陳納淳，吳漢森，鄧仲豪，廖哲霆，馮舒皓，駱梓恒，楚玉豪，邱耿韜，李嘯宇，金 昱，戎圣煒，王富華，甘 露，陳如歌，趙 亮

1南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院骨科-關(guān)節(jié)與骨病外科，廣東 廣州 510515；2南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院院辦，廣東 廣州510080

半月板損傷或者半月板衰退會導(dǎo)致膝關(guān)節(jié)失穩(wěn)，進而導(dǎo)致骨性關(guān)節(jié)炎（OA）的發(fā)生［1］，半月板的膠原纖維含量是其體質(zhì)量的28%，這些膠原纖維相互交織形成膠原纖維網(wǎng)，為其細胞的附著提供基礎(chǔ)架構(gòu)［2-4］。在膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎患者中，退變的半月板膠原化和鈣化程度增加，細胞密度降低［5］。這對提取退變半月板中的細胞造成了困難。單細胞RNA測序技術(shù)能在單細胞層面檢測細胞間的異質(zhì)性［6-9］。其高靈敏度能發(fā)現(xiàn)半月板組織中少量存在且未被發(fā)現(xiàn)的前體細胞亞群，為半月板損傷修復(fù)提供新的研究方向。

市面上使用最多的單細胞RNA 測序技術(shù)由10×Genomics 公司推出，對單細胞懸液的質(zhì)量具有十分嚴格的要求——細胞懸液中含有超過1×105細胞，其中80%是活細胞，而且不能含有細胞外基質(zhì)及細胞殘骸。傳統(tǒng)的半月板細胞提取方法無法獲得上述細胞懸液。報道最多的半月板細胞提取方法是使用膠原酶消化半月板組織10 h 以上［10-12］，但無法獲取足夠數(shù)量的活細胞。葉川團隊［13］嘗試使用階段消化法提取人胚半月板細胞，雖然細胞活率高，但總消化時間達18 h。Sun團隊［14］曾嘗試在半月板細胞上運用單細胞RNA測序技術(shù)，但沒能夠獲得符合要求的新鮮單細胞懸液。如果細胞在離體環(huán)境中存活時間過長，其基因表達會發(fā)生改變［15-17］。

鑒于上述原因，本文介紹了一種簡單、可重復(fù)而且耗時短的半月板細胞提取方法。用此方法進行3次重復(fù)實驗以驗證其有效性，并對獲得的3份細胞懸液分別進行單細胞RNA測序前評價和測序后評價。通過數(shù)據(jù)分析結(jié)果來評價優(yōu)化提取法的穩(wěn)定性和可靠性。

1 材料和方法

1.1 組織樣本

本文所用的半月板均來源于進行膝關(guān)節(jié)表面置換術(shù)的膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎患者。當半月板被切除后立即將半月板保存于無菌的4 ℃磷酸緩沖液（PBS）中，并在30 min內(nèi)將半月板送至實驗室。來源于小鼠，大鼠及豬的半月板也能通過此方法進行半月板細胞的提取。

1.2 主要材料

1.2.1 器械 鋒利的手術(shù)刀片及手術(shù)刀柄，2把鋒利的直眼科剪（12.5 cm），培養(yǎng)皿（100 mm×15 mm）、離心管（50 mL），巴斯吸管（3 mL），移液槍及吸頭（P1000，P200，P100，細胞篩網(wǎng)（40 μm；藍色），針式過濾器（0.22 μm），注射器（10 mL，20 mL），細胞計數(shù)板（Countstar）。

1.2.2 生物試劑 胎牛血清（FBS），磷酸緩沖液（1X）（PBS），基礎(chǔ)培養(yǎng)基（α-MEM）和青霉素-鏈霉素混合溶液（P/S）（Gibco），死細胞去除試劑（Miltenyi Biotec）。

1.2.3 消化酶 鏈霉蛋白酶，Ⅰ型膠原酶，Ⅱ型膠原酶（Sigma）。

1.3 溶液配制

1.3.1 細胞懸液緩沖液 將50 mL FBS 和5 mL P/S溶液加入至500 mL α-MEM溶液中，放置在4 ℃環(huán)境中保存，保持無菌。此種溶液最長可保存1月。

