朱雅莉，章述軍，陽 成，薛 薇，張 佳，李佳俊，趙金秋，徐 靜，黃文祥

重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院感染科，重慶400016

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是一種與胰島素抵抗（IR）和遺傳易感密切相關(guān)的代謝應(yīng)激性肝損傷，疾病譜包括非酒精性肝脂肪變、非酒精性脂肪性肝炎（NASH）、肝硬化和肝細(xì)胞癌（HCC）［1］。一旦從NAFLD發(fā)展為NASH，炎癥會(huì)引起肝損傷，損失的肝細(xì)胞需要修復(fù)功能，而修復(fù)的過程則會(huì)導(dǎo)致肝纖維化，甚至肝硬化?；诖耍琋ASH所致慢性肝衰竭是歐美肝移植的主要原因之一，同樣是臨床研究的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［2］。目前，非酒精性脂肪性肝炎的發(fā)病機(jī)制尚未明確，全面分析其差異蛋白可能推動(dòng)新的發(fā)病機(jī)制及治療靶點(diǎn)。

蛋白質(zhì)組學(xué)是高通量篩選和分析表達(dá)水平、蛋白質(zhì)修飾以及蛋白質(zhì)功能和蛋白質(zhì)相互作用等過程的研究方式［3］。同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量（iTRAQ）是目前應(yīng)用較廣的多肽體外標(biāo)記定量技術(shù)，具有精確性高、高通量、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)［4］。

既往研究中用小鼠肝臟作為樣本進(jìn)行的肝臟蛋白質(zhì)組學(xué)的研究眾多［5-8］，但高脂飲食造模小鼠的飲食結(jié)構(gòu)、遺傳背景與人體不同。而人體血液樣本組織進(jìn)行的血漿蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)確實(shí)發(fā)現(xiàn)了NAFLD發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵蛋白PIGR、RBP4、Lumican［9-11］等。但研究表明現(xiàn)有的基于血液發(fā)現(xiàn)的關(guān)鍵蛋白都不是高度準(zhǔn)確的［12］，且血漿中存在高豐度蛋白混雜，關(guān)鍵作用蛋白在血漿低豐度或不分泌等因素，用人肝臟組織是最為直接可靠的方式，而典型的人NASH組織標(biāo)本難以獲取，少數(shù)研究也是在藥物干預(yù)下進(jìn)行［13,14］，無法對(duì)人類肝臟蛋白譜進(jìn)行全面分析。因此在本研究中，將收集到的人肝臟組織通過病理活檢分為NASH模型組和正常組，用iTRAQ蛋白標(biāo)記篩選出差異蛋白，用生物信息學(xué)分析差異蛋白在其炎癥發(fā)生過程中中發(fā)揮的作用。

1 資料和方法

1.1 臨床資料

納入標(biāo)準(zhǔn)：18周歲以上成人，漢族，腹部彩超提示脂肪肝存在和（或）肝臟超聲影像和瞬時(shí)彈性成像提示脂肪衰減值大于240 dB/m；肝功提示ALT、GGT 等異常；病理發(fā)現(xiàn)肝腺泡3區(qū)大泡性或以大泡為主的混合性肝細(xì)胞脂肪變、伴或不伴有肝細(xì)胞氣球樣變、小葉內(nèi)混合性炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)以及竇周纖維化，NAS>4分則可診斷NASH。排除標(biāo)準(zhǔn)有活動(dòng)性病毒性肝炎，藥物引起的肝病，全胃腸外營(yíng)養(yǎng)，肝竇有癥狀的核變性和自身免疫性肝病或飲酒的肥胖患者（過去12月內(nèi)每周飲用乙醇量；女性>70 g，男性>140 g）；肝硬化及其他終末期疾病或惡性腫瘤以及其他可能有不適合檢查的疾病的患者。該研究獲重慶醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，倫理許可證號(hào)為2020-385。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本處理 采集到的肝組織干冰運(yùn)送至重慶市傳染病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，組織分裝成3部分，一部分用福爾馬林浸泡制作病理切片，一部分組織用RNA later保存進(jìn)行熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)，余下組織液氮保存行蛋白組學(xué)分析。

