尹鈺涵，劉 迪，2**，陳功鑫，王 璐，王 皓，滕成龍，郭建峰，王楚航

[1.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002；2.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，食（藥）用真菌研究所，吉林 延吉 133002]

樺褐孔菌[Inonotus obliquus（Ach.Ex Pers.）Pilát]是一種較為罕見的天然食（藥） 用真菌，屬菌物界（Fungi）擔(dān)子菌門（Basidiomycota）傘菌綱（Agaricomycetes） 銹革孔菌目（Hymenochaetales） 銹革孔菌科（Hymenochaetaceae）[1-2]。早在16世紀(jì)至17世紀(jì)，俄羅斯人就發(fā)現(xiàn)服用樺褐孔菌具有保健的功效，研究表明樺褐孔菌中有著豐富的藥用成分，如樺褐孔菌醇、多糖、三萜類、黃酮類、黑色素、丁香酸、木脂素類、葉酸衍生物等，具有降血糖、抗腫瘤、抗氧化、降血脂、抗衰老、調(diào)節(jié)免疫力等藥理作用[3-8]。其中，樺褐孔菌中多糖是公認(rèn)的有效的降糖成分之一[9]，同時其能夠清除活性氧自由基，起到抗氧化的作用[6]；樺褐孔菌醇能夠抑制α-葡萄糖苷酶活性，以及降低高脂血癥大鼠血清總膽固醇、高三酰甘油水平[10]。紫外輻射誘變育種技術(shù)主要是通過引起DNA分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而引發(fā)菌株變異的一種簡單、有效的育種技術(shù)之一。目前，已有利用紫外線育種其他食用菌的相關(guān)報道[11-12]，但利用紫外線進(jìn)行樺褐孔菌育種鮮為少見。國內(nèi)野生樺褐孔菌生長非常緩慢，資源較為匱乏，價格逐漸上漲，因此通過人工培育高活性成分產(chǎn)量的樺褐孔菌十分必要。通過對樺褐孔菌菌株進(jìn)行紫外線輻射的誘變處理，通過拮抗試驗及ITS序列分析對誘變菌株進(jìn)行初步鑒定，并對其活性成分進(jìn)行比較，以確定誘變菌株高產(chǎn)活性成分，為其生產(chǎn)育種提供理論依據(jù)。

1 試驗材料

1.1 供試菌株

樺褐孔菌原菌株JL01、紫外線誘變菌株HZ1、樺褐孔菌原菌株菌核HE（由菌株JL01栽培獲得），均保存于延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院食（藥）用真菌研究所。

1.2 試劑及儀器

NuClean Plant Genomic DNA Kit試劑盒，北京康為世紀(jì)公司；Agarose瓊脂糖，Biowest公司；2xTaq PCR MasterMix、D2000型 DNA Marker等，TaKaRa Bio公司；通用引物ITS1、ITS4，福林酚顯色劑，無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%，批號SG8510），北京寶萊科技有限公司；蘆丁（純度≥98%，批號Y10549），北京百奧萊博科技有限公司；沒食子酸（純度≥98%，批號B20851）、齊墩果酸（純度≥98%，批號B20954），上海源葉生物科技有限公司；其他試驗試劑均為分析純；試驗用水采用娃哈哈純凈水。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：去皮馬鈴薯200 g（蒸餾水煮沸，經(jīng)4層紗布過濾）、葡萄糖20 g、瓊脂20 g，加水定容至1 000 mL，121℃高壓滅菌20 min。

BioDoc-It220型凝膠成像系統(tǒng)，美國UVP；Hitachi高速冷凍離心機(jī)，日本日立；T100型梯度PCR儀，美國伯樂；HVE-85型立式壓力蒸汽滅菌器，日本HIRAYAMA；HF-I50A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，金壇恒豐儀器廠；FA11004A型電子天平，上海精天電子儀器有限公司；DK-42OS型電熱恒溫水浴鍋，上海精宏試驗設(shè)備有限公司；KQ-250B超聲波清洗器，昆山舒美超聲儀器有限公司；U-1800型紫外可見光分光光度計，日本日立。

1.3 樣品制備

在無菌條件下，將樺褐孔菌JL01、HZ1母種分別接種于PDA固體平板中，置于28℃的遮光恒溫培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)15 d，每組設(shè)置5個重復(fù)，每日觀察并記錄。待菌絲體長滿平板后用刀片刮取，避光保存于-80℃超低溫冰箱。