1.3.2 鏈霉蛋白酶溶液 此種溶液需要在使用前配制。將450 mg鏈霉蛋白酶加入至50 mL α-MEM中，配制成濃度為9 mg/mL的鏈霉蛋白酶溶液，經(jīng)針式過濾器過濾后放置在4 ℃環(huán)境中保存，保持無菌。

1.3.3 I型膠原酶和II型膠原酶混合液（I/II混合液）此種溶液需要在使用前配制。將10 mg I型膠原酶和10 mg II型加入至50 mL 細胞懸液緩沖液中，配制成濃度為0.2 mg/mL的I/II混合液，經(jīng)針式過濾器過濾后放置在4 ℃環(huán)境中保存，保持無菌。

1.4 方法

1.4.1 消化前處理 半月板切除后立即保存于無菌的4 ℃磷酸緩沖液（PBS）中，并在30 min內(nèi)送至實驗室。放在裝有4 ℃PBS的培養(yǎng)皿中，用手術(shù)刀和眼科剪剔除黏附于半月板周圍的滑膜組織，用10 mL 4 ℃PBS沖洗2～3 次，沖洗干凈后放置于另一個培養(yǎng)皿中，加少量4 ℃PBS維持濕潤。用手術(shù)刀將半月板切成碎塊，稱取3 g組織置于另一個培養(yǎng)皿，加少量4 ℃PBS維持組織濕潤，用眼科剪剪碎至1 mm。以上操作過程均在碎冰上進行（圖1）。

圖1 優(yōu)化半月板細胞提取法實驗流程圖Fig.1 Flow chart of the optimized protocol based on mechano-enzymatic dissociation of the meniscus.The meniscus is removed and cut into small pieces using a scalpel and then minced with sharp scissors (A,B).The tissue is then dissolved in pronase solution (C),incubated at 37 ℃and shaken mechanically (D).After centrifugation at 1000 r/min for 5 min,the supernatant is discarded(E),and the pellets are dissolved in I/II collagenase solution(F),incubated at 37 ℃and shaken mechanically(G).The sample is passed through a strain with the help of the sterile transfer pipettes(H).The suspension is centrifuged at 1000 r/min for 5 min twice and the supernatant is discarded(I).The single-cell suspension is ready for subsequent analyses(J).

1.4.2 消化 把半月板組織碎塊均勻分成6份，分別放入6 支50 mL離心管內(nèi)，隨機分成3組，分別是優(yōu)化提取組，傳統(tǒng)法-短時間組和傳統(tǒng)法-長時間組。優(yōu)化提取組：1.5 h鏈霉蛋白酶和3 h I型和II型膠原酶消化（Optimized protocol:1.5 h pronase+3 h I/II collagenase），傳統(tǒng)法-短時間組：4 h I 型和II 型膠原酶消化（4 h I/II collagenase），傳統(tǒng)法-長時間組：10 h I型和II型膠原酶消化（10 h I/II collagenase）（表1）。

表1 優(yōu)化提取法、傳統(tǒng)法-短時間消化和傳統(tǒng)法-長時間消化的比較Tab.1 Comparison of the optimized protocol,short-time digestion and long-time digestion

分別往3組離心管內(nèi)加入25 mL I型和II型膠原酶溶液、I型和II型膠原酶溶液和鏈霉蛋白酶溶液，輕輕搖晃離心管，避免氣泡產(chǎn)生。待半月板組織碎塊與消化溶液充分混合后，將離心管放置于37 ℃的水浴鍋中消化，每10 min搖晃1次。分別消化4、10和1.5 h。消化1.5 h后，將第3組（優(yōu)化提取組）的離心管以1000 r/min 轉(zhuǎn)速離心5 min，去除上清液后加入25 mL I/II膠原酶混合溶液，輕輕搖晃離心管，避免氣泡產(chǎn)生。待半月板組織碎塊與I/II膠原酶混合溶液充分混合后，將離心管放置于37 ℃的水浴鍋中消化，每10 min搖晃1次。消化3 h。

