周立強，吳 憂，辛林

南昌大學第二附屬醫(yī)院胃腸外科，江西 南昌330006

胃癌發(fā)病率在所有惡性腫瘤中排名第5，死亡率在癌癥相關死亡中居第4位［1］。中國是胃癌的高發(fā)地區(qū)，2020 年中國胃癌新發(fā)病例和死亡病例分別占全球62.3%和51.4%［1］。胃癌臨床表現(xiàn)無顯著特異性，與非惡性消化道疾病表現(xiàn)類似，起病隱匿、進展迅速、早診困難，確診時多處于中晚期，使多數(shù)病例失去了最佳手術時機［2］。目前國內(nèi)外研究證實胃癌的病因包括幽門螺桿菌感染、不良飲食習慣、非甾體藥物等，但胃癌發(fā)生發(fā)展的分子生物學機制尚未明確［3］。若能在排除個體差異的基礎上發(fā)掘重要的生物標志物，將有助于胃癌的早期診斷和治療。

ELK3（又稱Net、SAP-2 或ERP）是ETS 轉錄因子家族成員之一，定位于染色體12q23.1上。ELK3蛋白常與血清反應輔助蛋白1一起形成三元復合轉錄因子，其能結合富含嘌呤GGA核心序列的特定DNA序列，調(diào)節(jié)包括原癌基因在內(nèi)的多種基因的表達［4］。在基礎條件下，ELK3是轉錄阻遏物，但卻可被RAS/ERK信號和絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）途徑激活而轉變?yōu)檗D錄激活因子［5,6］。ELK3被證實在乳腺癌、肝癌、肺癌等惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，并被認為是有效的生物標志物［7-11］。在胃癌中，目前尚無實驗研究ELK3在腫瘤中發(fā)揮的作用。在本研究中，我們利用多種生物信息學的手段探索ELK3在胃癌中的表達特征及其影響胃癌進展的機制，這有助于ELK3 后續(xù)研究提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 ELK3的表達特征

從ArrayExpress 數(shù)據(jù)庫（www.ebi.ac.uk/arrayexpress/）下載E-MTAB-6693數(shù)據(jù)集，并收集與之相關的臨床病理信息。首先利用非配對t檢驗分析ELK3在正常胃組織和胃癌組織臨床病理特征間的表達差異。再利用受試者工作特征曲線（ROC）分析ELK3預測胃癌的敏感度，計算最大約登指數(shù)（Youden index），確定最佳臨界點，據(jù)此將ELK3分為高、低表達組，用卡方檢驗分析ELK3的表達水平與臨床病理特征之間的關系。

1.2 ELK3的預后能力

繪制Kaplan-Meier曲線分析ELK3高低表達組之間總體生存率和無病生存率之間的差異。通過計算ROC曲線下面積（AUC）分析ELK3預后的準確性。通過單因素和多因素Cox回歸分析排除其他臨床性狀的條件，確定ELK3是否為胃癌的獨立預后因素。

1.3 ELK3轉錄調(diào)控網(wǎng)絡的構建

為分析ELK3的靶基因，我們利用Chip-Atlas數(shù)據(jù)庫（http://chip-atlas.org/）［12］、ChipBase數(shù)據(jù)庫（http://rna.sysu.edu.cn/chipbase/index.php）［13］、基因轉錄調(diào)控數(shù)據(jù)庫（GTRD，http://gtrd.biouml.org/）［14］在轉錄起始位點上下游5000bp 內(nèi)鑒別ELK3 可能調(diào)控的基因。此外，在hTFtarget 數(shù)據(jù)庫（http://bioinfo.life.hust.edu.cn/hTFtarget#!/）［15］的Epigenomic evidence、Chip-seq support和Motif support條件下篩選ELK3的調(diào)控基因。利用Draw Venn Diagram 工具（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）取4 個數(shù)據(jù)庫的交集獲得ELK3轉錄調(diào)控靶基因，進一步利用Cytoscape 3.8.1繪制最終得到的轉錄調(diào)控網(wǎng)絡。