1.2.2 樣品蛋白質(zhì)檢 每樣取30 μg 蛋白溶液加入適量loading buffer 混勻后95 ℃加熱5 min，25 000g離心5 min，取上清點(diǎn)入12%SDS聚丙烯酰胺凝膠的點(diǎn)樣孔中，120 V恒壓電泳120 min；電泳結(jié)束后，考馬斯亮藍(lán)染色2 h，之后加入適量脫色液（40%乙醇10%乙酸）置于搖床脫色液3～5次，30 min/次。

1.2.3 蛋白酶解 取100 μg加入到1.5 mL離心管中；按Trypsin酶（μg）：底物蛋白（μg）=1∶20加入酶液，渦旋振蕩后，低速離心1 min，37 ℃孵育2 h；取出消化好的肽段液進(jìn)行除鹽操作；將除鹽后得到的肽段液冷凍抽干。

1.2.4 肽段標(biāo)記 根據(jù)樣品數(shù)量，取出一定量iTRAQ標(biāo)簽試劑；待試劑恢復(fù)至室溫后，每管試劑加入50 μL異丙醇，渦旋震蕩后低速離心；用0.5 mol/L TEAB溶解肽段樣品，并加入到對(duì)應(yīng)iTRAQ標(biāo)簽試劑中。不同樣品肽段選用不同的iTRAQ標(biāo)簽；室溫靜止2 h。

1.2.5 肽段分離 采用島津LC-20AB液相系統(tǒng)，分離柱為5 μm 4.6×250 mm Gemini C18柱對(duì)樣品進(jìn)行液相分離。用流動(dòng)相A（5%ACN pH9.8）復(fù)溶抽干的肽段樣品并進(jìn)樣，以1mL/min 的流速梯度洗脫：5% 流動(dòng)相B（95%ACN，pH9.8）10 min，5%～35%流動(dòng)相B 40 min，35%～95%流動(dòng)相B 1 min，流動(dòng)相B持續(xù)3 min，5%流動(dòng)相B平衡10 min。在214 nm波長(zhǎng)下監(jiān)測(cè)洗脫峰并每分鐘收集一個(gè)組分，結(jié)合色譜洗脫峰圖合并樣品得到20個(gè)組分，然后冷凍抽干。

1.2.6 高效液相 將抽干的肽段樣品用流動(dòng)相A（2%ACN，0.1%FA）復(fù)溶，20 000g離心10 min后，取上清進(jìn)樣。通過Thermo 公司UltiMate 3000 UHPLC 進(jìn)行分離。納升液相分離末端直接連接質(zhì)譜儀。

1.2.7 質(zhì)譜檢測(cè) 經(jīng)過液相分離的肽段通過nanoESI源離子化后進(jìn)入到串聯(lián)質(zhì)譜儀Q-Exactive HF X（Thermo Fisher）進(jìn)行DDA（data-dependent acquisition）模式檢測(cè)。主要參數(shù)設(shè)置：離子源電壓設(shè)置為1.9 kV；一級(jí)質(zhì)譜掃描范圍350～1500 m/z；分辨率設(shè)置為60 000；二級(jí)質(zhì)譜起始m/z固定為100；分辨率15 000。二級(jí)碎裂的母離子篩選條件為：電荷2+到6+，峰強(qiáng)度超過10 000的強(qiáng)度排在前20的母離子。離子碎裂模式為HCD，碎片離子在Orbitrap中進(jìn)行檢測(cè)。動(dòng)態(tài)排除時(shí)間設(shè)定為30 s。AGC設(shè)置為：一級(jí)3E6，二級(jí)1E5。

1.3 生物信息學(xué)統(tǒng)計(jì)

原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)經(jīng)過相應(yīng)工具轉(zhuǎn)換成mgf格式文件后，用蛋白質(zhì)鑒定軟件Mascot2.3.02比對(duì)相應(yīng)數(shù)據(jù)庫(kù)搜索鑒定。質(zhì)控分析同時(shí)進(jìn)行以判斷本次數(shù)據(jù)是否合格。數(shù)據(jù)合格后經(jīng)過一定的篩選閾值，得到最終可信的蛋白質(zhì)鑒定結(jié)果。隨后進(jìn)行iTRAQ定量分析，從定量結(jié)果中篩選出顯著差異蛋白。然后進(jìn)行GO、Pathway、COG/KOG等功能注釋和差異蛋白的GO、Pathway富集分析、COG/KOG功能注釋、聚類分析，蛋白互作分析（PPI）、亞細(xì)胞定位分析。