1.4.3 消化后處理 待各組消化到預(yù)設(shè)時間，取細胞篩網(wǎng)置于退去蓋帽的離心管上，構(gòu)成過濾裝置，將離心管中的組織懸液倒入篩網(wǎng)中進行過濾，用巴斯吸管攪拌輔助過濾，收集過濾后的液體。以1000 r/min 轉(zhuǎn)速對濾液進行5 min的離心，去除上清液，加入10 mL細胞懸液緩沖液重懸細胞。再以相同的轉(zhuǎn)速離心5 min。去除上清液，加入10 mL細胞懸液緩沖液重懸細胞，取出20 μL細胞懸液進行細胞計數(shù)，分別計算活細胞數(shù)，死細胞數(shù)和總細胞數(shù)，并在顯微鏡下觀察。此步驟進行3次并計算各組平均活細胞數(shù)、平均死細胞數(shù)和平均總細胞數(shù)，計算細胞活率。細胞活率計算公式如下：細胞活率=平均活細胞數(shù)/平均總細胞數(shù)×100%。

如何使防汛工作實現(xiàn)快速、高效、有序，需要一個針對性和操作性很強的防汛應(yīng)急聯(lián)動方案，方案修編應(yīng)圍繞“以人為本，群防群控，科學(xué)調(diào)度、統(tǒng)一指揮，分工負責、上下聯(lián)動”的原則，結(jié)合本地實際和防汛應(yīng)急預(yù)案，明確工作重點、工作措施、工作機制，提升防汛應(yīng)急系統(tǒng)聯(lián)動能力，切實保障人民群眾生命財產(chǎn)安全和社會和諧穩(wěn)定。

1.4.4 單細胞RNA測序及單細胞測序數(shù)據(jù)分析 用優(yōu)化提取法獲取3份半月板單細胞懸液，去除死細胞后用10×Genomics平臺的單細胞RNA測序技術(shù)進行單細胞RNA測序。

1.4.5 分析基于優(yōu)化提取法的單細胞RNA測序數(shù)據(jù)集分析基于優(yōu)化提取法的單細胞RNA測序數(shù)據(jù)集時，對3個數(shù)據(jù)集的分析是分開進行的。將這3個數(shù)據(jù)集命名為Sample1，Sample2和Sample3，并按照相同的流程進行分析。

按照Seurat 官方網(wǎng)站（https://satijalab.org/seurat/articles/pbmc3k_tutorial.html）提供的分析流程，使用R包“Seurat”對各數(shù)據(jù)集進行分析。首先分別統(tǒng)計總的細胞數(shù)量、線粒體含量為25%的細胞數(shù)量和線粒體含量為20%的細胞數(shù)量。之后對數(shù)據(jù)集進行質(zhì)控，設(shè)定細胞納入標準：nFeature_RNA>400，nFeature_RNA<2500 和線粒體含量低于20%。篩選出符合要求的細胞進行下游分析。選擇MCAM，COL1A1，CD34 這3 個細胞特征，觀察其在細胞群中的分布。使用ggplot2進行繪圖。

1.4.6 整合分析公開的數(shù)據(jù)集和基于優(yōu)化提取法的單細胞RNA測序數(shù)據(jù)集 從Gene Expression Omnibus Dataset下載公開的半月板單細胞RNA測序數(shù)據(jù)集（GSE133449）。首先對各個數(shù)據(jù)集進行質(zhì)控，設(shè)立統(tǒng)一的納入標準是：nFeature_RNA>400，nFeature_RNA<2500和線粒體含量低于5%。篩選出符合要求的細胞進行數(shù)據(jù)整合。按照Seurat 官網(wǎng)（https://satijalab.org/seurat/archive/v3.1/integration.html）提供的數(shù)據(jù)集整合流程，將公開的半月板單細胞RNA 測序數(shù)據(jù)集和基于優(yōu)化提取法的單細胞RNA測序數(shù)據(jù)集進行整合并去除批次效應(yīng)。之后進行下游分析。使用的軟件包信息R：version 3.63；Seurat：version 3.15；ggplot2：version 3.03。

2 結(jié)果

2.1 不同細胞提取方法獲取的有效性評價

消化結(jié)束后，對各組剩余的半月板組織進行觀察。使用優(yōu)化提取法（1.5 h鏈霉蛋白酶和3 h I/II膠原酶）消化后，半月板組織碎塊的體積更小，說明優(yōu)化提取法能更加充分消化半月板組織（圖2）。

圖2 對使用不同方法消化后剩余的半月板組織進行觀察Fig.2 Observation of the remaining meniscus tissues from different extraction protocols after digestion.(Optimized protocol:1.5 h pronase+3 h I/II collagenase,Traditional protocol-short time digestion:4 h I/II collagenase,Traditional protocol-long time digestion:10 h I/II collagenase).