1.4 基因本體論和京都基因與基因組百科全書富集分析ELK3影響胃癌機制

我們利用“org.Hs.eg.db”R 包進行富集分析，將濾過條件設置為P<0.05 和FDR<0.05，獲得的條目使用“enrichplot”和“ggplot2”R包進行可視化。

1.5 ELK3和浸潤性免疫細胞的關系

使用cibersort工具計算免疫細胞的相對分數(shù)［16］，將數(shù)據(jù)上傳到cibersort Web網(wǎng)絡工具，設置默認特征矩陣為1000個排列，以計算每個樣品中22種浸潤性免疫細胞（包括B細胞、T細胞、自然殺傷細胞、巨噬細胞、樹突細胞、嗜酸性粒細胞和中性粒細胞）的比例，并分析ELK3的表達與它們的關系，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

1.6 公共數(shù)據(jù)庫驗證ELK3的表達

通過基因表達譜分析（GEPIA）網(wǎng)絡工具（http://gepia.cancer-pku.cn/），分析結合基因型組織表達數(shù)據(jù)庫和癌癥基因組圖譜數(shù)據(jù)庫中ELK3在胃癌和正常胃組織的表達差異。為驗證ELK3蛋白的表達水平，我們通過人類蛋白圖譜（HPA）數(shù)據(jù)庫（www.proteinatlas.org/），搜索ELK3 在正常胃和胃癌組織的免疫組化數(shù)據(jù)，分析其差異。

1.7 熒光定量RCR檢測胃癌中ELK3的mRNA表達

收集5組南昌大學第二附屬醫(yī)院胃腸外科手術標本，樣本獲取均取得患者知情同意并得到南昌大學第二附屬醫(yī)院倫理委員會批準。制備樣品勻漿，使用Trizol（Thermo Fisher）法提取總RNA，獲得的RNA使用逆轉錄試劑盒RR047A（Takara）進行逆轉錄，以ACTB作為內(nèi)參基因，使用RR820試劑盒（Takara）在7900-HT系統(tǒng)（Thermo Fisher）進行熒光定量PCR，通過計算ELK3的2-ΔCT值評估其mRNA表達，使用配對t檢驗分析胃癌及癌旁樣本ELK3的表達差異。使用的引物均由上海生工公司合成，序列如下：ACTB上游5'-CACCATTGGC AATGAGCGGTTC-3'，下游5'-AGGTCTT TGCGGAT GTCCACGT-3'；ELK3 上游5'-GAGAGTGCAATCAC GCTGTG-3'，下游5'-GTTCGAGGTCCAGCAGATCA A-3'。

1.8 蛋白印記法檢測胃癌中ELK3的蛋白表達

將獲得樣本勻漿后，使用強效RIPA 裂解液（北京索萊寶公司）提取總蛋白，BCA試劑盒（上海碧云天公司）檢測蛋白質(zhì)濃度后進行SDS-PAGE凝膠電泳，然后將蛋白轉至PVDF 膜（Millipore）上。使用含5%脫脂奶粉的TBST封閉液在室溫下封閉1 h。將內(nèi)參和目的條帶分離后，分別置于到ELK3（Santa Cruz）和GAPDH（Proteintech）一抗中4 ℃孵育過夜，吸凈一抗并清洗后，加入HRP 標記的山羊抗兔IgG 和山羊抗鼠IgG 二抗（北京康為世紀公司）稀釋比例為1∶10 000，室溫孵育1 h，吸凈二抗并清洗。用超敏ECL發(fā)光試劑盒（蘇州宇恒公司）和化學發(fā)光成像系統(tǒng)（BioRad）進行曝光分析。

2 結果

2.1 ELK3高表達與胃癌進展相關

E-MTAB-6693數(shù)據(jù)集包括46例正常胃組織和691例胃癌組織數(shù)據(jù)。分析顯示，ELK3在胃癌中表達顯著高于正常胃組織（P<0.01，圖1A）。繪制ROC曲線并計算AUC值為0.6322，顯示ELK3預測胃癌具有較良好的敏感性（圖1B）。根據(jù)計算出最大約登指數(shù)（0.2328）所對應的ELK3 表達水平（7.1670），將胃癌樣本分為ELK3高表達組（n=470）和低表達組（n=221）。ELK3在不同臨床病理特征胃癌組織中的表達分析顯示，M1 期ELK3 表達高于M0期（P<0.05，圖1C），ELK3的表達隨AJCCstage分期進展而升高（P<0.05，圖1D）；在神經(jīng)侵襲的樣本中ELK3表達高于未侵襲樣本（P<0.01，圖1E）。我們還分析了ELK3表達與不同臨床病理特征的關系，結果顯示，ELK3的表達水平與N分期、AJCC分期、Lauren分型、分化程度、病理分型、微衛(wèi)星狀態(tài)相關（P<0.05，表1）。