1.4 熒光定量PCR

采用SYBR green Ⅱ預(yù)混液于熒光定量PCR 儀上進(jìn)行測(cè)定。GAPDH 基因作為內(nèi)對(duì)照?；蛞镄蛄幸浴癗CBInr Accession”為條目在PrimerBank上進(jìn)行檢索得到（表1）。

表1 PCR引物序列Tab.1 PCR primer sequence

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用IBM SPSS Statistics 25統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，計(jì)數(shù)資料用例（百分?jǐn)?shù)）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，采用Fisher精確性檢驗(yàn)單個(gè)條目富集程度的顯著性水平。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 病理切片

共有22例樣本進(jìn)行病理檢查，根據(jù)病理結(jié)果嚴(yán)格篩選具有典型病理表現(xiàn)的樣本，其中NASH樣本中可見明顯脂滴、氣球樣變、炎癥，NAS評(píng)分≥5。共篩選出正常對(duì)照樣本3例及NASH樣本3例（表2、圖1）。

圖1 人源肝臟組織病理切片F(xiàn)ig.1 Histopathological examination of the liver tissue specimens (HE staining).A:Control group(Original magnification:×100).B:Control group(×200).C:Case group(×100).D:Case group(×200).

表2 臨床標(biāo)本基本信息Tab.2 Basic information of clinical specimens

2.2 蛋白質(zhì)樣本質(zhì)檢

兩組肝臟標(biāo)本經(jīng)裂解后獲得蛋白質(zhì)樣本，Bradford定量法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，蛋白總量c≥300 μg，蛋白總量滿足3次或者3次以上實(shí)驗(yàn)需求的樣品。取一定量蛋白質(zhì)樣本進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳顯示膠圖完整，重復(fù)性高，高豐度蛋白含量低，為一等標(biāo)本（圖2）。

圖2 聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果Fig.2 Results of polyacrylamide gel electrophoresis.Lanes 1-3:NASH group;Lanes 4-6:Control group;Lane 7:Second-class control sample.

2.3 差異蛋白

按照單次實(shí)驗(yàn)的顯著差異倍數(shù)（>1.2或<0.83）且P<0.05共篩選出648個(gè)差異蛋白，其中246個(gè)上調(diào)蛋白，402個(gè)下調(diào)蛋白（圖3）。調(diào)整差異倍數(shù)Foldchange>2.0且Foldchange<0.5 和Q value/Pvalue<0.05 篩選出25個(gè)顯著差異表達(dá)蛋白如表3所示。

圖3 差異蛋白火山圖Fig.3 Volcano plot of the differential proteins.The X-axis is the fold difference of the proteins (log2),and the Y-axis the corresponding-log10 (Q value).The red points are significantly up-regulated proteins,the green points are significantly down-regulated proteins,and the gray points are proteins that have no significant changes.

2.4 差異蛋白GO富集分析及KEGG通路富集分析

GO功能富集分析結(jié)果顯示，差異表達(dá)蛋白主要參與小分子代謝（32.35%）、有機(jī)酸代謝（20.96%）、含氧酸代謝（20.59%）等生物學(xué)過程，在代謝途徑（27.65%）、補(bǔ)體凝血級(jí)聯(lián)（7.78%）、核糖體（7.78%）等KEGG通路上富集（圖4）。

圖4 差異蛋白的Pathway富集分析Fig.4 Pathway enrichment analysis of the differential proteins.

2.4 熒光定量PCR結(jié)果

熒光定量PCR對(duì)差異倍數(shù)（>2.0或<0.5）且P<0.05的25個(gè)顯著差異表達(dá)蛋白進(jìn)行篩選，共有6個(gè)蛋白與蛋白組學(xué)的結(jié)果趨勢(shì)一致，包括5個(gè)下調(diào)蛋白，Jumonji 蛋白（JARID2）萊伯西林樣蛋白（LCA5L）、突觸素1（SYN1）及膠原α-1（XIII）鏈（COL13A1）、FYVE，Rho-GEF 和PH 結(jié)構(gòu)域蛋白5（FGD5）、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶Mu 4（GSTM4），1個(gè)上調(diào)蛋白GSTM4。