在顯微鏡下對各組細胞懸液進行觀察，優(yōu)化提取法獲得的細胞懸液細胞密度最高，而且多個視野中均未發(fā)現(xiàn)明顯細胞外基質(zhì)及細胞殘?。▓D3）。圖3 顯微鏡下對使用不同提取方法獲得的細胞懸液進行觀察（優(yōu)化提取法組：1.5 h鏈霉蛋白酶和3 h I/II型膠原酶，傳統(tǒng)法-短時間組：4 h/II型膠原酶，傳統(tǒng)法-長時間組：10 h I/II型膠原酶）在進行細胞計數(shù)后，使用優(yōu)化提取法獲得的細胞懸液中細胞數(shù)量及細胞活率最高。在3次實驗中，使用優(yōu)化提取法分別提取出2.40×105，1.64×106，6.91×105細胞，平均獲得8.57×105細胞（圖4）。其中活細胞個數(shù)分別是2.05×105，1.33×106和5.79×105，平均活細胞個數(shù)是7.05×105。進行細胞活率計數(shù)后發(fā)現(xiàn)，優(yōu)化提取組細胞懸液的細胞活率均在80%以上（分別是85.6%，81.5%和83.8%），高于傳統(tǒng)方法組（長時間組和短時間組）細胞懸液的細胞活率。

圖3 顯微鏡下對使用不同提取方法獲得的細胞懸液進行觀察Fig.3 Observation of the single-cell suspension prepared using different extraction protocols under microscope.(Optimized protocol:1.5 h pronase+3 h I/II collagenase,traditional protocol-short time digestion:4 h I/II collagenase,traditional protocol-long time digestion:10 h I/II collagenase).

圖4 不同提取方法獲得的單細胞懸液細胞計數(shù)柱狀圖Fig.4 Cell counting of single-cell suspensions prepared using different extraction protocols.

2.2 優(yōu)化提取法穩(wěn)定性評價

用優(yōu)化提取法獲得的半月板單細胞懸液后，利用10×Genomics平臺的單細胞RNA測序技術(shù)進行測序，通過分析3個單細胞RNA測序數(shù)據(jù)集對優(yōu)化提取法進行穩(wěn)定性評價。

首先對數(shù)據(jù)集進行整體觀察。進行單細胞RNA測序后，每個樣本分別獲得8257、11 945和21 199個細胞的RNA測序數(shù)據(jù)（圖5A）。其中，每個樣本大部分細胞的線粒體基因含量較低。在3個樣本中，線粒體基因含量低于20%的細胞數(shù)量分別是8146，10 983 和19 887個（圖5B），各占相應(yīng)樣本總細胞數(shù)量的95.36%，75.13%和83.51%（圖5C）。3 個樣本平均含有13 005個線粒體基因含量低于20%的細胞，占總平均細胞數(shù)的83.06%。之后進行數(shù)據(jù)質(zhì)控，將線粒體基因含量低于20%設(shè)為納入標準，篩選符合要求的細胞進行下游分析。從t-SNE圖中看出，3個細胞懸液樣本中的細胞均可分成6個細胞亞群（圖6A～C）。其中，3個樣本中都含有COL1A1+細胞，MCAM+細胞和CD34+細胞。

圖5 優(yōu)化提取法穩(wěn)定性的評價Fig.5 Evaluation of the stability of optimized protocol.Violin plots showing proportion of mitochondrial genes expression of each sample(A).Bar graphs showing the number of cells with mitochondrial genes below 25%and 20%(B)and the percentage of cells with less than 20%mitochondrial genes(C)in each sample(95.36%,75.13%,83.51%and 83.06%respectively).

圖6 每個半月板樣本的細胞亞群（6個細胞亞群）t-SNE圖譜和COL1A1+、MACM+及CD34+細胞在t-SNE圖上的分布Fig.6 Six meniscus cell clusters and COL1A1+,MCAM+ and CD34+ meniscal cell markers shown in t-distributed stochastic neighbour embedding (t-SNE) map of each sample.A:Sample 1 (including 8146 cells);B:Sample 2 (10983 cells);C:Sample 3(19887 cells).

