屬植物川芎Ligusticum ChuanXiong Hort的干燥根莖。川芎水提物：稱取川芎飲片60 g，加300 g的水，浸泡30 min后，冷凝回流提取2次，第1次35 min，第2次30 min。合并兩次提取液，過濾。冷凍干燥將藥液濃縮到含生藥0.2 g/mL，4 ℃冰箱內(nèi)存放備用。RPMI 1640培養(yǎng)基、PBS（武漢賽維爾科技有限公司）；胎牛血清（浙江天杭生物有限公司）；胰酶細(xì)胞消化液、青霉素-鏈霉素（北京Labgic有限公司）。

1.9.2 細(xì)胞培養(yǎng)及處理 人肺腺癌細(xì)胞PC9（廣州賽庫生物有限公司）。PC9 細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清和青霉素-鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5%CO2飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中。

1.9.3 Western blot檢測 將處于對數(shù)生長期的PC9細(xì)胞接種于10 cm培養(yǎng)皿，川芎處理（0、100、1000 μmol/L）24 h后，將細(xì)胞刮下，轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)，2500 r/min條件下離心10 min，收集蛋白樣品后進(jìn)行蛋白定量。將配平的蛋白樣品在95 ℃條件下水浴5 min后進(jìn)行電泳（80 V，30 min；120 V，2 h）、轉(zhuǎn)膜（200 mA，2 h）。使用脫脂牛奶封閉2 h后，孵育一抗，4 ℃過夜，次日在室溫下孵育二抗2 h。ECL顯影液浸泡后使用凝膠成像系統(tǒng)獲取蛋白條帶并用ImageJ軟件（NIH,Bethesda,MD,USA）進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 篩選川芎活性成分及預(yù)測靶點(diǎn)

通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫，以O(shè)B≥30%，DL≥0.05，BBB≥-0.3 為篩選條件，得到川芎的48 個(gè)活性成分（表1）。同時(shí)預(yù)測得到川芎成分靶點(diǎn)1357個(gè)，經(jīng)過Perl軟件標(biāo)準(zhǔn)化注釋并刪除重復(fù)靶點(diǎn)后得到399個(gè)作用靶點(diǎn)。

表1 川芎主要活性成分信息Tab.1 Main active ingredients of Ligusticum Chuanxiong Rhizoma

2.2 預(yù)測肺癌腦轉(zhuǎn)移疾病靶點(diǎn)

通過GeneCards（http://www.genecards.org/）數(shù)據(jù)庫，以“l(fā)ung cancer brain metastasis”進(jìn)行檢索，以相關(guān)性打分（Relevance score）≥10為篩選條件，得到肺癌腦轉(zhuǎn)移疾病靶點(diǎn)2432個(gè)。

2.3 藥物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)交集基因

將川芎活性成分的399個(gè)作用靶點(diǎn)與肺癌腦轉(zhuǎn)移對應(yīng)的2432個(gè)靶點(diǎn)，刪除重復(fù)后取二者的交集靶點(diǎn)，共獲得出49個(gè)交集基因（圖1）。

圖1 藥物活性成分-疾病靶點(diǎn)交集Fig.1 Intersection of active components and disease targets.

2.4 “成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)

利用Cytoscape 3.7.1 繪制川芎治療肺癌腦轉(zhuǎn)移的“成分-靶點(diǎn)-疾病”的可視化網(wǎng)絡(luò)圖（圖2）。該網(wǎng)絡(luò)圖共包含94個(gè)節(jié)點(diǎn)，其中活性成分節(jié)點(diǎn)43個(gè)，靶基因節(jié)點(diǎn)49個(gè)。通過CytoNCA分析川芎中最主要的前10種活性成分為：油酸（度=25），楊梅酮（度=19），丁苯酞（度=12），2-戊?；郊姿峒柞ィǘ?10），3-正丁烯基苯酞（度=10），4-羥基-3丁基苯酞（度=9），β-細(xì)辛腦（度=9），（Z）-藁本內(nèi)酯（度=9），（-）-壬烯(度=8），洋川芎內(nèi)酯-E（度=7）（表2）。分析節(jié)點(diǎn)度值較高的前20個(gè)靶基因（表3），其中，度值分值大于10，間距中心度和緊密中心度均較大，且在網(wǎng)絡(luò)中與前9種活性成分存在關(guān)聯(lián)的靶點(diǎn)有：前列腺素G/H 合酶2（PTGS2），前列腺素G/H合酶1（PTGS1），膽堿能受體M3型（CHRM3），溶質(zhì)載體家族6成員2（SLC6A2），維甲酸X受體α（RXRA），腎上腺素能受體β2（ADRB2），核受體輔活化子2（NCOA2），溶質(zhì)載體家族6成員4（SLC6A4），鈉電壓門控通道α亞單位5（SCN5A），提示這些基因可能是川芎治療肺癌腦轉(zhuǎn)移的核心靶點(diǎn)。