3 討論

NASH是非酒精性脂肪性肝病中的重要環(huán)節(jié)，而尋找NASH發(fā)病理機(jī)制的關(guān)鍵靶點(diǎn)一直是臨床和科研尚未解決的問題。眾多研究通過人體血液樣本進(jìn)行蛋白組學(xué)篩選差異蛋白，但血液中蛋白種類豐富，易受高豐度蛋白影響，而用小鼠肝臟或血液樣本，會(huì)遇到高脂飲食造模小鼠飲食結(jié)構(gòu)、遺傳背景的不同造成組織差異性，其得到結(jié)果難免導(dǎo)致偏差。本研究根據(jù)病理檢查NAS評(píng)分篩選入組標(biāo)本，使其結(jié)果更可靠。

用iTRAQ技術(shù)標(biāo)記人源肝臟蛋白，通過生物信息學(xué)技術(shù)分析，按照單次實(shí)驗(yàn)的顯著差異倍數(shù)（>1.2 或<0.83）且P<0.05共篩選出648個(gè)差異蛋白，其中246個(gè)上調(diào)蛋白，402個(gè)下調(diào)蛋白，主要參與小分子代謝、有機(jī)酸代謝、含氧酸代謝等生物學(xué)過程，在代謝途徑、補(bǔ)體凝血級(jí)聯(lián)、核糖體等KEGG 通路上富集。從NAFL 到NASH過程中，肝臟受到炎癥因子的刺激，從而引發(fā)肝臟損害，出現(xiàn)肝細(xì)胞壞死過程。肝臟炎癥的誘因可能來自肝臟之外，如內(nèi)毒素以及脂肪組織誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的C-C基型趨化因子2（CCL2）和TNF等。也可能來自器官內(nèi)部，脂肪毒性、先天免疫反應(yīng)、細(xì)胞死亡途徑、線粒體功能障礙和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激［15,16］。本次研究中GO富集分析中發(fā)現(xiàn)其在代謝過程中出現(xiàn)脂肪組織炎癥、脂肪因子及膽汁酸刺激，是引起肝臟炎癥反應(yīng)的主要原因。編碼補(bǔ)體C1q腫瘤壞死因子相關(guān)蛋白2（C1QTNF2）在本次發(fā)現(xiàn)中為顯著上調(diào)的差異蛋白，與脂聯(lián)素的作用極為相似，是一種在肝臟中具有代謝作用的分泌型脂肪細(xì)胞因子，還有研究表明C1QTNF2是芹菜素抗纖維化活性的潛在介體，在以星狀細(xì)胞為靶點(diǎn)的抗纖維化藥物中再次利用［17］。C1QTNF2抗纖維化作用得到證實(shí)，可以推測(cè)C1QTNF2在NASH中同時(shí)具備抗纖維化抗炎作用，這對(duì)NASH 的治療靶點(diǎn)具有重要意義，而該蛋白在NASH中并無研究。另外，本次研究發(fā)現(xiàn)的膽鹽活化脂肪酶（CEL）、溶質(zhì)載體有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族成員1B1（SLCO1B1）、酰基輔酶A合成酶（SLC27A5），磷脂酰膽堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（ABCB4）與膽汁酸代謝相關(guān)，既往研究表明BAs 通過farnesoid X 活化受體和G 蛋白偶聯(lián)BA受體1（TGR5）對(duì)脂質(zhì)和碳水化合物代謝具有重要的調(diào)節(jié)作用，如果失調(diào)，會(huì)導(dǎo)致糖和脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)的改變，并促進(jìn)炎癥和纖維化，這些BAs同樣為本次研究的顯著差異蛋白，其發(fā)揮作用的方式值得進(jìn)一步探索。

圖5 差異蛋白qPCR結(jié)果Fig.5 qPCR results of the differential proteins.*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001 vs control.