1.4 基于樺褐孔菌ITS序列的分子生物學(xué)鑒定

1.4.1 基因組DNA提取

取0.1 g菌絲體經(jīng)液氮研磨成粉末狀，按照Nu－Clean Plant Genomic DNA Kit試劑盒說明提取總DNA，-20℃保存。

1.4.2 分子學(xué)鑒定

利用真菌ITS通用引物ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’） 和 ITS4 （ 5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’），對 ITS1、ITS2 區(qū)及 5.8S rDNA序列進(jìn)行擴(kuò)增（引物由北京索萊寶科技有限公司合成）。PCR反應(yīng)在梯度PCR儀擴(kuò)增，其25 μL反應(yīng)體系中各成分體積見表1。

表1 PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系組分Tab.1 Components of PCR reaction system

擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性4 min，55.5℃退火1 min，72℃延伸4 min，進(jìn)行35個循環(huán)；72℃延伸5 min。產(chǎn)物于長春生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測序。通過NCBI數(shù)據(jù)庫中在線BLAST分析及DNA star軟件對測序獲得的ITS序列進(jìn)行分析。

1.5 樣品活性成分含量

將收集的菌株JL01和菌株HZ1培育的菌絲體及菌核（由菌株JL01栽培獲得），置于電熱恒溫干燥箱內(nèi)50℃烘至恒重，粉碎成粉末過40目篩。

1.5.1 多糖含量提取及測定

采用熱水浸提法，精密稱取干燥樺褐孔菌粉末0.5 g待測樣品置于試管中，加入15 mL蒸餾水置于83℃水浴鍋中提取3.4 h。過濾收集上清液，濃縮至5 mL，加入4倍濃縮液的95%乙醇溶劑，4℃靜置醇沉12 h。4 000 r·min-1離心10 min收集沉淀，烘干至恒重，加入4 mL蒸餾水復(fù)溶，溶液用于粗多糖含量測定。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液（100 μg·mL-1）：稱取0.1 g葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL燒杯中，加蒸餾水溶解，定容至1 000 mL，4℃保存，分別吸取0、0.20 mL、0.40 mL、0.60 mL、0.80 mL、1.00 mL的葡萄糖溶液于試管中，蒸餾水補(bǔ)至1.0 mL。分別加入1 mL的5%苯酚溶液，快速加入5 mL硫酸，靜置10 min，搖勻，將試管置于30℃水浴中反應(yīng)20 min，在490 nm紫外分光光度計下測定吸光度值。以葡萄糖質(zhì)量濃度（μg·mL-1）為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸方程為：

該線性回歸方程的R2為0.995。

1.5.2 黃酮含量提取及測定

采用超聲輔助浸提法，精密稱取0.5 g待測樣品置于試管中，按料液比1∶20加入50%乙醇溶液置于試管中，60℃超聲提取50 min，4 000 r·min-1離心20 min，回收上清液，50%乙醇定容，即得黃酮提取液。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液（200 μg·mL-1）：稱取0.01 g蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶于400 mL無水乙醇，得母液。分別吸取 0、1.00 mL、2.00 mL、3.00 mL、4.00 mL、5.00 mL母液，加入60%乙醇溶液5 mL，5%的NaNO2溶液 0.5 mL，搖勻靜置6 min，10%的 Al（NO3）3溶液0.5 mL，搖勻靜置6 min，4%的NaOH溶液4 mL，搖勻靜置20 min，將反應(yīng)液于紫外分光光度計510 nm波長下測量吸光度值。以蘆丁質(zhì)量濃度（μg·mL-1）為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸方程為：

該線性回歸方程R2為0.995 3。

1.5.3 多酚含量提取及測定

采用超聲輔助浸提法，精密稱取0.5 g待測樣品置于試管中，按料液比1∶40加入50%乙醇，于50℃溫度下超聲30 min，4 000 r·min-1離心20 min，回收上清液，50%乙醇定容，即得。

該線性回歸方程R2為0.992 4。

1.5.4 三萜含量提取及測定

采用超聲輔助浸提法，精密稱取0.5 g待測樣品置于試管中，按料液比1∶23加入異丙醇溶液，60℃下超聲提取22 min，4 000 r·min-1離心 20 min，定容，即得。

齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液（0.2 mg·mL-1）：稱取齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品0.01 g，加入甲醇溶液50 mL，得母液。分別吸取0、0.20 mL、0.40 mL、0.60 mL、0.80 mL、1.00 mL、1.20 mL母液，水浴揮盡溶劑，分別加入新鮮配制的5%香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL和0.8 mL的高氯酸，75℃水浴反應(yīng)15 min，冰水冷卻，搖勻，在550 nm波長下測定吸光度值，以齊墩果酸質(zhì)量濃度（mg·mL-1）為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制三萜標(biāo)準(zhǔn)曲線，齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸方程為：