表2 川芎度值前10位的活性成分Tab.2 Top 10 active components of Ligusticum Chuanxiong Rhizoma

表3 川芎治療肺癌腦轉(zhuǎn)移的核心靶點(diǎn)Tab.3 Core targets of Chuanxiong Rhizoma in the treatment of brain metastasis of lung cancer

圖2 “成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)Fig.2 "Component-target-disease"network.Yellow nodes represent the active ingredients of drugs,green square node lattices represent the disease-drug common target gene,pink represents traditional Chinese medicine,purple represents the disease,and black lines represent the interaction between the two nodes.

2.5 PPI 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)和核心基因預(yù)測

利用STRING 數(shù)據(jù)庫構(gòu)建PPI 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖（圖3），網(wǎng)絡(luò)中共94節(jié)點(diǎn)，289條邊，圖中節(jié)點(diǎn)代表基因，兩個(gè)節(jié)點(diǎn)之間的連線代表兩個(gè)基因之間具有蛋白互作關(guān)系，不同的顏色代表不同的證據(jù)。藍(lán)色，來自策劃數(shù)據(jù)庫；紫色，實(shí)驗(yàn)測定；深綠，基因鄰接；紅色；基因融合；深藍(lán)，基因共現(xiàn)；淺綠，文本挖掘；黑色，共表達(dá)；深藍(lán)，蛋白質(zhì)同源性。運(yùn)用CytoCNA插件篩選出PPI網(wǎng)絡(luò)中川芎治療肺癌腦轉(zhuǎn)移的核心基因按度值排序依次為INS（度值=34），BDNF（度值=27），F(xiàn)OS（度值=27），VEGFA（度值=26），PTGS2（度值=24），ESR1（度值=23），MAPK14（度值=17）等（圖4）。

圖3 PPI 網(wǎng)絡(luò)模型Fig.3 PPI network model.

圖4 PPI 網(wǎng)絡(luò)CytoCNA插件分析核心基因Fig.4 Analysis of core genes by PPI network CytoCNA plug-in.A:First screening of core targets in the PPI network map.B:Second screening of the core targets in the PPI network map.C:Final identification of the core targets in the PPI network map.

2.6 GO富集分析和KEGG通路富集分析

經(jīng)過GO富集分析共得到57條富集結(jié)果（圖5），其中生物過程0個(gè)；細(xì)胞組分2個(gè)，主要涉及陰陽離子同向轉(zhuǎn)運(yùn)體、信號轉(zhuǎn)錄受體激活性；分子功能55個(gè)，主要涉及核受體活性、配體激活、轉(zhuǎn)錄因子活性、類固醇激素受體活性、RNA聚合酶II DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子等。

圖5 交集靶點(diǎn)GO分析Fig.5 GO analysis of intersection targets.

經(jīng)過KEGG 富集分析共得到40 條通路富集結(jié)果（圖6），顯示前20條通路，主要涉及催乳素信號通路、乳腺癌、雌激素信號通路、MAPK信號通路、前列腺癌、內(nèi)分泌抗性、調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞分解、VEGF信號通路、鈣信號通路、HIF1信號通路等。提示川芎可能通過以上通路發(fā)揮對肺癌腦轉(zhuǎn)移的治療作用。

圖6 交集靶點(diǎn)KEGG 通路富集分析Fig.6 Enrichment analysis of KEGG pathway.

