劉 磊，杜成友，魏續(xù)福，廖 銳

重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院肝膽外科，重慶400016

肝細(xì)胞癌（HCC）是一種常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，占原發(fā)性肝癌的90%，其發(fā)病率和死亡率分別位居世界第6位和第4位［1-3］。雖然外科手術(shù)已經(jīng)明顯改善了HCC患者的預(yù)后，但是由于其高死亡率，HCC患者的5年生存率仍然很低［4,5］。肝星狀細(xì)胞（HSCs）是位于肝竇內(nèi)皮細(xì)胞與肝細(xì)胞之間的肝臟間質(zhì)細(xì)胞，在細(xì)胞增殖、肝纖維化和肝臟腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著重要作用［6,7］。環(huán)狀RNA（circRNA）屬于非編碼RNA家族的成員，比線(xiàn)性RNA更加的保守、穩(wěn)定，不易被降解［8,9］，其特征是共價(jià)閉環(huán)結(jié)構(gòu)，既沒(méi)有5'-3'極性，也沒(méi)有聚腺苷化的尾巴，它們是由單個(gè)前mRNA 的后剪接產(chǎn)生的RNA轉(zhuǎn)錄本［10,11］。CircRNA的異常表達(dá)在肝癌中也起著重要的作用［12-14］，且已有報(bào)道circRNA抑制肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移從而改善HCC患者的預(yù)后［15,16］，但是肝星狀細(xì)胞中的circRNA與HCC的關(guān)系未見(jiàn)報(bào)道。本研究中，我們利用基因表達(dá)譜分析了腫瘤活化HSCs 所分泌的circRNA 的差異表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)circWDR25上調(diào)最為顯著。我們首次分析了癌旁組織中circWDR25與根治性切除后的HCC的預(yù)后關(guān)系，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料和方法

1.1 研究對(duì)象

288例接受根治性切除的HCC患者均來(lái)自我院肝膽外科。所有病例的入選標(biāo)準(zhǔn)如下：（1）年齡為18～79歲；（2）行R0 根治性切除；（3）術(shù)前未進(jìn)行任何抗癌治療；（4）無(wú)肝外轉(zhuǎn)移；（5）完整的臨床病理資料及隨訪(fǎng)數(shù)據(jù)。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）腫瘤有肝外轉(zhuǎn)移；（2）合并其他部位腫瘤；（3）合并血液或其他免疫系統(tǒng)疾病。術(shù)后對(duì)這些患者進(jìn)行定期的電話(huà)、門(mén)診等方式隨訪(fǎng)，每半年1次，記錄患者生存狀態(tài)和疾病進(jìn)展情況。隨訪(fǎng)時(shí)間為手術(shù)日期到2021年1月31日，中位隨訪(fǎng)時(shí)間45.8月。所有患者均簽署知情同意書(shū)。本研究經(jīng)重慶醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 細(xì)胞和試劑

人肝星狀細(xì)胞系LX-2（武漢普諾賽），人肝癌細(xì)胞系Hep3B（中科院上海細(xì)胞庫(kù)），HCCLM3、SMMC-7721由重慶醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)院饋贈(zèng)；DMEM、PBS（Gibico），胎牛血清（PAN）；經(jīng)地高辛標(biāo)記的circWDR25 及α-SMA 寡核苷酸探針，探針合成序列分別為5'-CAA AGCCAAACCACCTTGAAAGTTTTATC-3'、5'-ATGG GAAAACAGCCCTGGGAGCATCGTC-3'，氯仿、異丙醇和無(wú)水乙醇（上海試一化學(xué)試劑有限公司）；0.4 μm transwell小室（Corning）。

1.3 Exo-free血清的制備

取300 mL胎牛血清裝于超速離心管，熱封儀將超速離心管封口，用超速離心機(jī)（Beckman optima XPN-100）在4℃、120 000g條件下過(guò)夜離心18 h后，將超速離心管內(nèi)的血清用0.22 μm濾菌器過(guò)濾后轉(zhuǎn)移至無(wú)菌50 mL離心管管內(nèi)，制備好的Exo-free血清于-20 ℃保存。