該線性回歸方程R2為0.992 4。

1.6 數(shù)據(jù)處理

粗多糖、總黃酮、總多酚、三萜含量分別以葡萄糖、蘆丁、沒食子酸齊墩果酸含量（mg·g-1）表示；試驗過程中每組試驗設(shè)置3組平行，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。通過 SPSS 17.0、Graph Pad Prism 7.0、Excel軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析等處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌絲體生長差異比較分析

將樺褐孔菌菌株于PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)15 d，菌落形態(tài)見圖1。

研究［9］表明聯(lián)合固定方法具有明顯生物力學(xué)優(yōu)勢。Schliemann等［6］用鎖定板加單袢鋼板重建喙鎖韌帶技術(shù)治療鎖骨遠(yuǎn)端骨折14例，與健側(cè)相比，患肩平均Constant-Murley評分（93.5分vs 97.2分）和平均CCD（10.5mm vs 12mm）均無明顯差異，僅3例出現(xiàn)喙鎖韌帶鈣化，無內(nèi)固定失敗或切口感染、血腫等并發(fā)癥。Anderson等［8］報道20例鎖定板治療不穩(wěn)定型鎖骨遠(yuǎn)端骨折術(shù)中有9例需附加聚酯縫線、帶線錨釘或喙鎖螺釘，這些附加喙鎖固定者均達(dá)到骨愈合、無并發(fā)癥。Johnston等［10］甚至認(rèn)為該聯(lián)合固定方法能提供可靠的穩(wěn)定性及良好的骨愈合率，無需常規(guī)取出內(nèi)固定物。

如圖1所示，菌絲呈潔白色，較為濃密，菌絲生長由中心向外延伸；隨著培養(yǎng)時間增長，菌落逐漸產(chǎn)生褐色色素，由培養(yǎng)初期的白色變?yōu)闇\黃色至褐色，但菌落邊緣仍存在較少的白色菌絲體。

圖1 樺褐孔菌誘變菌株及原菌株菌落形態(tài)特征Fig.1 Colony morphological characteristics of Inonotus obliquus mutant strain and original strain

誘變菌株與同源菌株菌絲生長量比較見表2。

表2 誘變菌株與同源菌株菌絲生長情況比較Tab.2 Comparison of mycelial growth between mutant strain and homologous strain

由表2可知，紫外線照射誘變HZ1菌株菌絲體生長速度比菌株JL01略快，為2.974 mm·d-1，同時其菌絲干重相較菌株JL01增加0.058 g。

2.2 拮抗反應(yīng)

拮抗反應(yīng)是鑒定菌株間遺傳差異的簡單、便捷的方法，通過菌絲體之間相互抑制的反應(yīng)以顯示出菌株間不同的遺傳特性，菌株間拮抗作用越明顯其遺傳差異越大。依據(jù)NY/T 1845-2010食用菌菌種區(qū)別性鑒定拮抗反應(yīng)進(jìn)行試驗[13]，試驗結(jié)果見圖2。

圖2 樺褐孔菌菌株間的拮抗反應(yīng)Fig.2 Antagonistic response between Inonotus obliquus strains

如圖2所示，菌株HZ1與菌株JL01菌絲相接的區(qū)域均形成一條明顯的溝型拮抗線，因此可以認(rèn)為菌株HZ1、JL01為不同品種菌株。

2.3 ITS序列分析

通過對18S rDNA及28S rDNA的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)與已知序列進(jìn)行序列分析，ITS測序技術(shù)具有測序片段小、易于分析等特點，在真菌種屬的分類鑒定研究中被廣泛應(yīng)用。對2株試驗菌株提取DNA，以其為模板，ITS1及ITS4為引物，進(jìn)行 PCR擴(kuò)增獲得780 bp左右的特異性擴(kuò)增片段，將測序獲得的ITS序列通過NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行在線BLAST以及利用DNA star軟件對比分析。構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，見圖3。

圖3 供試菌株系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 phylogenetic tree of tested strains

如圖3所示，紫外誘變菌株HZ1及原菌株JL01與GenBank數(shù)據(jù)庫中的樺褐孔菌株的ITS序列相似度為99%以上，證明供試菌株為樺褐孔菌。

（G+C）含量能夠反映屬種間的親緣關(guān)系，其差異越小，說明菌株親緣關(guān)系越近。2株供試菌株的（G+C） 含量見表3。

表3 供試菌株ITS序列長度及（G+C）含量Tab.3 ITS sequence length and G+C content of tested strains