2.7 分子對接

選取活性化合物中degree≥7的10個(gè)核心成分，分別與位于前7位的核心基因INS，BDNF，F(xiàn)OS，VEGFA，PTGS2，ESR1，MAPK14進(jìn)行分子對接，結(jié)果顯示分子與靶標(biāo)蛋白的最低結(jié)合能均小于0（表4），說明配體與受體可以自發(fā)結(jié)合。當(dāng)結(jié)合能≤-5.0 kJ·mol-1，說明分子與靶點(diǎn)對接較好，如BDNF與10個(gè)核心成分的結(jié)合能均≤-5.0 kJ·mol-1，其中丁苯酞、（Z）-藁本內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯-E結(jié)合能分別為-7.7、-8.1、-8.3 kJ·mol-1；FOS與9個(gè)核心成分的結(jié)合能≤-5.0 kJ·mol-1，其中楊梅酮、4-羥基-3-丁基苯酞的結(jié)合能分別為-8.8、-7.8 kJ·mol-1；PTGS2與10個(gè)核心成分結(jié)合能均≤-5.0 kJ·mol-1，其中楊梅酮、丁苯酞、4-羥基-3-丁基苯酞、（Z）-藁本內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯-E的結(jié)合能分別為-8.4、-8.4、-8.0、-7.9、-8.1 kJ·mol-1；MAPK14與9個(gè)核心成分結(jié)合能均≤-5.0 kJ·mol-1，其中楊梅酮、（Z）-藁本內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯-E 的結(jié)合能分別為-7.8、-8.7、-8.5 kJ·mol-1，均展現(xiàn)出良好的結(jié)合能力。以（Z）-藁本內(nèi)酯為例進(jìn)行展示（圖7）。

圖7 （Z）-藁本內(nèi)酯與靶點(diǎn)對接結(jié)果Fig.7 (z)-docking results of ligustilide with target.A:(z)-Ligustilide and PTGS2;B:(z)-Ligustilide and MAPK14;C:(z)-Ligustilide and ESR1;D:(z)-Ligustilide and BDNF;E:(z)-Ligustilide and VEGFA;F:(z)-Ligustilide and FOS;G:(z)-Ligustilide and INS.

表4 川芎中核心化合物的分子對接Tab.4 Molecular docking of the core compounds in Rhizoma Chuanxiong Rhizoma(kJ·mol-1)

2.8 體外肺癌細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

Western blot 顯示，川芎處理能顯著降低PI3K 和AKT的磷酸化及VEGF水平（P<0.01，圖8）。

圖8 川芎對人肺癌PC9細(xì)胞中PI3K/AKT、VEGF蛋白表達(dá)的影響Fig.8 Effect of Chuanxiong on PI3K/AKT and VEGF protein expression in PC9 cells.A:Western blot analysis of the expression of PI3K/AKT and VEGF in PC9 cells after treatment with Chuanxiong (0,100,1000 μmol/L) for 24 h;B:Quantification of the protein expression.*P<0.01,**P<0.001 vs the solvent control group.

3 討論

本研究篩選出油酸、楊梅酮、丁苯酞、（Z）-藁本內(nèi)酯等活性成分48個(gè)，潛在藥物靶點(diǎn)2432個(gè)，共涉及40條通路。網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)川芎可能作用于INS，BDNF、FOS、VEGFA、PTGS2、ERS1、MAPK14等關(guān)鍵靶點(diǎn)，涉及催乳素信號通路、雌激素信號通路、MAPK信號通路等關(guān)鍵通路。分子對接結(jié)果表明，楊梅酮、丁苯酞、（Z）-藁本內(nèi)酯與BDNF、FOS、PTGS2、MAPK14等靶點(diǎn)結(jié)合良好。體外細(xì)胞驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，川芎處理肺癌細(xì)胞PC9 后可降低PI3K 及AKT 蛋白磷酸化水平，下調(diào)VEGF蛋白表達(dá)水平。

楊梅酮具有顯著的抗腫瘤活性，通過使A549細(xì)胞阻滯在G0/G1 期而影響其細(xì)胞周期的調(diào)控，并誘導(dǎo)A549 細(xì)胞凋亡［9］。研究表明楊梅樹皮具有治療肺腺癌的應(yīng)用潛力，其中楊梅酮可能是關(guān)鍵有效物質(zhì)之一［10］?；谇叭说难芯浚孪霔蠲吠谥委煼伟┠X轉(zhuǎn)移中起到關(guān)鍵作用。本研究結(jié)果顯示，楊梅酮在“疾病-成分-疾病”網(wǎng)絡(luò)中度值為19，在核心成分度值表中排名第二，并且楊梅酮與PPI網(wǎng)絡(luò)中的7個(gè)核心成分分別對接，結(jié)果顯示楊梅酮與INS，BDNF，F(xiàn)OS，PTGS2，ESR1，MAPK14對接的最小自由能均小于-7 kJ·mol-1，證明了楊梅酮與疾病關(guān)鍵基因有較強(qiáng)親和力，在治療肺癌腦轉(zhuǎn)移中起到關(guān)鍵作用。