1.4 Transwell小室法共培養(yǎng)體系

HSCs細(xì)胞系LX-2按每孔1×104接種于24孔培養(yǎng)板中，將transwell小室（0.4 μm）放入培養(yǎng)板內(nèi)，小室內(nèi)分別接種1×104Hep3B、SMMC-7721、HCCLM3，24 h后去除培養(yǎng)液后清洗貼壁生長(zhǎng)的LX-23次后，用不含外泌體的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集上清液。

1.5 總RNA提取

獲取HSCs培養(yǎng)上清，利用超速離心法分離出外泌體［17］，將-80 ℃保存的外泌體溶液冰上溶解，加入Trizol試劑1 mL，室溫靜置5 min充分裂解細(xì)胞；加入200 μL氯仿，劇烈震蕩15 s，室溫放置10 min，分離蛋白和RNA；4 ℃下12 000g離心15 min，小心分離含RNA 的無(wú)色相；加入400 μL異丙醇沉淀RNA，室溫靜置10 min；4 ℃下12 000g離心15 min棄去上清，用75%無(wú)水乙醇清洗RNA沉淀；4 ℃下7500g離心10 min棄去液體，室溫干燥30 min；RNase-free水溶解RNA，測(cè)定RNA濃度和純度，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 circRNA基因表達(dá)譜分析

利用試劑盒（Arraystar Human circRNAArray V2，8×15K,Arraystar）將分離出的HSCs外泌體的總RNA進(jìn)行circRNA的基因表達(dá)譜分析，數(shù)據(jù)分析由上海康成生物科技有限公司完成。

1.7 原位雜交（ISH）染色

將石蠟切片脫蠟，滴加0.3%的TritonX-100通透。分別滴加適量0.2 N 鹽酸和0.25%的胃蛋白酶后并用PBS洗滌。4%多聚甲醛固定后，雜交緩沖液于55 ℃孵育2 h。雜交緩沖液按1∶1000的比例稀釋circWDR25、α-SMA探針，于85 ℃變性2 min，37 ℃平衡2 min。吸去多余的雜交緩沖液，滴加適量變性后的探針于組織切片上，于4 ℃孵育12～18 h。用2×SSC洗滌3次后，室溫封閉15 min，棄去封閉液，滴加適量堿性磷酸酶標(biāo)記的抗地高辛二抗（1∶800），4 ℃孵育過(guò)夜。PBS洗滌3次，滴加適量BCIP/NBT 染色工作液染色，蒸餾水洗滌1～2次，梯度酒精脫水，二甲苯透亮，使用中性樹(shù)膠封片。

1.8 結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)

染色強(qiáng)度評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)：無(wú)著色，0分；弱著色，1分；中度著色，2分；強(qiáng)著色，3分。陽(yáng)性細(xì)胞比例評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)為：0～25%，1分；26～50%，2分；51～75%，3分；>75%，4分。兩者分?jǐn)?shù)相乘得到最終得分，得分大于中位數(shù)為高表達(dá)，小于中位數(shù)為低表達(dá)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。Kaplan-Meier法進(jìn)行生存分析，生存率比較采用log-rank檢驗(yàn)。多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析肝細(xì)胞癌患者預(yù)后的影響因素。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。利用X-tile軟件最小P值法［18］獲得circWDR25與α-SMA陽(yáng)性表達(dá)量的最佳界值分別為190、70。

2 結(jié)果

2.1 circWDR25基因表達(dá)譜散點(diǎn)圖：

circRNA基因表達(dá)譜（圖1）結(jié)果顯示circWDR25表達(dá)上調(diào)最明顯。circWDR25（圖2A）與α平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）（圖2B，活化肝星狀細(xì)胞標(biāo)志）主要分布于細(xì)胞質(zhì)，多見(jiàn)于間質(zhì)組織。

圖1 肝癌細(xì)胞活化LX-2 分泌的外泌體中的circRNA基因表達(dá)譜顯示差異表達(dá)的circRNA散點(diǎn)圖Fig.1 Scatter plot of differential expression of circRNA shown by circRNA gene expression profile of the exosomes from LX-2 cells activated by hepatocellular carcinoma cells.A:Hep 3B.B:SMMC7721.C:HCCLM3.