如表3所示，2株供試菌株的（G+C） 含量相接近；同時通過序列對比，菌株HZ1與菌株JL01的序列相似性為99.07%，因此可以確定紫外誘變菌株HZ1為JL01同源菌株。2個菌株的堿基片段比對分析見圖4。

由圖4可見，樺褐孔菌原菌株JL01中部分堿基發(fā)生置換，第37個堿基對C發(fā)生顛換為G堿基對，第43個堿基對A顛換為T堿基對，第292個堿基對由C顛換為A；相較于前部分在700 bp～783 bp之間堿基突變較多，第728個堿基及第738個堿基、第776個堿基分別由G顛換為C、T顛換為G以及A轉(zhuǎn)換為G，這也說明菌株HZ1為菌株JL01誘變產(chǎn)生。

圖4 誘變菌株HZ1與原菌株JL01部分堿基序列比對Fig.4 Partial base sequence alignment between mutant strain HZ1 and original strain JL01

2.4 活性成分分析

紫外輻射處理對樺褐孔菌粗多糖含量的影響試驗結(jié)果見圖5。

如圖5所示，紫外輻射處理后的菌株菌絲體粗多糖含量發(fā)生明顯變化，與原菌株及其菌核HE粗多糖含量相比均存在顯著性差異（P＜0.05）。誘變菌株HZ1菌絲體粗多糖含量遠(yuǎn)超過原菌株JL01，是原菌株含量的1.9倍，達(dá)到24.802 mg·g-1，而原菌株的粗多糖含量為12.818 mg·g-1；誘變菌株菌絲體多糖含量是原菌株菌核HE含量的1倍。原菌株JL01較其菌核HE的粗多糖含量差異并不顯著，原菌株菌核HE的含量相對有所減少，為11.761 mg·g-1。

圖5 樺褐孔菌誘變菌株、原菌株及菌核多糖含量Fig.5 The content of polysaccharide in mutant strain,original strain and sclerotia of Inonotus obliquus

紫外輻射處理對三萜含量的影響試驗結(jié)果見圖6。

如圖6所示，通過對三萜含量測定分析發(fā)現(xiàn)，原菌株JL01三萜含量為6.309 mg·g-1，誘變菌株HZ1含量為5.630 mg·g-1，原菌株菌核HE含量為4.225 mg·g-1；誘變菌株HZ1的三萜含量略有降低，比原菌株減少0.679 mg·g-1，兩者間存在顯著性差異（P＜0.05）；但三萜含量高于原菌株菌核HE，原菌株JL01較其菌核HE的三萜含量高2.084 mg·g-1，存在顯著性差異。

圖6 樺褐孔菌誘變菌株、原菌株及菌核三萜含量Fig.6 The content of triterpenoids in mutant strain,original strain and sclerotia of Inonotus obliquus

紫外輻射處理對總多酚含量影響結(jié)果見圖7。

如圖7所示，通過對總多酚含量的測定分析發(fā)現(xiàn)，原菌株JL01的總多酚含量為14.271 mg·g-1，誘變菌株HZ1及原菌株菌核HE總多酚含量分別為17.001 mg·g-1、38.33 mg·g-1；誘變菌株 HZ1 總多酚含量高于原菌株JL01，存在顯著性差異（P＜0.05），相較于原菌株JL01總多酚含量增幅為16.06%，較原菌株菌核HE低21.329 mg·g-1。

圖7 樺褐孔菌誘變菌株、原菌株及菌核總多酚含量Fig.7 The content of polyphenols in mutant strain,original strain and sclerotia of Inonotus obliquus

紫外輻射處理對黃酮含量的影響試驗結(jié)果見圖8。

圖8 樺褐孔菌誘變菌株、原菌株及菌核黃酮含量Fig.8 The content of flavonoids in mutant strain,original strain and sclerotia of Inonotus obliquus

如圖8所示，通過對黃酮含量的測定分析發(fā)現(xiàn)，誘變菌株HZ1與原菌株JL01相比差異并不顯著（P＜0.05），二者分別為 4.594 mg·g-1及 5.535 mg·g-1，但原菌株菌核HE與誘變菌株HZ1及原菌株JL01相比存在顯著性差異，誘變菌株HZ1黃酮含量比原菌株菌核HE含量低70.337 mg·g-1。