表1 胃癌中ELK3表達與各臨床病理特征的關系Tab.1 Relationship between ELK3 expression and clinicopathological characteristics of gastric cancer

圖1 ELK3在胃癌中的表達特征Fig.1 Expression characteristics of ELK3 in gastric cancer.A:ELK3 expression in gastric cancer is higher than normal gastric tissue.B:ROC curve shows that ELK3 can predict the occurrence of gastric cancer.C:The expression of ELK3 in M1 stage was higher than that in M0 stage.Values are presented as Mean±SD(*P<0.05 vs M0).D:The expression of ELK3 increases with pathological stages.Values are presented as Mean±SD(*P<0.05,**P<0.01 vs Stage I).E:Patients with Perineural invasion have higher expression of ELK3.Values are presented as Mean±SD(**P<0.01 vs No).

2.2 ELK3高表達與胃癌患者不良預后相關

Kaplan-Meier曲線顯示，ELK3高表達組患者的生存率較低表達組顯著降低（P<0.01，圖2A），與3年、5年、7 年總生存率對應的AUC 為0.556、0.555、0.571（圖2B）。通過單因素和多因素Cox回歸分析，最終確定神經(jīng)侵襲[HR=1.756，95%CI（1.057-2.915），P=0.030]、陽性淋巴結數(shù)目[HR=1.059，95%CI（1.023-1.097），P=0.001]、ELK3 表達[HR=1.929，95%CI（1.039-3.580），P=0.037]為獨立預測胃癌總體預后的因素（圖2C，D）。對于無病生存期，Kaplan-Meier曲線顯示（圖3A）ELK3高表達組患者的生存率較低表達組顯著降低（P<0.05）。ROC曲線顯示，與3年、5年、7年總生存率對應的AUC為0.549、0.577、0.619（圖3B）。通過單因素和多因素Cox回歸分析，靜脈侵襲[HR=1.830，95%CI（1.014-3.305），P=0.045]和ELK3 表達[HR=2.555，95%CI（1.332-4.902），P=0.037]為獨立預測無病生存期的因素（圖3C、D）。

圖2 ELK3預測總體預后且為獨立預后因素Fig.2 ELK3 predicts overall prognosis and is an independent prognostic factor of gastric cancer.A:Kaplan-Meier curve shows that a high expression of ELK3 is associated with a poor overall prognosis.B:ROC curve analysis of the ability of ELK3 to predict 3-,5-,and 7-year survival.C:Univariate Cox regression analysis.D:Multivariate Cox regression analysis shows that ELK3 is an independent prognostic factor of gastric cancer.

2.3 ELK3轉錄調(diào)控網(wǎng)絡及其影響胃癌機制

Chip-Atlas數(shù)據(jù)庫顯示，ELK3潛在靶基因有3536個，ChipBase中得到11 166個，GTRD中獲得27 740個，hTFtarget中有600個。通過繪制韋恩圖提取4個數(shù)據(jù)庫中共有基因（圖4A），一共獲得176個ELK3潛在的靶基因，并繪制了ELK3轉錄調(diào)控網(wǎng)絡（圖4B）。進一步利用GO 和KEGG 富集分析ELK3 在胃癌中發(fā)揮的功能。我們將GO富集Top10進行了可視化（圖5A），其中BP富集在RNA剪接、GTP酶活性調(diào)控等條目，CC富集在黏附連接、細胞間黏附等條目，MF集在GTP酶活化、GTP酶結合等條目。KEGG功能富集在胰島素、雌激素、Ras 相關蛋白1（Rap1）、AMP 依賴的蛋白激酶(AMPK）、松弛素、神經(jīng)營養(yǎng)因子、趨化因子、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、腫瘤壞死因子（TNF）信號相關；值得注意的是，ELK3靶基因還富集在多種病毒感染和腫瘤的細胞程序性死亡配體-1/程序性死亡受體1（PD-L1/PD-1）信號，顯示ELK3可能參與腫瘤的免疫應答反應調(diào)控（圖5B）。