圖2 癌旁circWDR25（A）和α-SMA（B）的原位雜交表達(dá)Fig.2 In situ hybridization for detecting the expression of circWDR25(A)and α-SMA(B)in the adjacent tissues(Original magnification:×200).

2.2 circWDR25與α-SMA的關(guān)系研究

計(jì)數(shù)每個(gè)高倍鏡視野下的circWDR25與α-SMA陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)量，每張切片計(jì)數(shù)陽(yáng)性表達(dá)最多的3個(gè)視野，并計(jì)算每個(gè)患者的陽(yáng)性細(xì)胞平均數(shù)。相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)癌旁circWDR25與α-SMA成正相關(guān)（r=0.156，P=0.008）。

2.3 HCC預(yù)后影響單因素分析

術(shù)前天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、腫瘤數(shù)目、腫瘤大小、有無(wú)癌栓、BCLC 分期、HSC 陽(yáng)性表達(dá)量、circWDR25 陽(yáng)性表達(dá)量與肝細(xì)胞癌患者的累積生存率和無(wú)瘤生存率相關(guān)（表1）。所有患者中位生存時(shí)間45.6 月（1.5～74.3月），中位無(wú)瘤生存時(shí)間40.2月（1.0～74.2月）。

表1 288例不同臨床病理特征的肝細(xì)胞癌患者累積生存率和累積無(wú)瘤生存率比較Tab.1 Comparison of overall and tumor-free survival rates of 288 HCC patients with different clinicopathological characteristics

2.4 多因素結(jié)果分析

將單因素分析結(jié)果中有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的因素納入Cox回歸模型進(jìn)行多因素分析（表2），結(jié)果顯示：術(shù)前AST>36 g/L（HR=1.141 CI：1.015～1.282）、腫瘤多發(fā)（HR=2.825 CI：1.703～4.685）、腫瘤直徑>5 cm（HR=3.435 CI：2.242～5.263）、α-SMA>70（HR=5.818 CI：2.115～16.005）、circWDR25>190（HR=1.918 CI：1.252～2.940）為HCC患者根治性肝切除術(shù)后生存的獨(dú)立危險(xiǎn)因素；同時(shí)，術(shù)前AST>36g/L（HR=1.136 CI：1.005～1.285）、腫瘤多發(fā)（HR=1.762 CI：1.132～2.744）、腫瘤直徑>5 cm（HR=2.090 CI：1.475～2.961）、有癌栓（HR=1.639 CI：1.146～2.344）α-SMA>70（HR=5.240 CI：2.539～10.816）、circWDR25>190（HR=1.732 CI：1.238～2.423）是肝癌患者無(wú)瘤生存的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

表2 肝細(xì)胞癌患者預(yù)后的多因素Cox回歸分析Tab.2 Multivariate Cox regression analysis of the prognosis of patients with HCC

2.5 CircWDR25 與HCC 患者根治性切除術(shù)后的預(yù)后關(guān)系

低circWDR25（≤190）組患者1、3、5年總體生存率為：93.9%、81.2%、73.9%，無(wú)瘤生存率為：81.2%、64.2%、57.4%；而高circWDR25（>190）組患者1、3、5年總體生存率為：75.7%、52.4%、46%，無(wú)瘤生存率為：69.2%、39.4%、25.1%。低circWDR25組1、3、5年總體生存率及無(wú)瘤生存率均高于高circWDR25 組（P<0.001，圖3）。

圖3 circWDR25在肝細(xì)胞癌患者中的總體生存曲線(xiàn)Fig.3 Overall survival curve of patients with HCC with different circWDR25 expression levels.