2.3 優(yōu)化提取法的可靠性評價

表2 優(yōu)化提取法和培養(yǎng)提取法比較Tab.2 Comparison of optimized protocol and control protocol

經(jīng)過批次效應(yīng)的去除和標準的單細胞RNA數(shù)據(jù)集整合后，從t-SNE圖上看，整合后數(shù)據(jù)集中的細胞分布均勻，并且可以發(fā)現(xiàn)，在兩個數(shù)據(jù)集中存在轉(zhuǎn)錄組特征相同的細胞（圖7A）。整合的細胞群共分6個細胞亞群（圖7B）。結(jié)合兩圖可知，兩種方法獲得的細胞類型相同。從細胞亞群特異性標志物角度（圖8）觀察，與培養(yǎng)提取法一致，優(yōu)化提取法也能捕獲到COL3A1+細胞，COL1A1+細胞，MYLK+細胞，BMP2+細胞，CD93+細胞和CDK1+細胞。

圖7 優(yōu)化提取法和培養(yǎng)提取法獲得的單細胞RNA轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)集比較Fig.7 Comparison of single-cell RNA transcription datasets obtained by optimized protocol and control protocol.Merged t-distributed stochastic neighbour embedding (t-SNE) of single-cell RNA sequencing of cells harvested from optimized protocol and control protocol (A).6 meniscus cell clusters at t-SNE of integrated dataset(B).

圖8 COL3A1，COL1A1，MYLK，BMP2，CD93和CDK1分別在兩個數(shù)據(jù)集的表達Fig.8 Expression of COL3A1,COL1A1,MYLK,BMP2,CD93 and CDK1 in two datasets[Optimized protocol(left),control protocol(right)].

3 討論

退變的半月板膠原化程度增高及細胞密度降低是造成半月板單細胞提取困難的主要原因。既往的研究表明，提取細胞依賴I型膠原酶和II型膠原酶的長時間消化，消化時間長達10～16 h［10-12］。僅僅通過延長膠原酶消化的時間并不能大幅度地提高細胞提取量［18］。長時間處于膠原酶消化液的環(huán)境中，細胞可能會被損傷甚至死亡。葉川團隊［13］嘗試階段消化法分離人胚胎半月板細胞，雖然獲得了高活力的細胞懸液，但需耗時18 h。胚胎半月板的細胞活力高，而退變半月板的細胞活力相對較低。暫無研究表明此種方法適用于提取退變半月板中的細胞。分階段提取半月板細胞難以保證細胞狀態(tài)的一致，影響后續(xù)單細胞RNA測序數(shù)據(jù)的準確性和可靠性。一些研究者也報道了利用膠原酶消化3～4 h進行半月板細胞提?。?9,20］，然而卻沒有詳細描述細胞懸液中的雜質(zhì)。我們在進行實驗探索時發(fā)現(xiàn)，膠原酶消化3～4 h后獲得的細胞懸液中含有大量膠原顆粒及細胞殘骸。這些雜質(zhì)比細胞小，使用10×Genomics平臺進行單細胞測序時，雜質(zhì)阻塞微液滴通道，導(dǎo)致無法捕獲細胞；此外，細胞外基質(zhì)和細胞殘骸也含有RNA信息，會給隨后的數(shù)據(jù)分析帶來干擾。

Sanchez-Adams等［18］最先報道了聯(lián)合使用鏈霉蛋白酶和膠原酶進行半月板細胞提取并有效地從牛的半月板中提取出半月板細胞；Sun 團隊［14］證明了聯(lián)合使用鏈霉蛋白酶和膠原酶在提取人類半月板細胞時同樣起作用，但卻沒能夠獲得新鮮的半月板單細胞懸液進行10×Genomics平臺的單細胞RNA測序。

與先前報道的半月板細胞提取方法相比，本實驗方案對半月板細胞提取過程的幾處關(guān)鍵步驟進行了改進，從而能夠更快（5.5 h）地獲得新鮮的半月板單細胞懸液進行單細胞RNA測序。首先，我們建立一條從手術(shù)室到實驗室的快速通道，在半月板離體后30 min即可開展實驗。其次，由于半月板十分堅韌，只靠眼科剪將半月板剪碎的效率低下，于是我們先采用手術(shù)刀將半月板切成小碎塊，之后使用眼科剪將半月板組織碎塊剪碎至1 mm大小，整個過程僅需花費15～20 min。最后，通過優(yōu)化鏈霉蛋白酶和膠原酶消化的時間，大大提高半月板細胞提取的效率。