紫外輻射處理對活性成分含量分布的影響試驗結(jié)果見圖9。

圖9 樺褐孔菌誘變菌株、原菌株的活性含量分布Fig.9 Distribution of activity ingredient content in mutant strain and original strain of Inonotus obliquus

如圖9所示，原菌株中總多酚含量為測定的活性成分中含量最高，其次為多糖，二者含量相差并不大；而誘變菌株中多糖含量明顯升高，為測定活性成分中最高，總多酚含量次之，二者含量相差明顯，分別為 24.802 mg·g-1和 17.001 mg·g-1，而黃酮及總多酚含量較低，經(jīng)紫外誘變后兩者含量沒有明顯變化，較原菌株含量有下降趨勢。

2個菌株各活性成分含量的相關(guān)性分析見表4和表5。

如表4、表5所示，通過比對原菌株及誘變菌株活性成分含量相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，原菌株中多糖含量與黃酮、總多酚含量呈正相關(guān)性（r1=0.491、r2=0.160），表明多糖含量的變化對黃酮含量影響不顯著，黃酮含量及總多酚含量會隨著多糖含量的增加而增加；多糖的含量與三萜的含量呈負(fù)相關(guān)性（r3=-0.011），表明隨著總多糖含量的增加，三萜含量略微減少；黃酮含量與三萜含量、總多酚含量相比呈正相關(guān)性（r4=0.866、r5=0.939），三萜含量與總多酚含量同樣也呈正相關(guān)性（r6=0.985）。誘變菌株中多糖含量與黃酮、總多酚含量呈負(fù)相關(guān)性（r7=-0.945、r8=-0.756），總多糖含量與三萜含量呈正相關(guān)性（r9=0.786）；三萜含量與黃酮、總多酚含量呈負(fù)相關(guān)性（r10=-0.945、r11=-0.189），總多酚含量與黃酮呈正相關(guān)性（r12=0.500）。

表4 原菌株JL01菌絲體活性成分含量相關(guān)性Tab.4 Correlation analysis on the content of active ingredient in the original strain JL01 mycelia

表5 誘變菌株HZ1菌絲體活性成分相關(guān)性Tab.5 Correlation analysis on the content of active ingredient in the mutant HZ1 mycelia

3 結(jié)論與討論

在實際生產(chǎn)中，雖然大型真菌會發(fā)生自發(fā)性突變，但變異程度較低，同時幾率較小，而通過誘變育種成功幾率大幅提升。誘變育種主要是利用物理或化學(xué)誘變試劑誘導(dǎo)動植物體發(fā)生遺傳特性變異，其中紫外線誘變育種技術(shù)是微生物育種中較為經(jīng)典、便捷、廣泛、效果優(yōu)良、對人體健康危害較小的育種技術(shù)。通過在前期工作基礎(chǔ)之上[14]，對樺褐孔菌活性成分進(jìn)行了研究。樺褐孔菌紫外誘變菌株HZ1在性狀上與JL01較為接近，通過拮抗試驗及ITS序列分析比對進(jìn)一步驗證了誘變菌株HZ1源于原菌株JL01的事實。經(jīng)紫外誘變后菌株HZ1菌絲體生長速率有明顯加快，菌絲干重較原菌株增加0.058 g，同時其多糖含量顯著提升2.48%，甚至高于原菌株菌核HE含量；多酚含量也明顯高于原菌株；同時其三萜及黃酮含量相較于原菌株差異并不大，這也說明誘變菌株HZ1具有產(chǎn)量高、品質(zhì)優(yōu)良等特點，具有較好的開發(fā)及利用價值，為樺褐孔菌資源的研發(fā)提供新途徑。

盡管如此，本試驗仍存在一定局限，在栽培誘變菌株過程中發(fā)現(xiàn)，其菌核出現(xiàn)量極少，這可能是由于其突變后菌株不適宜原栽培料等原因所致。同時對比2個菌株的活性成分含量相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，原株中多酚含量與黃酮含量呈正相關(guān)性，在誘變菌株中多酚與黃酮含量仍保持正相關(guān)性，但其他含量之間相關(guān)性由在原株中呈現(xiàn)正相關(guān)性轉(zhuǎn)為負(fù)相關(guān)性（負(fù)相關(guān)性轉(zhuǎn)為正相關(guān)性），這或許是由于經(jīng)紫外線照射后部分堿基位點發(fā)生突變，導(dǎo)致其代謝途徑發(fā)生改變，從而導(dǎo)致活性成分含量的變化，其中的具體機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。