丁苯酞具有改善腦部血液微循環(huán)、減輕由腦部血流再灌注造成的損傷、抑制腦部神經(jīng)元細(xì)胞凋亡、促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞恢復(fù)、改善腦能量代謝的作用，在治療腦血管疾病方面具有顯著的療效［11］。這與肺癌細(xì)胞進(jìn)入腦循環(huán)后，停留在血流緩慢的毛細(xì)血管床，和內(nèi)皮細(xì)胞相互作用并以黏附分子作為媒介穿過內(nèi)皮細(xì)胞，進(jìn)一步與局部細(xì)胞外基質(zhì)、腦實(shí)質(zhì)細(xì)胞相互作用，同時(shí)腦組織通過血管內(nèi)皮因子、血管擴(kuò)張和血管生成模擬機(jī)制幫助轉(zhuǎn)移瘤轉(zhuǎn)移增殖［12］相符合。本研究進(jìn)一步通過“藥物-成分-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖篩選出丁苯酞度值為12，在核心成分度值表中排名第三，并且丁苯酞與7個(gè)核心基因INS,BDNF，F(xiàn)OS，VEGFA，PTGS2，ESR1，MAPK14 進(jìn)行分子對接后的最小自由能均小-5 kJ·mol-1。這與前人實(shí)驗(yàn)討論的丁苯酞的治療肺癌的結(jié)果相匹配。

（Z）-藁本內(nèi)酯可抑制人肺癌A549細(xì)胞活力，抑制A549細(xì)胞培養(yǎng)上清液中VEGF的表達(dá)，通過調(diào)控NKKB蛋白表達(dá)及應(yīng)激活化蛋白激酶（JNK）蛋白磷酸化水平、降低Bcl-2/Bax比值而誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抗腫瘤作用［13］。有研究報(bào)道，在使用高分子右旋糖酐構(gòu)建的急性兔球結(jié)膜微循環(huán)障礙模型中，發(fā)現(xiàn)藁本內(nèi)酯對改善微循環(huán)有積極作用［14］。本研究顯示，在川芎治療肺癌腦轉(zhuǎn)移的核心成分表中（Z）-藁本內(nèi)酯的度值為9，排名第8，并且在分子對接結(jié)果中（Z）-藁本內(nèi)酯與6個(gè)核心基因INS，BDNF，F(xiàn)OS，PTGS2，ESR1，MAPK14最低自由能均小于-5 kJ·mol-1。這證明（Z）-藁本內(nèi)酯在治療肺癌腦轉(zhuǎn)移中有重要作用。

腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）屬于神經(jīng)營養(yǎng)因子家族成員，廣泛分布在海馬、紋狀體、皮層和杏仁核等部位［15］。BDNF的過度表達(dá)可賦予癌細(xì)胞生存、侵襲和轉(zhuǎn)移的特性，包括細(xì)胞遷移、細(xì)胞骨架變形、轉(zhuǎn)移瘤形成、異位附著和瘤內(nèi)血管生成等［16］。研究顯示BDNF在肺癌組織中有顯著表達(dá)，BDNF 的表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移有相關(guān)性［17］。BDNF可能促進(jìn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，配體BDNF 通過與TrkB 結(jié)合來激活細(xì)胞內(nèi)的PI3K-AKT 信號通路，PI3K-AKT 信號通路依靠調(diào)控Bcl-2 家庭成員的表達(dá)及線粒體凋亡途徑參與到失巢凋亡調(diào)節(jié)中，從而賦予細(xì)胞失巢凋亡抑制能力，這一作用給予非小細(xì)胞肺癌的癌細(xì)胞抑制失巢凋亡的能力［17］。此外，由BDNF激活的PI3K-AKT信號通路會減少釋放細(xì)胞色素C，相應(yīng)地作為凋亡終末效應(yīng)器的Caspase-3和Caspase-7 的活性也會降低［18］。由本文網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接結(jié)果可知，川芎中10種核心成分與BDNF的分子對接結(jié)果最小自由能均小于-5 kJ·mol-1，其中洋川芎內(nèi)酯-（E）與BDNF 的分子對接結(jié)果最小自由能為-8.3 kJ·mol-1。這表明川芎作用于BDNF 靶點(diǎn)蛋白，可能通過配體激活，細(xì)胞凋亡，細(xì)胞程序性死亡的調(diào)控等生物途徑，提高患者自身免疫力發(fā)揮治療肺癌腦轉(zhuǎn)移的作用。