圖4 ELK3轉錄調(diào)控網(wǎng)絡的構建Fig.4 Construction of ELK3 transcriptional regulation network.A:Venn diagram analysis showing 176 potential target genes of ELK3.B:ELK3 transcriptional regulation network.

2.4 ELK3與浸潤性免疫細胞的關系

為了解ELK3在免疫應答反應中的可能作用，我們分析了691例胃癌樣本中的浸潤性免疫細胞分布，并分析ELK3表達和22種免疫細胞的關系。結果顯示，ELK3表達與漿細胞（R=-0.260，P<0.001）、靜息NK細胞（R=-0.180，P<0.001）、調(diào)節(jié)性T 細胞（R=-0.180，P<0.001）、活化樹突狀細胞（R=-0.110，P<0.01）、濾泡輔助性T 細胞（R=-0.150，P<0.001）和CD8+T細胞（R=-0.085，P<0.05）的數(shù)量呈負相關，ELK3 與M2 型巨噬細胞（R=0.100，P<0.01）、幼稚B細胞（R=0.130，P<0.001）、M1型巨噬細胞（R=0.083，P<0.05）、活化CD4+記憶T細胞（R=0.099，P<0.01）、γδT細胞（R=0.260，P<0.001）及幼稚CD4+T細胞（R=0.085，P<0.05）的數(shù)量呈正相關（圖6）。

圖6 ELK3與浸潤性免疫細胞的相關性Fig.6 Correlation between ELK3 and infiltrating immune cells in gastric cancer.

2.5 ELK3的表達驗證

在公共數(shù)據(jù)庫中驗證ELK3的表達，GEPIA表明，在211個正常胃組織中ELK3的mRNA表達水平顯著低于408個胃癌組織（圖7A）；HPA數(shù)據(jù)庫顯示，正常胃組織免疫組化染色顯示為未檢測到，而胃癌組織種顯示低染色（圖7B）。隨機分析5個配對臨床手術樣本mRNA表達，結果表明，5對組織中ELK3在胃癌組織的表達均顯著高于正常胃黏膜組織（圖7C）。免疫蛋白質(zhì)印記結果也顯示，胃癌組織ELK3蛋白表達高于對于正常組織（圖7D）。

圖7 公共數(shù)據(jù)庫和臨床樣本中驗證ELK3在胃癌中高表達Fig.7 Verification of high ELK3 expression in gastric cancer based on public databases and clinical samples.A:Analysis of GEPIA showing that the RNA level of ELK3 in gastric cancer tissue is increased.B:Analysis of HPA database showing that the protein expression of ELK3 is up-regulated in gastric cancer.C:ELK3 mRNA expression is increased in clinical samples of gastric cancer detected using RT-PCR.D:Western blotting results showing increased ELK3 protein expression in gastric cancer.Values are presented as Mean±SD(*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001 vs normal).