3 討論

本研究首次證實(shí)癌旁肝星狀細(xì)胞中的circWDR25表達(dá)水平與HCC患者術(shù)后的預(yù)后關(guān)系，基因表達(dá)譜分析比較發(fā)現(xiàn)，circWDR25 在不同肝癌細(xì)胞刺激后的LX-2的外泌體中表達(dá)上調(diào)均最顯著，癌旁肝組織中肝星狀細(xì)胞與circWDR25的表達(dá)水平成正相關(guān)。HCC患者術(shù)后的預(yù)后關(guān)系分析提示，術(shù)前AST>36 g/L、腫瘤多發(fā)、腫瘤>5 cm、HSC>70、circWDR25>190為影響HCC患者根治性切除術(shù)后總體生存率的獨(dú)立危險(xiǎn)因素；術(shù)前AST>36、腫瘤多發(fā)、腫瘤>5 cm、有癌栓、HSC>70、circWDR25>190為HCC 患者無(wú)瘤生存率的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。同時(shí)發(fā)現(xiàn)低circWDR25組的總體生存率和無(wú)瘤生存率均高于circWDR25高表達(dá)組。

首先，腫瘤活化的HSCs 可能通過(guò)外泌體源性的circWDR25參與HCC的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。我們既往的多項(xiàng)研究也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，HSCs能夠通過(guò)多條信號(hào)通路（如TREM-1，IL-17，ERK）作用于肝癌細(xì)胞，從而促進(jìn)HCC的惡性生物學(xué)行為［19］。同時(shí)，在腫瘤微環(huán)境中，活化的HSCs能夠分泌白細(xì)胞介素-6、腫瘤壞死因子-α，參與肝癌細(xì)胞的“互動(dòng)”，進(jìn)而影響HCC的進(jìn)程及預(yù)后［20,21］。同時(shí)，HSCs能產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子如（TGF-β）誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞形成免疫抑制，從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞的免疫逃逸［22］。但是，HSCs和肝癌細(xì)胞的具體作用方式尚不清楚。最近的研究發(fā)現(xiàn)，外泌體在調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中腫瘤與正常細(xì)胞溝通中起著至關(guān)重要的作用［23,24］，外泌體介導(dǎo)的circRNA 轉(zhuǎn)移被發(fā)現(xiàn)是癌癥的一種新機(jī)制［25］。Huang等［26］報(bào)道了肝癌來(lái)源的外泌體環(huán)狀RNA通過(guò)增強(qiáng)侵襲性和血管生成促進(jìn)肝細(xì)胞癌的轉(zhuǎn)移。本項(xiàng)研究為HSCs和肝癌細(xì)胞之間通過(guò)外泌體相互作用提供了新的實(shí)驗(yàn)室證據(jù)。

其次，circWDR25在HSCs和HCC 之間的信息傳遞中起著關(guān)鍵作用。目前已經(jīng)明確，circRNA可以作為微小RNA(miRNA)海綿、RNA 結(jié)合蛋白海綿和翻譯調(diào)節(jié)因子在基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮著重要作用［27-29］。例如，circRNA-5692可以通過(guò)降低miR-328-5P的表達(dá)來(lái)提高DAB2IP 的表達(dá)，從而抑制肝癌的發(fā)生發(fā)展［13］；circRNA Cdr1as 通過(guò)海綿化miR-1270 促進(jìn)AFP 的表達(dá)從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞的遷移、侵襲和增殖［30］。這項(xiàng)研究中，通過(guò)肝癌細(xì)胞刺激，并利用基因表達(dá)譜發(fā)現(xiàn)的HSCs中的circWDR25高度活化，且在癌旁組織中高表達(dá)，說(shuō)明其參與了HSCs和HCC之間的“對(duì)話(huà)”，可能在HCC的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵的作用，但具體的作用機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

此外，癌旁circWDR25的高表達(dá)與HCC預(yù)后差密切相關(guān)，并與癌旁HSCs 的表達(dá)成正相關(guān)，說(shuō)明其是HSCs分泌的促瘤因子，能夠促進(jìn)腫瘤的惡性生物學(xué)行為。同時(shí)，癌旁組織中的circWDR25也可能作為評(píng)估HCC預(yù)后及手術(shù)篩選的一個(gè)參考指標(biāo)。

綜上所述，癌旁circWDR25和HSCs是HCC患者根治性肝切除術(shù)后預(yù)后的重要影響因素，二者在癌旁組織中的高表達(dá)與預(yù)后差密切相關(guān)。它們可能作為HCC根治性切除術(shù)后高復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)患者的篩查和監(jiān)測(cè)指標(biāo)，并為患者術(shù)后的綜合治療提供參考依據(jù)。