通過蛋白層面及基因?qū)用婀餐Y選出顯著差異表達(dá)蛋白有5個(gè)下調(diào)蛋白，Jumonji 蛋白（JARID2）、萊伯西林樣蛋白（LCA5L）、突觸素1（SYN1）及膠原α-1（XIII）鏈（COL13A1）、FYVE，RhoGEF和PH結(jié)構(gòu)域蛋白5（FGD5），以及1個(gè)上調(diào)蛋白谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶Mu 4（GSTM4）。

Jumonji 蛋白（JARID2）為組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物的調(diào)節(jié)劑，有研究表明H3K9me3和H3K4me3對(duì)肝細(xì)胞表觀遺傳學(xué)的調(diào)節(jié)可能參與肝臟脂肪變性和NAFLD的發(fā)病機(jī)制［18,19］。該研究在DNA微陣列和芯片上檢查肝臟轉(zhuǎn)錄組圖譜和三甲基化改變，發(fā)現(xiàn)肝臟脂肪積聚誘導(dǎo)過氧化物酶體增殖物激活受體α和肝臟脂肪分解網(wǎng)絡(luò)基因H3K9me3 和H3K4me3 處于異常狀態(tài)，使其mRNA表達(dá)較未處理的對(duì)照肝細(xì)胞降低，結(jié)果與本研究一致。JARID2作為顯著下調(diào)蛋白，有可能參與NASH的炎癥發(fā)生，值得進(jìn)一步研究。萊伯西林樣蛋白（LCA5L）相關(guān)研究很少，對(duì)其功能并不清楚。越來越多的研究表明高脂肪飲食誘導(dǎo)的肥胖會(huì)影響突觸素1（SYN1）從而影響大腦的可塑性和認(rèn)知功能［20,21］。在以突觸素1(SYN1)-CRE驅(qū)動(dòng)程序建立的一個(gè)在所有神經(jīng)元中GHSR基因缺失的小鼠系［22］中發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)元GHSR缺失通過調(diào)節(jié)能量消耗來阻止了食物誘導(dǎo)的肥胖，由此可見突觸素1與高脂飲食的攝入密切相關(guān)。膠原α-1（XIII）鏈（COL13A1）在一項(xiàng)全基因組關(guān)聯(lián)研究［23］中發(fā)現(xiàn)COL13A1中的變異SNP與高甘油三酸酯相關(guān)，且墨西哥的研究［24］中同樣得出COL13A1 rs1227756基因變異與混合血統(tǒng)的墨西哥成年人中NAFLD/ALT水平升高的風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān)。而該基因的作用在一項(xiàng)中國(guó)兒童的研究［25］中未發(fā)現(xiàn)，但在本次研究中標(biāo)本來源均為成人，其研究結(jié)果可為COL13A1在成人非酒精性脂肪肝中的作用進(jìn)行有力補(bǔ)充。FYVE，RhoGEF和PH域包含5（FGD5）是一種蛋白質(zhì)編碼基因，以往研究發(fā)現(xiàn)FGD5與心臟病變［26］和乳房疾?。?7］密切相關(guān)，可在新血管的形成時(shí)進(jìn)行血管修剪，有助于組織修復(fù)過程中的器官發(fā)育，以應(yīng)對(duì)機(jī)械損傷、炎癥和缺血［28］。NASH的發(fā)生也與炎性因子的釋放誘導(dǎo)了炎癥的許多信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)有關(guān)［29］，并且血管生成已被證明在慢性肝病的進(jìn)展中起著重要作用［30］，F(xiàn)GD5 在NASH 中的表達(dá)是正常組織的0.49倍，可推測(cè)FGD5也參與NASH發(fā)生的炎癥反應(yīng)。谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶Mu 類為基因編碼II 期代謝酶，GSTM基因中的遺傳多態(tài)性與人群的疾病表型相關(guān)，有研究表明與高加索人NASH患者相比，非洲裔NASH患者GSTM4基因過度表達(dá)［31］。GSTM4在抗氧化和解毒方面有重要作用，與肝臟關(guān)系極大，并且在組織和血清中均能夠被檢測(cè)，是對(duì)疾病進(jìn)行預(yù)后隨訪良好的生物標(biāo)記物。

綜上所述，本研究通過同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量的蛋白質(zhì)組學(xué)研究篩選出648個(gè)顯著差異蛋白,主要參與小分子代謝、有機(jī)酸代謝、含氧酸代謝等生物學(xué)過程，在代謝途徑、補(bǔ)體凝血級(jí)聯(lián)、核糖體等KEGG通路上富集，其中顯著差異蛋白：JARID2、SYN1、COL13A1、FGD5、GSTM4可作為關(guān)鍵靶向蛋白。但是本研究樣本量較少，僅對(duì)肝臟中所檢測(cè)到的差異蛋白進(jìn)行初步篩選，后續(xù)將擴(kuò)大樣本量在活檢組織標(biāo)本中進(jìn)一步證實(shí)。