C-fos在哺乳動物的上皮細(xì)胞中異常表達(dá)可以引起上皮細(xì)胞極性喪失、上皮細(xì)胞和類成纖維細(xì)胞相互轉(zhuǎn)化、以及細(xì)胞向膠原中侵入，C-fos缺陷小鼠化學(xué)誘導(dǎo)的乳頭狀瘤向侵襲性生長的演進(jìn)過程被破壞，這些現(xiàn)象表明C-fos可以調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的侵襲性生長［19］。本研究顯示，川芎中有9中核心成分與FOS基因的分子對接結(jié)果最小自由能為均小于-5 kJ·mol-1，其中FOS基因與楊梅酮分子對接的最小自由能最小為-8.8 kJ·mol-1。川芎作用于FOS靶點(diǎn)蛋白，可能通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子活性，細(xì)胞程序性死亡等生物途徑，調(diào)節(jié)肺癌細(xì)胞的侵襲作用。

環(huán)氧化酶-2（COX2）在肺癌［20］、大腸癌［21,22］、肝癌［23］等多種癌癥中過度表達(dá)。由COX2催化生成PGE2在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著很重要的角色，且COX2可以導(dǎo)致DNA氧化，誘發(fā)突變［24］。本研究顯示，川芎中有9中核心成分與PTGS2基因的分子對接結(jié)果最小自由能為均小于-5 kJ·mol-1，其中PTGE2基因與楊梅酮和丁苯酞分子對接的最小自由能最小為-8.4 kJ·mol-1。這表明川芎作用于PTGS2靶點(diǎn)。

多數(shù)腫瘤中，MAPK14 與其他信號通路JNK、ERK、AMPK和PI3K共同參與調(diào)控細(xì)胞存活或細(xì)胞死亡［25-27］，不同情況下，MAPK14對腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用不盡相同，既可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞存活又可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡，同時(shí)MAPK14對自噬的調(diào)控也是雙重作用：一方面，MAPK14長期失活激活A(yù)MPK信號通路進(jìn)而激活自噬［28,29］；另一方面，MAPK14可以在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控自噬相關(guān)基因［30,31］。本研究顯示，MAPK14與川芎10種核心成分的分子對接最小自由能均小于-5 kJ·mol-1，其中MAPK14與楊梅酮結(jié)合的最小自由能為-7.8 kJ·mol-1。這表明川芎作用于MAPK14靶點(diǎn)蛋白可能通過細(xì)胞凋亡，細(xì)胞自噬等生物過程，治療肺癌腦轉(zhuǎn)移。

本研究結(jié)果表明，VEGF和PI3K/AKT通路與肺癌腦轉(zhuǎn)移作用密切相關(guān)。有研究顯示，VEGF是目前發(fā)現(xiàn)作用最強(qiáng)的促血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖與生成因子之一,可較好的誘導(dǎo)血管新生,無論是在體外培養(yǎng)的肺癌細(xì)胞中，還是在腫瘤細(xì)胞接種無胸腺裸鼠形成荷瘤裸鼠動物模型的腫瘤細(xì)胞中，或是在人體肺癌組織中均有VEGF的高表達(dá)［32］。PI3K/AKT通路是目前NSCLC最常見的調(diào)控途徑之一［33］。研究發(fā)現(xiàn)其參與調(diào)控了NSCLC增殖、遷移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化［34-37］，因此阻斷PI3K/AKT信號通路有可能抑制NSCLC的生存途徑并誘導(dǎo)其凋亡。本研究最后采用肺癌細(xì)胞PC9對其PI3K/AKT和VEGF通路進(jìn)行體外驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果驗(yàn)證了川芎對肺癌細(xì)胞PC9的PI3K/AKT和VEGF通路有抑制作用。

綜上所述，川芎通過多成分、多靶點(diǎn)、多通路相互協(xié)調(diào)、相互影響以治療肺癌腦轉(zhuǎn)移，充分體現(xiàn)了中藥在治療疾病的整體性和全面性特點(diǎn)，為后續(xù)深入討論川芎治療肺癌腦轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)，也為中藥治療疾病的多維度、多層次研究提供新思路。鑒于網(wǎng)絡(luò)藥理和分子對接技術(shù)受限于數(shù)據(jù)庫的不全面，不能覆蓋所有中藥、靶點(diǎn)、通路，還需設(shè)計(jì)嚴(yán)格的動物實(shí)驗(yàn)及臨床實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步討論其作用機(jī)制。