鏈霉蛋白酶消化之后，組織懸液中充滿了絮狀物，但尚不清楚鏈霉蛋白酶與半月板發(fā)生作用。據(jù)文獻報道，鏈霉蛋白酶能與多種蛋白質(zhì)發(fā)生作用并將其分解成氨基酸［21,22］。Lee等［23］證實了鏈霉蛋白酶能將成團的細胞群分散成一個一個細胞，然而，我們并沒有在鏈霉蛋白酶消化后的組織懸液中找到細胞，可能鏈霉蛋白酶將半月板組織內(nèi)致密的膠原纖維變得松散，讓I型和II型膠原酶更容易將半月板細胞提取出來，機制仍需進一步探索。

在對單個單細胞RNA測序數(shù)據(jù)進行分析時，3個基于優(yōu)化提取法的單細胞RNA測序數(shù)據(jù)集中的細胞都分成6 個亞群，都存在COL1A1+，MCAM+和CD34+細胞［24-26］，數(shù)據(jù)結(jié)果具有一致性，說明優(yōu)化提取法具有很好的穩(wěn)定性。

在進行兩個或多個單細胞RNA測序數(shù)據(jù)比較分析時，由于批次效應(yīng)的存在使實驗獲得的數(shù)據(jù)存在不同程度的誤差［27-29］。不能簡單地將兩個或多個單細胞RNA數(shù)據(jù)集組合分析。批次效應(yīng)是測量結(jié)果中的一部分，因為實驗條件的不同而具有不同的表現(xiàn)形式，并且與研究的變量沒有任何關(guān)系。一般批次效應(yīng)可能在下述情形中出現(xiàn)：實驗的不同部分在不同時間完成；實驗的不同部分由不同的人完成；試劑用量、芯片、實驗儀器不同；將測得的數(shù)據(jù)與從數(shù)據(jù)庫下載的數(shù)據(jù)混合比較。批次效應(yīng)的存在掩蓋了單細胞RNA測序數(shù)據(jù)的真實性，給下游分析和結(jié)果的呈現(xiàn)帶來的影響。

在本文中，比較優(yōu)化提取法和培養(yǎng)提取法獲得的單細胞RNA測序數(shù)據(jù)時也存在明顯的批次效應(yīng)。因此要進行批次效應(yīng)的去除。去除批次效應(yīng)的方法有很多種，本文采用了錨定整合法［30］，這種方法綜合了基于CCA降維［31］和MNN搜索互近鄰的方案［27］，利用兩個或多個獨立單細胞RNA測序數(shù)據(jù)集中存在的少部分屬于同一細胞類型的數(shù)據(jù)點對整個數(shù)據(jù)集進行“錨定”進而整合多個數(shù)據(jù)集，經(jīng)整合后批次效應(yīng)得到去除，同時真實生物學(xué)效應(yīng)也能得到很好的保留［32,33］。

t-SNE是一種用于降維的機器學(xué)習(xí)算法，它能將高維度數(shù)據(jù)降維到二維并進行可視化。降維后數(shù)據(jù)的主要特征得到保留。在高維空間中距離接近的點，它們的特征十分接近，進行t-SNE降維后，這些點在低維度空間中仍然接近。在t-SNE圖中，一個點往往代表一個細胞，并且點的距離越接近，細胞的轉(zhuǎn)錄組特征越相近。從圖7A，B上看，兩組數(shù)據(jù)集充分混合，整合后的數(shù)據(jù)均勻地分布于6個細胞亞群中，并且存在轉(zhuǎn)錄組特征相同的細胞，一定程度上說明批次效應(yīng)得到矯正，兩組數(shù)據(jù)具有可比性。

Sun等［14］通過分析基于培養(yǎng)提取法的單細胞RNA測序數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)并驗證半月板中存在COL3A1+細胞，COL1A1+細胞，MYLK+細胞，BMP2+細胞，CD93+細胞和CDK1+細胞。本研究與該分析結(jié)果一致，基于優(yōu)化提取法的單細胞RNA測序數(shù)據(jù)中也存在相同的細胞，說明優(yōu)化提取法具有可靠性。

綜上所述，本文介紹的半月板細胞提取新方法穩(wěn)定、可靠，具有可重復(fù)性，并且能夠在短時間內(nèi)獲取高質(zhì)量的半月板細胞懸液，為深入研究半月板細胞種類及探尋半月板干細胞提供可參考的實驗方法。