3 討論

ELK3在一些實體腫瘤中過表達，并在腫瘤細胞增殖、凋亡、侵襲、遷移和耐藥等生物過程中發(fā)揮重要作用［8-10,17,18］。有報道顯示ELK3在腫瘤中的低表達可抑制腫瘤細胞的進展［19］。這提示，由于腫瘤的異質(zhì)性和遺傳多樣性，ELK3在不同類型的腫瘤和微環(huán)境中的表達可能產(chǎn)生不同的功能。為分析ELK3在胃癌中扮演的角色，我們通過對公共數(shù)據(jù)集的分析和臨床樣本檢測證實了ELK3在胃癌組織中上調(diào)。此外，ELK3隨著胃癌進展表達升高，其表達水平與N 分期、AJCC 分期、Lauren分型、分化程度、病理分型等密切相關。我們還發(fā)現(xiàn)ELK3表達與不良總體預后高度相關。一些對其他實體腫瘤的相關研究也證實了我們的結論，研究顯示，ELK3可以促進膀胱癌、黑色素瘤的進展［20,21］。此外，ELK3還可以促進轉化生長因子-β1（TGF-β1）誘導的腫瘤轉移［22］；在三陰性乳腺癌中敲低ELK3，TGF-β信號轉導活性下降，腫瘤轉移能力和上皮間質(zhì)轉化表型減弱［23］。ELK3與腫瘤化療耐藥存在密切聯(lián)系，它可以通過磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白信號誘導自噬促進腫瘤化療耐藥［18］。對結直腸癌的相關研究表明，ELK3表達的升高與腫瘤化療耐藥性密切相關，下調(diào)其表達可以提高化療敏感性［24］。根據(jù)以上結果我們可以認為，ELK3在胃癌中充當癌基因，是治療胃癌良好的生物標志物。

為了解ELK3在腫瘤中發(fā)揮功能，我們基于多個數(shù)據(jù)庫鑒定ELK3轉錄調(diào)控靶基因，構建ELK3的轉錄調(diào)控網(wǎng)絡，并對靶基因進行GO和KEGG功能富集分析。GO主要富集在RNA剪接、GTP酶活性調(diào)控、GTP酶結合、細胞間黏附等相關。KEGG則富集在Rap1、AMPK、VEGF、TNF等信號相關通路。Rap1是小型GTPases的Ras家族的成員，在許多細胞類型中均受到多種細胞外刺激的激活。最近，大量證據(jù)表明，Rap1激活失調(diào)是導致惡性腫瘤發(fā)展的原因［25］。AMPK是與能量代謝密切的一種高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白，在能量調(diào)節(jié)代謝作用方面起到關鍵性作用［26］。近年來發(fā)現(xiàn)AMPK激活可以磷酸化一些關鍵的代謝酶或激活轉錄因子調(diào)節(jié)下游基因表達，干擾腫瘤的物質(zhì)和能量代謝，間接影響腫瘤細胞的生物學行為［27］。在腫瘤細胞中VEGF是一類重要的促進血管生成的生長因子，通常響應于通過低氧誘導因子-1α途徑增加的腫瘤缺氧［28］。VEGF可以影響腫瘤微環(huán)境中免疫細胞的功能，參與腫瘤免疫逃避［29］。TNF是一種促炎性細胞因子，在哺乳動物免疫和細胞體內(nèi)平衡中具有重要作用，作為一種內(nèi)源性致熱原，它能夠引起細胞凋亡，誘導進一步的TNF 表達，促進惡性細胞產(chǎn)生其他細胞因子、趨化因子和C-X-C趨化因子受體4。這些趨化因子可能作用于淋巴細胞，導致局部免疫抑制，增強原發(fā)腫瘤生長并促進轉移擴散，調(diào)節(jié)白細胞浸潤和血管生成的程度和表型［30］。

我們還發(fā)現(xiàn)ELK3與腫瘤PD-1/PD-L1信號相關。PD-1是重要的免疫檢查點，通過與其兩個配體PD-L1和PD-L2的作用抑制T細胞的活化及細胞因子的產(chǎn)生，在維持機體的外周耐受上發(fā)揮至關重要的作用。腫瘤細胞及微環(huán)境通過上調(diào)PD-L1 表達并與腫瘤特異的CD8+T細胞表面的PD-1結合，限制宿主的免疫反應［31］。我們分析了胃癌中免疫細胞的比例，并發(fā)現(xiàn)ELK3的表達與調(diào)節(jié)T細胞、濾泡輔助性T細胞、CD8+T細胞的數(shù)量呈負相關，提示了ELK3可能參與免疫逃避。

本研究利用公共數(shù)據(jù)驗證了ELK3在胃癌中高表達，并使用臨床樣本進一步驗證ELK3高表達與腫瘤進展和不良預后密切相關。通過預測ELK3的靶基因并進行富集分析，結果表明它在腫瘤進展密切相關的機制中發(fā)揮作用。目前尚未有報道確定ELK3是否通過以上途徑影響胃癌的進展，還需要更深入的研究。